基于分子標(biāo)記技術(shù)玉米抗粗縮病種質(zhì)資源的篩選與應(yīng)用

王江浩，王立偉，張動(dòng)敏，郭瑞，張全國(guó)，李興華，魏劍鋒，宋煒，王寶強(qiáng)，李榮改

基于分子標(biāo)記技術(shù)玉米抗粗縮病種質(zhì)資源的篩選與應(yīng)用

王江浩，王立偉，張動(dòng)敏，郭瑞，張全國(guó)，李興華，魏劍鋒，宋煒，王寶強(qiáng)，李榮改

河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050035

【目的】利用與3個(gè)玉米抗粗縮病位點(diǎn)、和緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選高抗玉米粗縮病自交系，并進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類群分類和配合力分析，為玉米抗粗縮病品種的快速高效選育提供依據(jù)和方法?！痉椒ā繉⒖共∽越幌礙36與感病自交系S221雜交，從F2開(kāi)始，采用單粒傳的方法構(gòu)建一個(gè)包括263個(gè)F9家系的重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體；在不同種植環(huán)境下，對(duì)RILs進(jìn)行抗病性鑒定，同時(shí)，采用與3個(gè)抗病位點(diǎn)、和緊密連鎖的分子標(biāo)記5FR、6W53和IDP25K進(jìn)行基因型分型，篩選出抗病且農(nóng)藝性狀優(yōu)良家系；利用Maize56K SNP芯片對(duì)包括優(yōu)良家系在內(nèi)的24份玉米自交系進(jìn)行基因型分型，根據(jù)Roger’s算法計(jì)算優(yōu)良家系與其他骨干自交系之間的遺傳距離，并在構(gòu)建聚類圖的基礎(chǔ)上進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類群劃分；同時(shí)利用優(yōu)良家系與不同類群的自交系測(cè)交配制雜交組合，在田間進(jìn)行配合力測(cè)定和抗病性鑒定，篩選出抗病且雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)的組合?！窘Y(jié)果】自交系K36在、和等3個(gè)抗性位點(diǎn)處均為抗病性純合基因型，自交系S221均為感病性純合基因型。RILs群體的263個(gè)家系在粗縮病抗性遺傳組成上分為21種基因型，3個(gè)位點(diǎn)均為抗性純合基因型家系的病情指數(shù)（DSI）最?。?.281），均為感病性純合基因型家系的DSI最大（0.776），這與抗、感性親本的DSI表現(xiàn)一致（0.257和0.623）；2個(gè)位點(diǎn)為感病性純合基因型時(shí)，1個(gè)位點(diǎn)為抗病性純合基因型的DSI由小到大的位點(diǎn)是（0.396）、（0.478）和（0.654），結(jié)果表明，抗病性最強(qiáng)，次之，最弱。篩選出的3個(gè)抗性位點(diǎn)純合基因型家系JR2136與其他23份自交系的遺傳距離變化范圍為0.2234—0.2895，平均值為0.2612，與之遺傳距離最小的自交系是C413，最大的是Chang7-2。根據(jù)聚類分析結(jié)果，將JR2136劃分在瑞德群，與屬于黃改群的自交系H92和H521配制出抗病強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)組合，分別比鄭單958增產(chǎn)7.01%和7.80%，表明JR2136與屬于黃改群的自交系之間具有良好的配合力?！窘Y(jié)論】玉米自交系K36對(duì)粗縮病的抗性由、和等3個(gè)基因控制、呈數(shù)量遺傳特征且具有基因累加效應(yīng)，具有3個(gè)抗性純合基因型的玉米品種抗病性最強(qiáng)。開(kāi)發(fā)的與3個(gè)位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記在抗病品種選育和抗性種質(zhì)資源篩選上具有實(shí)用價(jià)值，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇和基因聚合的方法選育抗病性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)組合應(yīng)用于生產(chǎn)切實(shí)可行。

玉米粗縮?。豢共』?；分子標(biāo)記輔助選擇；優(yōu)勢(shì)類群劃分；配合力

0 引言

【研究意義】玉米粗縮?。╩aize rough dwarf disease，MRDD）是一種由灰飛虱（）傳播的世界性病毒病，1949年，在意大利首次發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致MRDD的病毒有4種，均屬于呼腸孤病毒家族中的斐濟(jì)病毒屬（，）[1]。病毒種類因地區(qū)不同而異，在中國(guó)流行的主要是水稻黑條矮縮病毒（rice black streaked dwarf virus，RBSDV）[2-3]，近年來(lái)，在長(zhǎng)江流域及山東濟(jì)寧地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了感南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）的玉米粗縮病株[4-5]。病毒由灰飛虱傳播，小麥、玉米、水稻及禾本科的雜草是灰飛虱的寄主植物，因此，由于灰飛虱在中國(guó)黃淮海地區(qū)小麥?zhǔn)斋@前后遷飛，導(dǎo)致此時(shí)期播種的玉米粗縮病發(fā)生尤為嚴(yán)重，一般造成30%以上的產(chǎn)量損失，發(fā)病嚴(yán)重的地塊甚至絕收，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[6-8]。近年來(lái)，MRDD有向北蔓延的趨勢(shì)，對(duì)中國(guó)東北玉米的生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅[9-10]。因此，篩選抗病種質(zhì)、挖掘抗病基因及選育抗病品種對(duì)防治粗縮病的發(fā)生尤顯重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外加大了對(duì)玉米抗粗縮病的遺傳研究，盡管未發(fā)現(xiàn)免疫的材料，但也篩選出少量的抗性種質(zhì)，如X178、Qi319、黃早四等自交系，它們分別屬于衍生自美國(guó)雜交種P78599的PB亞群和國(guó)內(nèi)唐四平頭亞群[11-13]。遺傳分析表明，玉米對(duì)粗縮病的抗性多呈數(shù)量性狀特征，且包含主效基因[8, 14-17]。利用連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)抗性基因（位點(diǎn)）進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)在玉米的每條染色體上均有與粗縮病抗性相關(guān)的位點(diǎn)，遺傳背景不同的材料具有不同的抗性位點(diǎn)[18]。目前，中國(guó)應(yīng)用的抗源主要來(lái)自美國(guó)雜交種P78599，其抗病性由位于玉米第2和第8染色體上的2個(gè)抗性主效位點(diǎn)和控制，呈部分顯性遺傳，而呈隱性遺傳，并已開(kāi)發(fā)出緊密連鎖的分子標(biāo)記[14, 19-22]。【本研究切入點(diǎn)】鑒于目前中國(guó)生產(chǎn)上應(yīng)用的抗源單一且遺傳效應(yīng)低，不能滿足玉米抗粗縮病育種與生產(chǎn)的需求。因此，發(fā)掘新的抗性種質(zhì)、利用新的抗性基因成為玉米抗粗縮病育種的重要任務(wù)。前期通過(guò)對(duì)不同遺傳背景的種質(zhì)資源進(jìn)行多年抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高抗玉米粗縮病的自交系K36，在第6染色體bin6.02區(qū)域存在一個(gè)抗性位點(diǎn)，命名為，其抗性遺傳與和不同，呈顯性遺傳模式[23]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用與3個(gè)抗性位點(diǎn)、和緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)K36衍生的重組自交系群體（recombinant inbred lines，RILs）的遺傳組成進(jìn)行分析，并對(duì)篩選出的抗性優(yōu)良家系進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類群分類和配合力分析，為后期抗性基因分離和分子標(biāo)記應(yīng)用于抗病育種的輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 重組自交系 2014年利用多年抗性鑒定篩選出的高抗玉米粗縮病自交系K36為父本，與高感玉米粗縮病的自交系S221雜交獲得F1代。結(jié)合南繁加代，從F2代開(kāi)始采用單粒傳的方法構(gòu)建了一個(gè)包括263個(gè)F9家系的重組自交系群體（RILs）。

1.1.2 24份玉米自交系的類群劃分 選取包括本單位20份已知系譜來(lái)源的骨干自交系和4份從RILs篩選出的攜帶的抗病家系共24份材料進(jìn)行類群劃分（電子附表1）。

1.2 玉米粗縮病抗性的鑒定

2019年5月，將抗病親本K36、感病親本S221及其衍生的RILs，分別種植于山東濟(jì)寧、河南原陽(yáng)和河北藁城3個(gè)粗縮病高發(fā)試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行田間抗病性鑒定。試驗(yàn)點(diǎn)鄰近地塊均為小麥田，玉米出苗后恰逢灰飛虱遷飛高峰期。玉米苗期不使用任何殺蟲(chóng)劑，水肥按常規(guī)管理措施進(jìn)行。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3次重復(fù)，每份材料單行區(qū)種植，行長(zhǎng)5 m，行距0.6 m，每行播種18穴，雙粒點(diǎn)播，出苗后每穴定苗留1株。此外，在河北藁城試驗(yàn)點(diǎn)增設(shè)一個(gè)6月下旬播種的重復(fù)試驗(yàn)，以鑒別植株在非感病狀態(tài)的表型。在灌漿期調(diào)查每份材料的發(fā)病情況，按單株詳細(xì)記錄。參照苗洪芹等[24]提出的0—4級(jí)抗性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情嚴(yán)重程度調(diào)查。在分級(jí)調(diào)查的基礎(chǔ)上，計(jì)算每份材料的病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)將抗病性劃分為免疫、高抗（high resistance，HR）、抗（resistance，R）、感（susceptibility，S）和高感（high susceptibility，HS）5級(jí)。病情指數(shù)（disease severity index，DSI）=∑（發(fā)病級(jí)值×各級(jí)病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高發(fā)病級(jí)值）。

1.3 DNA的提取

在玉米苗期，采用改良的CTAB法提取植株幼葉基因組DNA，去除RNA。利用瓊脂糖電泳和NanoDrop 2000型分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。DNA樣品在瓊脂糖電泳中顯示條帶單一、完整無(wú)降解，分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品A260/280介于1.8—2.0、A260/230介于1.8—2.0，無(wú)蛋白、RNA污染及鹽離子濃度低，提取的DNA樣品質(zhì)量滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增要求，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分子標(biāo)記檢測(cè)

SSR標(biāo)記檢測(cè)：利用與連鎖及和的功能性SSR標(biāo)記引物（電子附表2），對(duì)RILs群體進(jìn)行基因型分型并篩選抗病家系。IDP25K和GMS分別由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)徐明良教授團(tuán)隊(duì)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所李新海教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的位點(diǎn)功能基因特異性引物[19-20, 25]；IDP25K在B73（感?。?、X178（抗病）品種的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為360和290 bp，并且已在玉米育種中用于分子標(biāo)記輔助選擇[25]。5FR引物是由李新海教授團(tuán)隊(duì)友情提供，與緊密連鎖標(biāo)記的引物，D829-0和D1347是山東農(nóng)業(yè)大學(xué)劉保申教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)利用，與連鎖標(biāo)記的引物[21]；利用K36、S221測(cè)序深度30×的重測(cè)序（北京百邁客生物科技有限公司）結(jié)果，與B73的參考基因組序列比對(duì)，采用SSRHunter軟件在定位區(qū)間開(kāi)發(fā)在K36、S221兩者之間具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，并根據(jù)定位區(qū)間連鎖遺傳圖譜（QTL IciMapping version 3.2）確定與抗性位點(diǎn)緊密連鎖的SSR標(biāo)記，利用（https://primer3.ut.ee/）軟件設(shè)計(jì)引物，并在MaizeGDB（https://maizegdb.org/）網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，選擇單拷貝的SSR引物。6W53和6W19-95是精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)連鎖標(biāo)記的引物，其中，6W53為緊密連鎖標(biāo)記的引物。在PCR擴(kuò)增時(shí)，將DNA樣品濃度統(tǒng)一用ddH2O稀釋至30 ng·μL-1，在EasyCycler擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。以50或100 bp DNA片段為分子量標(biāo)準(zhǔn)，PCR產(chǎn)物用1.5%—2.0%瓊脂糖凝膠法或10%變性聚丙烯酰胺凝膠分離并用銀染法顯示產(chǎn)物條帶，拍照讀帶型。

SNP標(biāo)記檢測(cè)：利用中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司開(kāi)發(fā)的Maize56K SNP芯片對(duì)24份自交系進(jìn)行SNP基因分型用于后續(xù)類群劃分。該芯片是針對(duì)國(guó)內(nèi)玉米育種而研發(fā)的芯片，基于玉米B73 RefGen_v4版本基因組設(shè)計(jì)，所有標(biāo)記有物理位置信息，包含56 000個(gè)SNP位點(diǎn)，均勻覆蓋了玉米全基因組。樣品核酸準(zhǔn)備、核酸擴(kuò)增在Backman自動(dòng)工作站上完成；核酸標(biāo)記與芯片雜交、洗滌、掃描等步驟在GeneTitan上完成。最后，利用Affymetrix (Thermo Fisher) AxiomAnalysisSuite軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 雜交組合配制與鑒定

利用與、和緊密連鎖的標(biāo)記，從RILs群體篩選出含有3個(gè)抗性位點(diǎn)的家系，于2020年冬季種植在海南三亞南繁基地，與不同類群的優(yōu)良自交系測(cè)交配制雜交組合。2021年5月，在石家莊藁城試驗(yàn)站進(jìn)行田間鑒定并篩選出抗粗縮病的優(yōu)勢(shì)組合，并在2022年參加小區(qū)對(duì)比試驗(yàn)，小區(qū)為6行區(qū)，行長(zhǎng)5 m，行距0.6 m，每行20株，對(duì)照品種為鄭單958，成熟后取中間2行考種測(cè)產(chǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用軟件Bio-R計(jì)算24份玉米自交系兩兩之間的MRD（modified Roger’s distance）遺傳距離，利用MEGA11軟件構(gòu)建UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類圖，進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分；采用Excel 2010軟件和SPSS 25.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 RILs群體的粗縮病抗性鑒定

參照抗性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)雙親及RILs群體在3個(gè)不同環(huán)境下的自然發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查分析。因在河南原陽(yáng)試點(diǎn)田間自然發(fā)病率極低，高感病親本S221未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，因此，未對(duì)此試點(diǎn)進(jìn)一步分析。263個(gè)RILs家系的平均病情指數(shù)結(jié)果顯示，河北藁城有235個(gè)家系對(duì)玉米粗縮病具有一定抗性，其中43個(gè)家系表現(xiàn)高抗，占比為16.3%；28個(gè)家系表現(xiàn)感病，其中僅2個(gè)家系表現(xiàn)高感，占比為0.8%。山東濟(jì)寧有133個(gè)株系表現(xiàn)具有一定抗性，其中28個(gè)家系表現(xiàn)高抗，占比為10.8%；130個(gè)家系表現(xiàn)感病，其中53個(gè)家系表現(xiàn)高感，占比為20.8%（表1）。自然抗病鑒定結(jié)果表明，不同的環(huán)境對(duì)病害的發(fā)生有一定的影響。

通過(guò)對(duì)山東、河北2個(gè)環(huán)境下粗縮病發(fā)病總體情況對(duì)比分析（表1和表2），發(fā)現(xiàn)雙親及RILs群體在2個(gè)試點(diǎn)的發(fā)病趨勢(shì)一致，平均病情指數(shù)均是感病親本S221＞RILs群體＞抗病親本K36，山東濟(jì)寧試點(diǎn)的病情指數(shù)高于河北藁城試點(diǎn)，表明山東濟(jì)寧地區(qū)比河北藁城地區(qū)粗縮病的發(fā)生更嚴(yán)重。

用SPSS 25.0軟件對(duì)2個(gè)環(huán)境下的雙親及RILs群體的病情指數(shù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布（圖1），具有數(shù)量遺傳的特征，表明K36對(duì)粗縮病的抗性由多基因控制。

表1 263個(gè)RILs家系的抗病性鑒定結(jié)果

DSI：病情指數(shù)；HR：高抗；R：抗；S：感；HS：高感。下同

DSI:disease severity index; HR: High resistance; R: Resistantce; S: Susceptibility; HS: High susceptibility. The same as below

表2 2019年度山東、河北玉米粗縮病發(fā)病情況對(duì)比表

圖1 河北、山東2個(gè)環(huán)境下RILs群體的病情指數(shù)分布圖

2.2 雙親基因型檢測(cè)

利用與3個(gè)抗性位點(diǎn)、和緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)S221、K36、JR2136、B73、X178、Ye478和Qi319等7份玉米自交系進(jìn)行基因型分型（圖2）。結(jié)果顯示，在位點(diǎn)，特異性引物IDP25K與引物GMS檢測(cè)的結(jié)果相同，K36、JR2136與抗病對(duì)照品種X178同為抗病性純合基因型，而S221、Ye478和Qi319與感病對(duì)照品種B73同為感病性純合基因型（圖2-A—B）；在位點(diǎn)，引物5FR檢測(cè)到K36、JR2136、X178與抗病對(duì)照Qi319同為抗病性純合基因型，而S221和B73與感病對(duì)照品種Ye478一致，為感病性純合基因型（圖2-C）；在位點(diǎn)，引物6W53和6W19-95標(biāo)記檢測(cè)到JR2136和X178與抗病對(duì)照K36一致，都是抗病性純合基因型，而B(niǎo)73、Qi319和Ye478與感病對(duì)照S221同為感病性純合基因型（圖2-D—E）。以上結(jié)果表明，在3個(gè)位點(diǎn)上，K36為抗病性純合基因型，而S221為感病性純合基因型。

A：IDP25K；B：MGS；C：5FR；D：6W53；E：6W19-95；1—8：100 bp DNA marker、S221、K36、JR2136、B73、X178、Ye478、Qi319。F：IDP25K；G：5FR；H：6W53；1—39：50 bp DNA marker、C1—C36、S221、K36

2.3 RILs群體基因型與抗病性分析

進(jìn)一步利用與3個(gè)抗性位點(diǎn)緊密連鎖或功能性分子標(biāo)記，對(duì)RILs群體的263個(gè)家系進(jìn)行基因型分型，并進(jìn)行田間抗病性鑒定（圖2-F—H，表3）。結(jié)果顯示，抗病親本K36和感病親本S221的DSI分別為0.257和0.623。RILs群體含有21種基因型，家系的基因型不同，其DSI也不同。

在RILs群體中，3個(gè)位點(diǎn)均為抗病性純合基因型家系的DSI（0.281）小于3個(gè)位點(diǎn)均為感病性純合基因型家系的DSI（0.776），這與抗、感性親本的DSI表現(xiàn)一致（0.257和0.623）。在2個(gè)位點(diǎn)為抗病性純合基因型、一個(gè)位點(diǎn)為感病性純合基因型情況下，位點(diǎn)為感病性純合型的DSI（0.454）小于位點(diǎn)為感病性純合型的DSI（0.622），表明當(dāng)位點(diǎn)為感病基因型時(shí)，粗縮病的嚴(yán)重程度大于位點(diǎn)為感病基因型的品種。

2個(gè)位點(diǎn)為感病性純合基因型時(shí)，一個(gè)位點(diǎn)為抗病性純合基因型的DSI由小到大的位點(diǎn)是（0.396）、（0.478）、（0.654），結(jié)果表明，在抗病性上位點(diǎn)最強(qiáng)，次之，最弱；另外，在2個(gè)位點(diǎn)為感病性純合基因型時(shí)，第三個(gè)位點(diǎn)為抗病性純合基因型與雜合基因型家系的DSI比較結(jié)果顯示，位點(diǎn)抗病性純合型家系（0.478）明顯小于雜合型家系（0.799），位點(diǎn)抗病性純合型家系（0.396）略小于雜合型家系（0.475），而位點(diǎn)抗病性純合型家系（0.654）與雜合型家系（0.625）差異甚小。結(jié)果表明，位點(diǎn)呈隱性遺傳，雜合狀態(tài)下表現(xiàn)感?。?、位點(diǎn)呈顯性遺傳，并且位點(diǎn)的抗病性強(qiáng)于位點(diǎn)。

2.4 24份玉米自交系聚類分析

根據(jù)RILs群體263個(gè)家系的基因型分型和抗病性鑒定結(jié)果，篩選出一個(gè)3個(gè)位點(diǎn)均為抗性純合基因型且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的家系JR2136。利用包括JR2136在內(nèi)的24份玉米自交系兩兩之間的遺傳距離構(gòu)建了UPGMA聚類圖（圖3）。24份自交系間遺傳距離的變化范圍為0.0958—0.3012，平均值為0.2463，遺傳距離最小的2個(gè)自交系是Ji603和Zheng58，遺傳距離最大的2個(gè)自交系是Chang7-2和PBA3。JR2136與其他23份自交系的遺傳距離變化范圍為0.2234— 0.2895，平均值為0.2612，與之遺傳距離最小的自交系是C413，而最大的自交系是Chang7-2。

R：抗病純合型；S：感病純合型；H：雜合型

R: disease resistant homozygote; S: disease susceptible homozygote; H: heterozygote

圖3 24份玉米自交系基于Roger’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖

根據(jù)自交系間遺傳距離和已知一些自交系所屬的類群，將24份玉米自交系劃分為5個(gè)類群。第Ⅰ類群由PHRKB、SW3-2和PH4CV組成，三者為先鋒公司的骨干自交系或其改良系，是中國(guó)東北地區(qū)利用的重要玉米種質(zhì)，可以歸為先鋒公司的NSS群。第Ⅱ類群包括K36、C24-6、C413、S221、C1-12和Qi319共6個(gè)自交系，K36和Qi319是分別從美國(guó)雜交種分離出來(lái)的自交系，C24-6、C413和C1-12是從K36與S221雜交選系而來(lái)（電子附表1），S221是冀15-22的變異家系，而冀15-22是本單位利用從美國(guó)商業(yè)雜交種分離出的自交系8112、掖107雜交選育出的優(yōu)良自交系。這個(gè)類群具有P78599、87001等美國(guó)雜交種的血緣，可以歸為P種群。第Ⅲ類群包括JR2136、Ji42、JH29-1、WL134、PBA3和PH6WC共6個(gè)自交系，其中Ji42、JH29-1、WL134和PBA3是從美國(guó)先鋒雜交種中選出的母本自交系，其遺傳組成偏向瑞德血緣，可以歸為先鋒公司的SS群或瑞德群。JR2136是從K36與S221雜交選系而來(lái)，但與具有瑞德血緣的自交系聚在同一群，間接證實(shí)S221是冀15-22開(kāi)放授粉接受了具有瑞德血緣材料的花粉而產(chǎn)生的后代。第Ⅳ類群由Ji603、Zheng58、Z503和Ye478組成，Zheng58是Ye478的變異株，而Ji603、Z503是本單位從以Zheng58為母本的雜交種鄭單958構(gòu)建的母本選系群中選育的自交系，因此，四者之間血緣關(guān)系比較近，被劃分在同一類群，可稱為改良瑞德群。第Ⅴ類群包括Chang7-2、Ji1877、Ji2888、Ji2894和H521共5個(gè)自交系，除Chang7-2以外的4份材料是從以Chang7-2為父本的雜交種鄭單958構(gòu)建的父本選系群中選育的自交系，且血緣關(guān)系更傾向Chang7-2，可稱為黃改群或唐四平頭群。從第Ⅳ、Ⅴ兩類群包含的自交系可知，它們是以雜交種鄭單958為基礎(chǔ)選系材料，按系譜法分離選育出的一系列Zheng58或Chang7-2改良系。

2.5 3個(gè)抗性位點(diǎn)純合基因型家系JR2136的利用

利用JR2136與不同類群的優(yōu)良自交系廣泛測(cè)配，通過(guò)2年的田間測(cè)試，篩選出2個(gè)高抗粗縮病的優(yōu)勢(shì)組合JR2136×H92和JR2136×H521。自交系H92是由Chang7-2與自交系9801雜交2次后再與WK798-2（偉科702父本）雜交而獲得的改良系，與H521同屬于黃改群（電子附表1和圖3），表明JR2136所在的瑞德群（SS）與黃改群的自交系之間有很好的配合力。在河北石家莊地區(qū)夏播種植，種植密度為67 500株/hm2時(shí)，這兩個(gè)組合和鄭單958的生育期為106—107 d，株高2.92—2.95 m，穗位1.28—1.31 m；植株均表現(xiàn)半緊湊型，葉色濃綠，葉片寬大上舉，穗上部葉片葉尖下披，在農(nóng)藝性狀上差異不顯著；但2個(gè)組合的產(chǎn)量性狀優(yōu)于對(duì)照鄭單958，表現(xiàn)在果穗長(zhǎng)5 cm左右，行粒數(shù)多8—10粒，畝產(chǎn)分別比對(duì)照增產(chǎn)7.01%和7.80%（表4）。2022年，在山東濟(jì)寧粗縮病鑒定圃種植進(jìn)行抗病鑒定，這兩個(gè)組合均表現(xiàn)高抗粗縮病、無(wú)病株出現(xiàn)，而對(duì)照鄭單958表現(xiàn)感粗縮病、病株率為15%。

3 討論

3.1 玉米粗縮病的鑒定

對(duì)山東濟(jì)寧、河北藁城2個(gè)環(huán)境下RILs群體的病情指數(shù)對(duì)比分析得知，不同環(huán)境對(duì)病害的發(fā)生有一定的影響。山東濟(jì)寧地區(qū)每年5月中旬種植玉米，苗期正值小麥?zhǔn)斋@期，同時(shí)受氣流影響，5月末到6月初大量灰飛虱遷入，加之當(dāng)?shù)卦蕉x(chóng)量較大，粗縮病發(fā)病較為充分。在缺少室內(nèi)接種抗病鑒定的條件下，在山東濟(jì)寧對(duì)抗病遺傳材料和新品系進(jìn)行田間自然鑒定結(jié)果更可靠。

表4 雜交組合重要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀比較對(duì)照表

3.2 K36的遺傳組成和利用前景

利用與、和位點(diǎn)緊密連鎖或功能性分子標(biāo)記，對(duì)K36衍生的RILs群體的抗病性遺傳組成的分析表明K36的抗性由多基因控制、且具有基因累加效應(yīng)。3個(gè)位點(diǎn)之間，位點(diǎn)抗病性最強(qiáng)，位點(diǎn)次之，位點(diǎn)最弱，并且在抗性上呈顯性、為不完全顯性而為隱性，這與前人的研究結(jié)果一致[14, 22-23]，顯示在育種中利用價(jià)值更突出。最近已被克隆，是一個(gè)編碼囊泡運(yùn)輸關(guān)鍵Rab GDP解離抑制因子基因[20]。研究發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染玉米后，病毒的P7-1蛋白與ZmGDI外顯子10和C端區(qū)域緊密結(jié)合以招募病毒。利用玉米ZmGDI的囊泡運(yùn)輸功能幫助P7-1蛋白在胞內(nèi)移動(dòng)，從而有利于病毒的復(fù)制和通過(guò)胞間連絲通道在細(xì)胞間移動(dòng)，導(dǎo)致玉米植株感病。通過(guò)基因編輯對(duì)ZmGDI敲除，顯著提高了對(duì)玉米粗縮病的抗性，為培育抗粗縮病玉米品種提供了新的途徑[26]。也已被精細(xì)定位并對(duì)其候選基因的功能正進(jìn)行解析[21-22]。利用以K36為抗性供體和S221為受體構(gòu)建的染色體片段代換系群體，對(duì)的精細(xì)定位也取得了很好進(jìn)展，這對(duì)該基因的分離、功能分析和育種應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

自交系K36不僅高抗粗縮病，而且對(duì)玉米蚜、玉米螟等害蟲(chóng)也具有良好的抗性[27]。利用K36衍生的RILs群體遺傳組成比較豐富，為今后解析抗病的遺傳關(guān)系，以及通過(guò)基因聚合改良優(yōu)良自交系的抗病性提供了優(yōu)異的遺傳材料。目前，中國(guó)玉米生產(chǎn)上應(yīng)用的粗縮病抗源主要來(lái)自美國(guó)雜交種P78599，抗源單一且抗性強(qiáng)度不高，制約了中國(guó)的玉米抗粗縮病育種與生產(chǎn)。利用與3個(gè)抗性位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選具有抗性等位變異的優(yōu)異材料，豐富玉米抗粗縮病種質(zhì)資源，有望改善中國(guó)玉米抗性遺傳來(lái)源單一的狀況，減弱粗縮病潛在的威脅。

3.3 抗玉米粗縮病新系JR2136在育種中的應(yīng)用

根據(jù)遺傳進(jìn)化分類分析指導(dǎo)玉米新自交系的雜交配組，可以增加測(cè)配的目的性，提高自交系的利用效率。從遺傳進(jìn)化分類樹(shù)分析結(jié)果可以看出，選育的3個(gè)抗性位點(diǎn)純合新系JR2136遺傳組成偏向瑞德血緣，與屬于黃改群的自交系H92、H521組配出了高抗粗縮病的優(yōu)勢(shì)組合，表明JR2136與黃改群的自交系之間具有較強(qiáng)的配合力，并且JR2136與劃分在黃改群的其他5個(gè)自交系間遺傳距離值（0.2728—0.2895）比與其他類群的數(shù)值大（0.2234—0.2795），但本研究所用自交系之間遺傳距離值與前人研究的自交系間的值相比偏低[28]，親緣關(guān)系較近和遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此，今后加強(qiáng)JR2136與黃改群自交系廣泛配組篩選更強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合。

近年來(lái)，利用新育成的美國(guó)玉米雜交種和國(guó)內(nèi)玉米雜交種鄭單958為基礎(chǔ)選系材料，創(chuàng)建了“新外雜選×國(guó)內(nèi)雜選”的新雜優(yōu)模式[29]。本研究選育的2個(gè)優(yōu)勢(shì)組合JR2136×H92、JR2136×H521和本單位自主選育的2個(gè)國(guó)審品種冀玉3421（WL34×H521）和冀玉228（Ji42×Ji1877）均屬于此模式，將國(guó)外優(yōu)異新種質(zhì)的“多抗高產(chǎn)”與國(guó)內(nèi)黃改群種質(zhì)的“廣適穩(wěn)產(chǎn)”相結(jié)合，拓寬了遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究選育的JR2136既遺傳了K36的抗粗縮病有利基因，又保留了S221的高配合力和優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，利用其組配的雜交組合JR2136×H92表現(xiàn)抗病力強(qiáng)、雜種優(yōu)勢(shì)明顯，期望在生產(chǎn)上發(fā)揮出較大的抗病和增產(chǎn)效應(yīng)。

4 結(jié)論

源自玉米自交系K36的粗縮病抗性由多基因控制、呈數(shù)量遺傳特征且具有基因累加效應(yīng)。具有、和等3個(gè)抗性純合基因型的玉米品種抗病性最強(qiáng)。開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記在抗病品種選育和新抗性種質(zhì)資源篩選上具有實(shí)用價(jià)值，利用分子標(biāo)記輔助選擇和基因聚合的方法選育抗病性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)組合應(yīng)用于生產(chǎn)切實(shí)可行。

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Molecular marker assisted identification and application of maize germplasms for maize rough dwarf disease resistance

WANG JiangHao, WANG LiWei, ZHANG DongMin, GUO Rui, ZHANG QuanGuo, LI XingHua, WEI JianFeng, SONG Wei, Wang BaoQiang, LI RongGai

Institute of Cereal and Oil Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Hebei Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Shijiazhuang 050035

【Objective】Molecular markers tightly linked to three maize rough dwarf disease (MRDD) resistant loci were employed to identify resistant inbred lines, then the classification of heterotic groups and analysis of combining ability of these inbred lines were carried out, which proved a highly efficient way for maize MRDD resistance breeding.【Method】A recombinant inbred lines (RILs) population consisting of 263 F9lines was developed through single seed descent method from a segregating F2population by crossing a resistant inbred line K36 to a susceptible inbred line S221. The MRDD resistances of the RILs were identified in different growing environments. Meanwhile the RILs were genotyped by employing three pairs of molecular markers, 5FR, 6W53 and IDP25K which were closely linked to the three resistant loci,,and. The excellent lines with disease resistance and good agronomic traits were selected out after field evaluation. Totally 24 maize inbred lines including the elite lines were genotyped using Maize 56K SNP array, then the genetic distances between the selected lines and other elite inbred lines were calculated according to Roger's algorithm and cluster analysis was conducted to classify the heterotic groups. Meanwhile, hybrid combinations were generated and the combining abilities were tested to screen the combinations with strong disease resistance and heterosis.【Result】The inbred line K36 were homozygous resistant at the three loci,,andwhile S221 were homozygous susceptible. All the 263 RILs were genotyped into 21 patterns in terms of genetic composition of the three resistant loci. The lowest DSI (0.281) appeared when all the three loci were homozygous resistant while the highest DSI (0.776) appeared when the three loci were homozygous susceptible, which were consistent with the resistant and susceptible parents (0.257, 0.623). The order of DSI from low to high value for one homozygous resistant locus was(0.396),(0.478) and(0.654) when the other two loci were homozygous susceptible, which showed thatandperformed the strongest and the weakest resistance whilewas in the middle. The variation range of genetic distance between JR2136 with the genotype of three homozygous resistant loci and other 23 inbred lines was 0.2234-0.2895, with an average value of 0.2612. The inbred line with the smallest genetic distance was C413, and the largest was Chang7-2. According to the results of cluster analysis, JR2136 was classified into Reid group, hybrid combinations with inbred lines H92 and H521 belonging to Huanggai group performed strong disease resistance and heterosis.【Conclusion】The resistance of K36 to MRDD was controlled by three loci,,and, and it had quantitative genetic characteristics and gene additive effect. Maize varieties with homozygous resistant genotypes demonstrated the strongest disease resistance. The developed molecular markers closely linked with the three resistant loci have proved valuable tools in disease-resistant breeding and screening of resistant germplasm resources. It is feasible to use molecular markers for assisted selection and gene aggregation to select highly heterotic combinations with strong disease resistance.

maize rough dwarf disease; resistance gene; molecular marker-assisted selection (MAS); heterotic grouping; combining ability

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.002

2022-12-17；

2023-02-13

河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（22326317D）、河北省農(nóng)林科學(xué)院創(chuàng)新工程人才專項(xiàng)（C22R0302）、河北省重大專項(xiàng)（21326319D）、國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-02-58）

王江浩，E-mail：wangjianghao@haafs.org。通信作者王寶強(qiáng)，E-mail：wbq662@126.com。通信作者李榮改，E-mail：lironggai@haafs.org

（責(zé)任編輯 李莉）