自然衰老棉花種子的生理變化及ATP合成酶亞基mRNA的完整性

宋詞，谷豐序，邢真真，張峻銘，赫文學，王天波，王雨露，陳軍營

自然衰老棉花種子的生理變化及ATP合成酶亞基mRNA的完整性

宋詞，谷豐序，邢真真，張峻銘，赫文學，王天波，王雨露，陳軍營

河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，鄭州 450046

【目的】種子衰老是一個復雜的生物學過程，以自然衰老的棉花種子為材料，研究種子自然儲藏后的生理生化變化及種胚ATP合成酶亞基mRNA的完整性，為進一步揭示種子衰老機理提供依據(jù)?！痉椒ā恳宰匀粌Υ?年、5年和新收獲的新陸早74號棉花種子為試驗材料(以新收獲的棉種為對照（CK））；分別采用紙間萌發(fā)試驗、低溫恒溫干燥法和TTC染色法測定棉花種子的萌發(fā)率、吸水力和種子生活力；利用酸堿滴定法測定棉花種子的酸價和呼吸速率，采用植物ATP合成酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定種胚ATP合成酶活性，并利用反轉(zhuǎn)錄阻斷-雙引物擴增法分析棉花種胚ATP合成酶、、、和亞基mRNA的完整性?！窘Y(jié)果】自然儲藏會導致種子活力顯著降低。與對照相比，自然儲存3年和5年后，棉種萌發(fā)率由98.7%分別顯著降低至84.0%和58.0%（＜0.05）；種子吸脹初期（4 h內(nèi)）吸水力分別比對照顯著降低了11.0%和26.9%（＜0.05）；TTC染色法檢測結(jié)果顯示種子生活力明顯下降，其中，儲藏5年的種子僅有胚根部位有少量著色，而子葉等器官未被染色；儲藏3年和5年的種子酸價分別較對照顯著升高了28.4%和40.0%，表明種子內(nèi)脂肪類物質(zhì)發(fā)生嚴重水解；吸脹期間種子呼吸速率和ATP合成酶活性表現(xiàn)出增加趨勢（＜0.05），但增幅均顯著下降；其中，吸脹24 h后呼吸速率增幅分別較對照降低了33.3%和49.2%，吸脹12 h后ATP合成酶活性增幅則分別較對照降低了17.9%和73.4%；反轉(zhuǎn)錄阻斷-雙引物擴增法分析結(jié)果顯示，ATP合成酶的亞基、亞基、亞基和亞基mRNA的值均顯著低于對照，而亞基mRNA的值則顯著高于對照（＜0.05），說明這5種亞基的mRNA在自然儲藏過程中出現(xiàn)不同程度的降解。【結(jié)論】延長貯藏時間，將導致棉花種子活力下降；種胚中ATP合成酶亞基mRNA完整性喪失，導致ATP合成酶亞基受損，ATP合成酶活性下降，進而造成ATP合成減少，影響種子萌發(fā)能力。這可能是棉花種子衰老的重要原因之一。

棉花種子；種子衰老；種子活力；ATP合成酶；mRNA完整性

0 引言

【研究意義】種子是農(nóng)業(yè)的“芯片”，其活力高低直接影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。受遺傳特性和環(huán)境因素的共同影響，即使在最佳條件下儲存，種子的衰老也無法避免[1]，這是全球種質(zhì)資源保存共同面臨的重要難題。不同物種的種子由于結(jié)構(gòu)、成分及生理特性不同，其耐藏性也存在差異，如脂質(zhì)、酚類物質(zhì)組成和水平與種子衰老顯著相關(guān)[2]，研究發(fā)現(xiàn)種子衰老進程在油料種子中較為顯著，如棉花種子富含的多不飽和脂肪酸在貯藏過程中極易發(fā)生氧化，導致棉花種子老化劣變[3]，對棉花產(chǎn)量造成重要影響?！厩叭搜芯窟M展】種子的衰老是一個復雜的生物學過程，涉及多種理化反應及其交聯(lián)，表現(xiàn)為發(fā)芽率降低、呼吸強度下降、關(guān)鍵酶類失活、基因表達紊亂等現(xiàn)象[4-6]；通常認為活性氧引起的氧化損傷是造成種子衰老的重要原因[7-9]，過量產(chǎn)生的ROS可與多種生物大分子（如蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、核酸等）作用，造成種子內(nèi)部功能物質(zhì)的損傷（如脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA和RNA損傷甚至斷裂等），并且ROS引起的氧化應激也被證實參與調(diào)控細胞程序性死亡，這些反應可能獨立發(fā)生，也可能互相交聯(lián)，最終導致種子衰老直至死亡[10-14]。呼吸速率是反映種子代謝活動總體水平的一個重要指標，正常情況下，干種子的呼吸速率很低，在吸脹過程中，種子內(nèi)部代謝活動增加，呼吸速率會逐漸升高[15]。而在衰老的種子中，呼吸速率和呼吸酶活性將大幅降低，如甜菜種子隨老化程度的增加，三羧酸循環(huán)途徑中的蘋果酸脫氫酶、糖酵解途徑中的磷酸己糖異構(gòu)酶、磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性均顯著降低[16]。ATP合成酶是呼吸鏈復合體Ⅴ的組成成分，由多個亞基組成，能夠通過合成ATP為細胞供能[17]，是細胞呼吸作用的關(guān)鍵酶，對種子活力具有重要影響。隨著種子老化劣變，ATP合成酶受損或活性降低，種子呼吸代謝能力減弱，可能導致萌發(fā)過程中供能不足，最終種子活力降低甚至喪失發(fā)芽能力[18]。干種子內(nèi)部積累了大量可翻譯的mRNA[19]，在種子萌發(fā)期間，需要利用這些貯藏mRNA作為模板合成萌發(fā)所需的蛋白質(zhì)，這一過程對于種子吸脹萌發(fā)和啟動代謝過程具有重要作用[20]。Sano等[21]發(fā)現(xiàn)水稻種子在萌發(fā)初期，依靠貯藏mRNAs翻譯支持糖酵解的初始能量產(chǎn)生和翻譯機制的激活，并實現(xiàn)丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等相關(guān)酶的生物合成，從而使種子能夠旺盛萌發(fā)，Howell等[22]發(fā)現(xiàn)種子吸脹3h后大多數(shù)代謝相關(guān)的基因上調(diào)表達，擬南芥吸脹后呼吸代謝活性相關(guān)的基因特異性啟動表達，說明mRNA對于維持種子的活力和壽命，調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)等生理活動至關(guān)重要。而RNA的單鏈結(jié)構(gòu)導致其更容易受到氧化損傷[23]，包括堿基和糖基的化學修飾和鏈的斷裂[4, 24-25]，如8-oxo-7,8-二氫鳥嘌呤（8-oxo-G）是一種普遍存在的氧化損傷，當mRNA中存在8-oxo-G時將會干擾解碼，影響翻譯過程[26]。如Fleming等[27]發(fā)現(xiàn)大部分物種的RNA完整性隨干燥種子儲存時間的推移而下降，并且研究發(fā)現(xiàn)受損的RNA通常會被酶解而非修復[23]。若mRNA受損而不能正常發(fā)揮作用，種子的活力也必然將受到影響。如大豆種子在干燥儲藏過程中，種胚內(nèi)RNA前體物質(zhì)與核糖體亞基的18S和25S核糖核酸結(jié)合可能受阻，貯藏mRNA的完整性逐漸降低，且RNA完整性與萌發(fā)潛力呈顯著正相關(guān)[27]?！颈狙芯壳腥朦c】ATP合成酶是種子呼吸代謝的關(guān)鍵酶，對種子活力具有重要影響，前人多圍繞棉花種子衰老的生理變化規(guī)律進行研究，而對其衰老過程中的分子機理，尤其是ATP合成酶亞基mRNA的完整性研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以不同自然衰老的棉花種子為材料，研究其萌發(fā)率、吸水能力、呼吸速率、ATP合成酶活性等變化，并采用反轉(zhuǎn)錄阻斷—雙引物擴增法，研究種胚ATP合成酶亞基mRNA完整性變化情況，以期為揭示棉花種子衰老的分子機理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以棉花品種新陸早74號種子為材料，在實驗室內(nèi)自然存放3年和5年，以2021年收獲的種子為對照（CK），研究工作在河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院省部共建小麥玉米作物國家重點實驗室內(nèi)進行。

1.2 棉花種子活力評價

1.2.1 種子萌發(fā)試驗 取大小均一的種子，置于120 mm口徑的玻璃培養(yǎng)皿中，采用紙間法，在恒溫培養(yǎng)箱中進行試驗。設置溫度為28 ℃[28]，光照為0μmol·m-2·s-1。以胚根突破種皮1—2 mm為種子萌發(fā)完成的標志，每隔2 h觀察并記錄一次萌發(fā)種子數(shù)，直至吸脹48 h結(jié)束，按下列公式計算種子的萌發(fā)率。

萌發(fā)率=（萌發(fā)種子數(shù)/種子總數(shù)）×100%

1.2.2 種子含水量的測定 將種子置于發(fā)芽床上進行吸脹吸水，分別測定種子在吸脹1、2、4、6、12、18和24 h后的含水量，采用切片烘干稱重法，將樣品切成0.5 mm左右的薄片，置于烘箱（103±2）℃烘干（12±1）h[29]，計算種子的含水量，計算公式如下。

種子含水量=（種子吸水后重量-干樣重）/干樣重×100%

1.2.3 種子生活力的測定 采用TTC染色法測定種子生活力，參考尹燕枰等[30]的測定方法，并稍加修改。隨機選取對照和自然儲存3年和5年的棉花種子各10粒，剝?nèi)シN皮，沿種胚中間縱切，將種胚分成均勻2份。35 ℃恒溫，黑暗條件下，用0.1%TTC溶液（pH=7.0磷酸鹽緩沖溶液配制）染色30 min，用AnytyTM3R-CLSTM01（03U軟件）拍照。

1.2.4 種胚酸價的測定 參照GB 5009.229-2016.的方法[31]進行種胚酸價測定，并略有改動。將棉種剝?nèi)シN皮4 ℃保存15 h，然后，稱取3 g種胚研磨成粉，置于30 ml提取液（300 ml乙醇和乙醚1﹕1混合液作為脂肪酸提取液，再配制濃度為0.05 mol?L-1KOH溶液100 ml，使用酚酞指示劑，將提取液滴至中性，密封保存）中，震蕩混勻12 h；低溫超速離心機5 000 r/min離心2 min，取上清液，用KOH溶液滴定，至滴定終點時消耗KOH體積記為V（ml）。

酸價（mg KOH?g-1）=（V×0.05×56.11）/m

其中，V為滴定時消耗KOH溶液的體積（ml）；0.05為KOH溶液的濃度（mol?L-1）；56.11為KOH的摩爾質(zhì)量；m為種子質(zhì)量（g）。

1.2.5 種子呼吸速率的測定 參照徐愛東等[32]方法測定棉花種子的呼吸速率，并略有改動。稱取各處理種子10 g放入網(wǎng)袋，懸掛于含15 mL 50 mmol?L-1氫氧化鋇溶液的廣口瓶內(nèi)，迅速塞緊瓶塞，反應溫度為（27±0.5）℃，反應時間為4 h。以瓶內(nèi)不放種子作為空白對照，每組3次重復，反應結(jié)束后，取出種子，加入酚酞指示劑，用H2C2O4溶液滴定，滴定終點即溶液恰好由粉色變?yōu)闊o色，記下消耗H2C2O4溶液的體積（V1）和空白對照消耗H2C2O4溶液的體積（V0）。用下列公式計算種子呼吸速率。吸脹不同時間的種子隨機稱取10 g，試驗方法同上。

呼吸速率（mg·h-1·g-1）=（V0-V1）/（t×w）

式中，t為呼吸時間（h），W為種子重量（g）。

1.2.6 棉花種胚ATP合成酶活性的測定 用植物ATP合成酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定棉花種胚ATP合成酶的活性，產(chǎn)品編號MM-4715702（江蘇酶免實業(yè)有限公司）。

將種胚液氮研磨后稱0.1 g置于1.5 mL離心管中，加入1 mL PBS（磷酸鹽緩沖溶液，0.01 mol?L-1，pH=7.4），冰浴10 min，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，收集上清于新的離心管中待測；設置空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)，制備標準品和待測樣品，37 ℃溫育30 min后進行顯色反應（震蕩混勻37 ℃避光顯色10 min)，反應結(jié)束后，加入終止液50 μL終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色），在450 nm波長依序測量各孔的吸光度。

1.3 ATP合成酶亞基mRNA完整性的檢測

1.3.1 種胚總RNA的提取 采用TransZol Plant試劑盒（ET121，北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取棉花種胚總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000檢測總RNA的完整度和濃度。

1.3.2 ATP合成酶基因的選擇及引物設計 通過NCBI網(wǎng)站查找陸地棉ATP合成酶亞基的基因序列，經(jīng)過基因和氨基酸序列比對，確定最終所選基因。根據(jù)選擇基因查找其對應的cDNA序列，利用Beacon Designer 7.0軟件設計5′和3′端特異性實時熒光定量引物（表1），由上海生工有限公司合成。

表1 基因完整性檢測所用雙引物

1.3.3 qRT-PCR檢測及mRNA完整性分析 使用天根生化科技有限公司(北京)的FastQuant RT Kit（with gDNase）合成cDNA；采用TransStrat Top Green qPCR Supermix試劑盒進行擴增反應，反應體系為Template cDNA 5.0 μL、上下游引物各0.4 μL、2×TransStartTop Green qPCR SuperMix 10 μL，補充ddH2O至20 μL。擴增程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃ 4 min。

采用反轉(zhuǎn)錄阻斷-雙引物擴增法分析特定mRNA完整性[33]。由于逆轉(zhuǎn)錄是從mRNA的3′端延伸至5′端，故產(chǎn)物中5′端的完整cDNA低于3′端。根據(jù)這一原理，分別對待測mRNA的5′端和3′端進行擴增。擴增兩端cDNA的Ct值的差異反映了逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的差異，即mRNA的氧化損傷程度。理論上，mRNA氧化損傷越嚴重，反向轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物中完整cDNA含量越低，反映RNA氧化損傷程度的值越小。計算方法如下：

=x/0，x=2-ΔCtx，（0：對照組，x：處理組）

ΔCt0=Ct0(5′)-Ct0(3′)，ΔCtx=Ctx(5′)-Ctx(3′)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進行計算與繪圖，以平均值±標準差的形式表示。采用Duncan's新復極差法（DPS數(shù)據(jù)處理軟件V15.10版本）進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果

2.1 不同衰老棉花種子活力表現(xiàn)

2.1.1 種子萌發(fā)率及平均萌發(fā)時間

萌發(fā)率是衡量種子活力的重要指標。對自然存放3年、5年的棉種進行萌發(fā)試驗，結(jié)果（圖1）顯示，有少數(shù)對照種子在吸脹10 h時即完成萌發(fā)，在吸脹24 h時，萌發(fā)率為95.3%，接近最高萌發(fā)率（98.7%），萌發(fā)速度最快；自然存放3年的種子也有少數(shù)在吸脹10 h時完成萌發(fā)，在吸脹30 h時，萌發(fā)率為78.0%，接近最高萌發(fā)率（84.0%），萌發(fā)速度顯著慢于對照；而自然存放5年的種子僅有極少數(shù)在吸脹16 h才完成萌發(fā)，在吸脹34 h時，萌發(fā)率為56.7%，接近最終萌發(fā)率（58.0%），萌發(fā)速度最慢；對照種子在吸脹36 h時完成萌發(fā)，最終萌發(fā)率為98.7%，自然存放3年和5年的種子均在吸脹40 h時完成萌發(fā)，最終萌發(fā)率分別為84.0%和58.0%，顯著低于對照。說明自然儲藏過程中，棉花種子生活力在顯著下降。

3Y、5Y分別表示儲存了3年和5年的種子。下同

平均萌發(fā)時間是反映種子萌發(fā)的整齊度和速度的指標。種子萌發(fā)率達到最高萌發(fā)率的一半時所用的時間為種子的平均萌發(fā)時間，圖1可以看出，對照種子平均萌發(fā)時間為17.6 h，存放3年、5年的種子平均萌發(fā)時間分別是21.1和24.3 h，說明隨貯存時間的延長，種子萌發(fā)速度減慢。

2.1.2 種子含水量變化 水分是種子萌發(fā)的必要條件。測定吸脹24 h內(nèi)種子的含水率，結(jié)果（圖2）顯示，3種種子的初始含水量分別為9.93%、9.32%和9.45%，吸脹初期（前4 h），不同老化水平的種子吸水速率存在一定差異，但吸水的總體趨勢接近。前4 h是種子快速吸水期，對照種子吸水量增加最快，在4 h時含水量達到36.4%，增量為26.4%，儲存3年和5年的種子含水量分別為32.9%和28.7%，增量為23.5%和19.3%，分別比對照降低了11.0%和26.9%，差異達到顯著水平；4 h后種子的吸水速度減慢，在18 h時基本一致，差異不顯著；在24 h時，大部分種子已完成萌發(fā)，且隨著萌發(fā)的進行，種子吸水量的差異逐漸減小。說明經(jīng)過自然衰老的棉花種子在吸脹萌發(fā)初期相對吸水量和吸水速率顯著降低。

圖2 不同衰老棉花種子吸脹過程中含水量變化

2.1.3 種子生活力變化 種子生活力是種子萌發(fā)的潛在能力，TTC染色法是種子生活力檢測的常用方法。對存放3年、5年的棉花種胚進行TTC溶液染色，結(jié)果（圖3）顯示，對照種子的種胚各部位均被染成紅色（圖3-A），儲存3年的棉花種胚著色比對照淺（圖3-B），而儲存5年的棉花種子子葉處未著色，僅有胚根處部分染為淺紅色（圖3-C）。說明自然老化會降低棉花種胚的生活力，且存放的時間越長，生活力下降越明顯，并且種胚不同器官對衰老的響應也存在一定差異。

A：CK；B、C分別為貯藏3年和5年的種子

2.1.4 種子酸價變化 酸價可作為種子變質(zhì)程度的指標，在儲藏過程中，種子中的脂肪可能會發(fā)生水解，產(chǎn)生游離脂肪酸。棉花種子酸價的測定結(jié)果（圖4）顯示，對照種子的酸價平均為1.83 mg?g-1，自然存放3年和5年的棉花種子的酸價分別為2.35和2.55 mg?g-1，分別較對照種子升高28.4%和40.0%，且差異達到顯著水平。說明隨著自然存放的時間延長，種子脂肪發(fā)生水解，從而導致酸價顯著升高。

不同小寫字母表示顯著差異（P＜0.05）。下同

2.1.5 種子呼吸速率變化 呼吸作用與種子的生命代謝活動密切相關(guān)，呼吸作用產(chǎn)生的ATP是種子萌發(fā)所必需的能量來源，而呼吸速率是表示種子活力的重要指標。測定種子在不同吸脹時間的呼吸速率，結(jié)果（圖5）表明，對照和自然存放3年、5年的干種子呼吸都非常微弱，呼吸速率無明顯差異；而隨著吸脹的進行，種子呼吸速率表現(xiàn)顯著增加，但提高的幅度存在顯著差異，自然儲存3年的種子呼吸速率提高幅度較小，儲存5年的種子呼吸速率提高最少；其中，吸脹24 h后，對照種子呼吸速率達到0.66 mg?g-1?h-1，而儲存3年和5年的種子呼吸速率分別為0.44和0.34 mg?g-1?h-1，增幅分別是對照種子的66.7%和50.8%，說明自然貯藏會導致種子呼吸速率下降。

圖5 自然衰老棉花種子呼吸速率變化

2.1.6 種胚ATP合成酶活性變化 ATP合成酶是ATP合成的關(guān)鍵酶。測定了棉花種子ATP合成酶活性的變化，結(jié)果（圖6）表明，干燥狀態(tài)下，對照和衰老3年和5年的種子種胚ATP合成酶的活性較低，分別為210.3、256.7和243.3 U?g-1；吸脹12 h后，對照種胚ATP合成酶活性顯著升高（783.8 U?g-1），儲存3年和5年的種子酶活性分別為727.6和396.2 U?g-1，增幅顯著低于對照。其中，衰老5年的種子酶活增幅只有對照種子的26.6%，暗示貯藏過程中棉花種胚細胞結(jié)構(gòu)特別是線粒體可能受到了損傷，導致ATP合成酶活性降低，進而影響ATP合成，以至影響種子活力。

圖6 自然老化棉花種子中ATP合酶活性的變化

2.2 種子ATP合成酶亞基貯藏mRNA完整性變化

通過NCBI網(wǎng)站查找和基因序列比對，選取陸地棉ATP合成酶5種亞基的5個基因，并用Beacon Designer 8.13引物設計軟件設計了5種亞基基因的5′端和3′端定量PCR引物。對5種亞基的5個基因進行反轉(zhuǎn)錄—雙引物擴增檢測分析，結(jié)果（圖7）表明，自然貯藏3年和5年后，棉花種子ATP合成酶亞基mRNA的值持續(xù)升高（分別為1.10和1.27），其他亞基mRNA的值在貯藏過程中均顯著下降；其中，亞基、亞基和亞基mRNA的值隨貯藏時間的延長呈持續(xù)下降趨勢，且較對照相比差異達到顯著水平；亞基的降幅最大，在儲存5年后值降為0.05，較對照降低了95.0%；亞基mRNA的值在儲存3年后驟減（為0.38），在儲存5年后顯著升高（為0.85），但值仍顯著低于對照。

上述結(jié)果表明，在自然衰老過程中，棉花種子ATP合成酶各個亞基的mRNA受到不同程度的損傷，其中，亞基、亞基和亞基mRNA損傷較嚴重，值顯著降低；亞基mRNA的值持續(xù)升高以及亞基值在貯藏過程中先降低后升高，可能是由于這兩種亞基mRNA兩端降解速度不一致，5′端降解速度過快，造成值反而升高，同樣說明這兩種亞基mRNA存在降解情況。

圖7 不同衰老棉花種胚ATP合成酶亞基mRNA完整性變化

3 討論

3.1 棉花種子貯藏過程中種子活力降低不可避免

種子衰老是一個不可逆的、損傷逐漸累積的、不可阻止的生物學過程[34]。即使是在最佳條件下儲存，種子也會逐漸衰老，種子活力不斷下降直至死亡，具體表現(xiàn)為種子發(fā)芽率降低、生活力下降、呼吸作用減弱、大分子物質(zhì)受損和酶活性下降等生理現(xiàn)象[1, 4, 5,11]。BERJAK等[35]發(fā)現(xiàn)在貯藏過程中，玉米種胚細胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷，且隨著儲藏年限的延長，線粒體、染色質(zhì)等細胞器損傷日益嚴重；Ratajczak等[36]對不同來源的山毛櫸種子研究發(fā)現(xiàn)，即使山毛櫸種子儲存在最佳條件下，種子發(fā)芽力的喪失也是不可避免的；LóPEZ-FERNáNDEZ等[37]發(fā)現(xiàn)柳樹種子在貯藏過程中發(fā)芽率不斷降低，并認為程序性細胞死亡是種子衰老劣變的關(guān)鍵機制；田茜等[38]發(fā)現(xiàn)老化的豌豆種子活力出現(xiàn)下降。本研究表明，隨著貯藏時間的延長，棉花種子的發(fā)芽率逐漸下降，種子生活力顯著降低，酸價顯著上升，這與玉米、山毛櫸、柳樹和豌豆種子等的結(jié)果一致。

3.2 棉花種子貯藏過程中不同器官衰老程度存在差異

種子衰老是一個非常復雜的生物學問題。迄今為止，衰老的機制仍不清楚。Harman[39]提出“活性氧引起的氧化損傷是衰老的主要誘發(fā)因素”。BERJAK等[35]發(fā)現(xiàn)長期貯存的玉米種胚細胞內(nèi)不同亞細胞結(jié)構(gòu)對老化的敏感性存在差異，其中，線粒體和染色質(zhì)的損傷比種子生活力的損失要早得多，這可能是由于這些位點的含水量較高，更易受自由基攻擊而導致氧化損傷；Ratajczak等[36]在自然貯藏的山毛櫸種子中發(fā)現(xiàn)，超氧陰離子自由基和過氧化氫首先在根冠細胞中被檢測到，且ROS的含量與發(fā)芽力顯著相關(guān)；王天波等[40]發(fā)現(xiàn)人工老化處理的玉米種胚ATP合成酶活性隨老化程度加深呈降低趨勢，且其中胚根和胚芽ATP合成酶活性降低的幅度大于盾片。本研究經(jīng)過TTC染色試驗發(fā)現(xiàn)棉花種子的子葉生活力喪失早于胚根，這可能是與胚根位于種子內(nèi)部，外被子葉嚴密包裹不易受到外部因素如氧氣、水分等影響所致，至于種子不同器官所發(fā)生的生理生化、物質(zhì)代謝以及相關(guān)分子生物學過程，需要進一步研究。

3.3 棉花種胚ATP合成酶亞基mRNA損傷可能是種子活力降低的重要原因之一

核酸是遺傳信息的載體，是保證生命多樣性最基本的物質(zhì)基礎。種子在發(fā)育過程中會積累大量的mRNA，這些mRNA對于維持種子的活力和壽命，調(diào)控種子的休眠和萌發(fā)等生理活動至關(guān)重要[41-42]。研究發(fā)現(xiàn)種子在吸脹時貯藏mRNA會選擇性地翻譯從而調(diào)控種子萌發(fā)[43]，在擬南芥和水稻種子中也被證實吸脹過程中mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的從頭合成是種子萌發(fā)的先決條件[42, 44]。而mRNA的氧化損傷可能導致翻譯過程中核糖體的移動受阻，造成翻譯的提前終止或錯誤進行，導致蛋白質(zhì)合成效率降低[25, 43]，從而影響種子萌發(fā)。

種子老化過程中伴隨著多種關(guān)鍵酶活性的降低，包括DNA聚合酶、ATP合成酶，脂氧合酶、抗氧化酶等[4, 10]，從而導致種子發(fā)芽過程中能量產(chǎn)生和物質(zhì)供應減少[6]。能量代謝是種子萌發(fā)的基礎[45]，ATP合成酶是種子能量代謝的核心，是呼吸鏈復合體Ⅴ的組成成分，負責機體90%以上的ATP合成，并且在代謝紊亂時通過調(diào)節(jié)底物代謝發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。ATP合成酶由F1和F0組成，其中F1部分由、、、和這5種亞基組成，和亞基組合成為ATP合成酶中核苷酸的結(jié)合部位，亞基是合成和水解ATP的關(guān)鍵部位，在質(zhì)子能的驅(qū)動下，亞基通過旋轉(zhuǎn)作用催化ATP的合成，當各亞基結(jié)合成完整的復合體時，才能利用質(zhì)子能合成ATP[46-47]，進而為細胞供能；ATP合成酶亞基受損，則會造成酶活性降低甚至喪失，影響ATP的產(chǎn)生。如Lee等[48]研究發(fā)現(xiàn)器官中ATP合成酶和亞基含量降低導致ATP含量減少；王天波等[40]發(fā)現(xiàn)人工老化處理的玉米種胚ATP合成酶活性隨老化程度加深呈降低趨勢，且ATP合成酶多個亞基的mRNA受到不同程度的損傷；Xin等[18]通過鑒定人工老化玉米種子的蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn)參與代謝和能量的蛋白質(zhì)顯著下調(diào)表達，并提出能量供應與種子老化的機制密切相關(guān)。本研究中，ATP合成酶的、、和的值均因衰老而顯著下降，的值顯著升高，暗示貯藏過程中棉花種胚ATP合成酶、、和的mRNA出現(xiàn)不同程度的損傷，的5′端出現(xiàn)大幅降解，這可能造成ATP合成酶亞基結(jié)構(gòu)不完善[43]，進而造成ATP合成酶活性降低；其中，和的mRNA嚴重受損，可能會造成ATP合成酶的催化部位遭到破壞；受損，ATP合成酶無法在質(zhì)子能的驅(qū)動下旋轉(zhuǎn)催化ATP的合成；這將導致種子萌發(fā)過程中ATP合成不足，影響種子萌發(fā)[6]。因此，ATP合成酶亞基mRNA損傷可能是種子活力下降的重要原因之一。種子貯藏過程中，ATP合成酶亞基mRNA是否存在一定的修復[2]，值得進一步研究。

4 結(jié)論

隨著貯藏時間的延長，棉花種子逐漸衰老，表現(xiàn)為萌發(fā)率下降，生活力降低，酸價顯著上升，吸水能力和呼吸能力下降；ATP合成酶多個亞基的mRNA出現(xiàn)不同程度的損傷，造成ATP合成酶亞基結(jié)構(gòu)不完善，導致種胚ATP合成酶活性下降，ATP合成不足，影響種子萌發(fā)。這可能是種子衰老的重要原因之一。

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Physiological Changes and Integrity of ATP Synthase Subunits mRNA in Naturally Aged Cotton Seeds

Song Ci, Gu FengXu, Xing ZhenZhen, Zhang JunMing, He WenXue, Wang TianBo, WangYuLu, CHEN JunYing

College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046

【Objective】Seed aging is a complex biological process, previous studies have been used to elucidate the events. However, the mechanism of seed aging is still unclear. The naturally aged cotton seeds were used as experimental materials, and the physiological and biochemical changes as well as the changes in ATP synthase mRNA integrity that occurred in cotton seed during storage were investigated in order to provide a foundation for further illuminating the aging mechanism of cotton seeds. 【Method】In this study, a collection of seeds (cultivar Xinluzao 74) that had been stored for 3 and 5 years served as the experimental materials, the newly harvested seeds were used as the control (CK). The germination percentage, water absorption and viability of cotton seeds were valued by germination test between paper, low constant temperature over method, and TTC staining method, respectively; The acid value and respiratory rate of cotton seeds were determined by the acid-base titration method, and the ATP synthase activity was detected with plant ATP synthase ELISA kit. The mRNA integrity of ATP synthase subunit,,,, andin cotton embryo was analyzed by reverse transcription blocking-double primer amplification method. 【Result】Our data suggest that seed vigor dramatically decreased over storage time. After 3 and 5 years of storage, the germination percentage of cotton seeds was significantly decreased from 98.7% to 84.0% and 58.0%, respectively (＜0.05). At the initial stage of seed imbibition (the first 4 h), the water absorption rate of seeds was significantly decreased by 11.0% and 26.9%, respectively. The results of TTC staining showed that only the radicle was slightly stained in seeds preserved 5 years but not the cotyledons and other organs stained; The acid value of seeds was significantly increased by 28.4% and 40.0%, respectively (＜0.05), this indicated that severe hydrolysis of lipid occurred in seeds. Seed respiration rate and ATP synthase activity showed an increasing trend during imbibition, but the increasement was significantly decreased (＜0.05); The respiration rate of seeds was reduced by 33.3% and 49.2% after 24 hours of imbibition, and the activity of ATP synthase was decreased by 17.9% and 73.4% after 12 hours of imbibition, respectively. The results of reverse transcription blocking-double primer amplification showed that thevalue of ATP synthase subunits,,, andmRNAs stored in seeds were significantly decreased, but the subunitmRNA was significantly increased. These results indicated that the integrity of the ATP synthase subunits mRNA decreased to varying degrees during the natural storage process. 【Conclusion】These results showed that a prolonged storage time could reduce seed vigor; The integrity loss of ATP synthase subunit mRNAs stored in seed embryos would cause ATP synthase subunit to be impaired and ATP synthase activity declined, thus lead to a decreased production of ATP and affect seed germination capacity. This might be one of the important reasons for cotton seed aging.

cotton seed; seed senescence; seed vigor; ATP synthase;mRNA integrity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.001

2022-12-20；

2023-02-17

國家自然科學基金（31971998，31571761）、國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0101000-03）

宋詞，E-mail：sc17836952689@126.com。通信作者陳軍營，E-mail：chenjunying3978@126.com

（責任編輯 李莉）