基于免疫檢查點(diǎn)抗體藥物的分子探針的應(yīng)用

陶金萍，黃海峰，楊 志，朱 華

1. 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)部腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京），放射性藥物研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（國家藥品監(jiān)督管理局），北京 100142；

2. 貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；

3. 貴州省人民醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550002

惡性腫瘤是中國人口主要的死亡原因。腫瘤治療方式主要包括化療、放療、手術(shù)治療、免疫治療、靶向治療和內(nèi)分泌治療。免疫治療是通過提高免疫細(xì)胞識(shí)別能力和消除攜帶特異性抗原的腫瘤細(xì)胞來刺激機(jī)體增強(qiáng)自身免疫能力，從而提高抗腫瘤效果［1］。近幾年，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）療法成為腫瘤免疫治療中備受關(guān)注的研究方向，免疫檢查點(diǎn)分子是位于免疫細(xì)胞表面的受體，與配體結(jié)合后，通過傳遞抑制或刺激信號(hào)在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和維持自我耐受性中發(fā)揮功能性作用［2］。程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）是目前研究尤為廣泛的免疫檢查點(diǎn)，已經(jīng)在黑色素瘤、腎癌和肺癌中獲得了持久的應(yīng)答。然而，能從中受益的患者有限且應(yīng)答率低，甚至一些患者可能經(jīng)歷嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件［3］。這就為發(fā)現(xiàn)新的免疫檢查點(diǎn)提供了動(dòng)力，T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT）等的發(fā)現(xiàn)，將有助于提高免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用和患者的臨床反應(yīng)性。放射性標(biāo)記的ICI分子成像能突破免疫組織化學(xué)在反映腫瘤組織中生物標(biāo)志物的異質(zhì)性和時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)中的局限。分子成像技術(shù)有助于對免疫腫瘤學(xué)治療進(jìn)行動(dòng)態(tài)評估、顯示示蹤劑在體內(nèi)的分布情況［4］。

1 分子成像在ICI治療中的應(yīng)用

免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）是確定惡性病變中程序性死亡受體配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床診斷迫切需要一種非侵入性成像策略來彌補(bǔ)IHC的缺點(diǎn)。分子成像技術(shù)可以解決免疫檢查點(diǎn)蛋白在腫瘤中的異質(zhì)性表達(dá)問題，允許重復(fù)采集圖像，有利于疾病進(jìn)展和干預(yù)期間的監(jiān)測，同時(shí)也避免重復(fù)活檢，極大地減輕患者的痛苦［5］。放射性示蹤劑可清楚顯示免疫檢查點(diǎn)在體內(nèi)的分布情況，在腫瘤的免疫治療過程中發(fā)揮指導(dǎo)作用（圖1）。

圖1 ICI抗腫瘤作用機(jī)制圖

傳統(tǒng)的正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）示蹤劑，如18F-FDG，已經(jīng)在臨床上得到充分的研究，其為葡萄糖代謝顯像劑，對于腫瘤細(xì)胞種類的特異性鑒別診斷能力不足，對于免疫T細(xì)胞并無特異性［6-7］。放射性標(biāo)記的抗體藥物在各種惡性腫瘤的臨床前研究中已經(jīng)展示出巨大的潛力，部分抗體示蹤劑已成功地完成臨床研究。本文將介紹靶向不同免疫檢查點(diǎn)的放射性抗體示蹤劑的臨床前和臨床研究動(dòng)態(tài)及進(jìn)展（表1）。

表1 特異性靶向免疫檢查點(diǎn)抗體探針的研究

續(xù)表

2 靶向PD-1的放射性示蹤劑

PD-1在T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表面表達(dá)，與其天然配體PD-1結(jié)合會(huì)抑制T細(xì)胞的活性，因此抑制PD-1與PD-L1之間的相互作用可促進(jìn)免疫應(yīng)答［17］。

針對PD-1的單克隆抗體，已在臨床前研究和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測試，在腫瘤診斷和治療方面取得了令人鼓舞的結(jié)果。2015年，Natarajan等［10］首次報(bào)道了一種64Cu放射性標(biāo)記的抗體示蹤劑，用于阻斷PD-1與PD-L1結(jié)合，并利用PET技術(shù)評估體內(nèi)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上PD-1的表達(dá)。2016年，Hettich等［21］使用64Cu放射性標(biāo)記的抗體示蹤劑在動(dòng)物淋巴結(jié)中實(shí)現(xiàn)了無創(chuàng)可視化PD-1和PD-L1。這兩項(xiàng)研究證明了靶向PD-1和PD-L1的單抗探針在免疫活性小鼠中的成像實(shí)驗(yàn)的特異性，進(jìn)一步推進(jìn)了PD-1/PD-L1阻斷藥物的臨床前和臨床開發(fā)。但僅限于小鼠體內(nèi)PD-1的研究并不能解決腫瘤治療藥物研發(fā)中人類面臨的臨床困境。因此，PD-1表達(dá)的研究需要新的放射性探針和模型，而人源化模型更能模擬人類的生理和病理狀態(tài)，后續(xù)工作也證明基于人源化模型的研究［58］進(jìn)一步推動(dòng)了免疫檢查點(diǎn)免疫療法的臨床前研究。

基于抗體示蹤劑的藥代動(dòng)力學(xué)特征，臨床研究選用半衰期較長的89Zr放射性核素標(biāo)記。一項(xiàng)在13例非小細(xì)胞肺癌患者中的研究［18］表明，89Zr-納武單抗在對該藥物治療有反應(yīng)的腫瘤病變中攝取較高，且腫瘤病灶的攝取在患者之間和患者內(nèi)部差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另一項(xiàng)研究［13］招募了11例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，7例轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者，證明89Zr-派姆單抗攝取與患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）相關(guān)，但其中1例患者在開始接受派姆單抗治療后因一系列不良反應(yīng)而死亡?？梢姳M管這些療法在一些患者中具有較好的治療效果，但其引起的不良反應(yīng)也可能是致命的。因此，對PD-1治療受益者進(jìn)行篩查，有利于確定最佳的給藥策略。

3 靶向PD-L1的放射性示蹤劑

由于能從PD-1/PD-L1的特異性單克隆抗體療法受益的患者只有20%［29］，且單克隆抗體相對分子質(zhì)量較大，腫瘤穿透性能較差。因此，需要開發(fā)新的探針來指導(dǎo)患者選擇藥物，提高腫瘤對探針的攝取能力。針對PD-L1的抗體已在腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和晚期黑色素瘤等腫瘤中顯示出抗腫瘤活性。其中從多樣性Fab噬菌體展示文庫中分離出的多個(gè)抗PD-L1抗體經(jīng)研究［22，24］證明其具備腫瘤PET和免疫治療的抗體治療劑的潛力。后續(xù)多種抗小鼠和抗人單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）［26，28，31］顯示出較高的檢測能力。然而，這些研究是在具有不同免疫能力的小鼠中進(jìn)行的，這限制了示蹤劑在特異性方面的驗(yàn)證。

一些已經(jīng)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑，在多種惡性腫瘤的治療中顯示出令人鼓舞的結(jié)果。2018年，Bensch等［35］使用89Zr-阿替利珠單抗進(jìn)行了首次臨床研究，膀胱癌、三陰性乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌患者的客觀緩解率分別為56%、25%和11%，證實(shí)腫瘤攝取89Zr-阿替利珠單抗探針與最佳腫瘤緩解類別之間存在正相關(guān)，也與病變大小相關(guān)。另一項(xiàng)研究［32］利用阿替利珠單抗合成示蹤劑，檢測了111In PD-L1-單克隆抗體和NIR-PD-L1-單克隆抗體在多種腫瘤模型中的特異性，單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）顯示用111In PDL1-單克隆抗體成像的最佳時(shí)間為120 h。除了阿替利珠單抗，阿維魯單抗是一種新出現(xiàn)的用于靶向PD-L1的人IgG1單克隆抗體，已經(jīng)在肺腺癌模型中針對PD-L1的近紅外光免疫療法進(jìn)行了測試［59］。近期幾項(xiàng)臨床前研究［5，23］通過89Zr標(biāo)記的阿維魯單抗不僅證實(shí)了用89Zr-Df-阿維魯單抗靶向PD-L1的免疫PET的可行性，還證明其可用于指導(dǎo)乳腺癌患者的分層、治療監(jiān)測和反應(yīng)預(yù)測。

Xing等［37］通過99mTc-NM-01探針在16例經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)進(jìn)行了靶向PD-L1非侵入性成像的Ⅰ期臨床研究，結(jié)果顯示腫瘤血池比與PD-L1表達(dá)之間具有相關(guān)性，同時(shí)確定了非小細(xì)胞肺癌患者可耐受的輻射劑量。近期，有研究者在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中開展了度伐利尤單抗的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，Verhoeff等［38］通過89Zr-DFO-度伐利尤單抗探針靶向PD-L1，評估了該探針PET的安全性和可行性，并預(yù)測度伐利尤單抗治療期間的疾病控制率。

4 靶向CTLA-4的分子成像

CTLA-4是在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞上表達(dá)的關(guān)鍵抑制性受體。伊匹單抗是一種針對CTLA-4的單克隆抗體，用于治療晚期黑色素瘤。除了一項(xiàng)研究［51］探討了64Cu標(biāo)記的伊匹單抗在小鼠非小細(xì)胞肺癌模型中的生物分布，Ehlerding等［52］比較了伊匹單抗全抗體和伊匹單抗的F（ab’）2片段，用64Cu放射性標(biāo)記，并在人源化小鼠模型中驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)伊匹單抗全抗體在靶器官中有更高的絕對攝取，而伊匹單抗的F（ab’）2片段允許在更早的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行更高對比度的成像，但絕對攝取值更低。在此之前，Higashikawa等［50］開發(fā)了一種64Cu-抗-CTLA-4抗體探針，用于CT-26移植瘤小鼠中表達(dá)CTLA-4的TIL成像。目前，一項(xiàng)臨床試驗(yàn)（NCT03313323）［60］也正在研究使用89Zr-伊匹單抗作為治療中的預(yù)測生物標(biāo)志物的CTLA-4成像。使用抗CTLA-4的免疫療法在臨床實(shí)踐中取得了一定的成功，但CTLA-4的配體CD80和CD86也在抗原呈遞細(xì)胞（antigenpresenting cell，APC）上表達(dá)，阻斷CTLA-4具有不僅限于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的全身性影響。因此，抗CTLA-4免疫療法仍存在與抗CTLA-4給藥相關(guān)的自身免疫或其他嚴(yán)重不良事件的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

5 靶向TIM3的分子成像

TIM3最初被確定為一種在活化的效應(yīng)T細(xì)胞上表達(dá)的起負(fù)調(diào)控作用的表面分子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TIM3也在先天免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞［1］。有研究［61］發(fā)現(xiàn)，TIM3表達(dá)的增加與對抗PD-1療法的適應(yīng)性抗性有關(guān)。

目前，關(guān)于靶向TIM3的體內(nèi)成像示蹤劑的研究僅有兩項(xiàng)。Wei等［53］采用64Cu-NOTARMT3-23探針和PET，揭示了TIM3陽性免疫細(xì)胞在黑色素瘤模型中的分布情況，證實(shí)了放射性示蹤劑在追蹤TIM3中的可行性。另一項(xiàng)研究［54］將T I M 3 單克隆抗體與近紅外熒光染料IRDye 800CW偶聯(lián)，對GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞C57BL/6小鼠原位移植瘤模型進(jìn)行體內(nèi)成像，證實(shí)了小鼠TIM3非侵入性成像應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的可行性。未來的研究需要開發(fā)靶向人TIM3的放射性分子探針，以優(yōu)化臨床TIM3靶向免疫治療。

6 靶向LAG-3的分子成像

LAG-3是一種在活化的T細(xì)胞中上調(diào)的免疫檢查點(diǎn)分子，被認(rèn)為是T細(xì)胞衰竭的標(biāo)志。LAG-3與主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的增殖和活化［62］，阻礙抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前，至少有16種LAG-3靶向分子正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評估［63］。新一代雙特異性PD-1/LAG-3阻斷劑也顯示出強(qiáng)大的特異性靶向PD-1或LAG-3高度功能失調(diào)的T細(xì)胞并增強(qiáng)其增殖和效應(yīng)活性的能力。

一項(xiàng)研究［56］利用99mTc標(biāo)記靶向LAG-3的單結(jié)構(gòu)域抗體3132，證實(shí)了該探針能特異性地檢測免疫細(xì)胞和經(jīng)改造表達(dá)高水平LAG-3的腫瘤細(xì)胞上的LAG-3。此后，該課題組［55］通過SPECT/CT評估了99mTc-LAG-3單域抗體對不同腫瘤模型中TIL上LAG-3的成像能力，證明了該探針可以準(zhǔn)確定量TIL中的LAG-3水平。Kelly等［57］在免疫缺陷小鼠中證明了89Zr-DFO-REGN3767在表達(dá)人LAG-3的M38腫瘤中表現(xiàn)出高特異性攝取。目前兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在評估89Zr-DFO-REGN3767，研究生物分布及注射后進(jìn)行PET掃描的最佳劑量和最佳時(shí)間，以監(jiān)測患者對于抗LAG-3藥物治療的反應(yīng)。

盡管LAG-3 ICI在腫瘤免疫治療領(lǐng)域中已取得重大進(jìn)展，但需要進(jìn)一步的研究來解決LAG-3配體的存在、表達(dá)，以及LAG-3/PD-1協(xié)同作用的機(jī)制等問題［64］。

7 總結(jié)及展望

有研究［65］顯示，針對CTLA-4、PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)的治療可以提高各種腫瘤患者的存活率，生物標(biāo)志物的分子成像可以預(yù)測其在各腫瘤模型中的治療效果。然而，將動(dòng)物腫瘤模型的臨床前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床結(jié)果極具挑戰(zhàn)性。一方面，ICI具有的毒性和療效模式，與傳統(tǒng)的化療非常不同；免疫檢查點(diǎn)療法可能會(huì)引起一系列免疫相關(guān)不良事件，表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)活性增加引起的自身免疫樣反應(yīng)，包括疲勞或發(fā)熱等全身性毒性和器官特異性損傷類局部毒性［66-67］。另一方面，目前大多數(shù)臨床試驗(yàn)涉及的腫瘤類型很少，基本局限于非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、腎癌、結(jié)直腸癌，此外，研究廣泛的靶點(diǎn)（如CTLA-4、PD-1/PD-L1）的受益人群很小，一些應(yīng)答者在初始應(yīng)答后會(huì)產(chǎn)生獲得性耐藥，腫瘤的內(nèi)在因素和微環(huán)境的外在因素都可能導(dǎo)致耐藥性［68］。并且缺乏一些創(chuàng)新的靶點(diǎn)，對新靶點(diǎn)的研究還不夠透徹和深入。在臨床研究中靶向免疫檢查點(diǎn)的阻斷藥物的創(chuàng)新相對較少，2019年開發(fā)中的活性藥物數(shù)量達(dá)3 876種，相比2017年和2018年增加了91%，而藥物批準(zhǔn)情況卻停滯不前［69］。目前，在臨床研究中靶向PD-1的顯像劑有89Zr-派姆單抗、64Cu-派姆單抗和89Zr-納武單抗。靶向PD-L1的顯像劑有89Zr-阿替利珠單抗、89Zr-阿維魯單抗、18F-BMS-986192。這些藥物在用于腫瘤治療時(shí)，可單一使用也可與其他藥物聯(lián)合使用。而靶向CTLA-4和LAG-3的藥物目前僅有一種進(jìn)入了臨床階段研究，伊匹單抗是抗CTLA-4的單抗，通過阻斷CTLA-4與CD80/86配體結(jié)合，增強(qiáng)T細(xì)胞的激活、增殖和免疫功能，在腫瘤治療方面表現(xiàn)出顯著的療效，但靶向CTLA-4的顯像劑［64Cu-NOTA-伊匹單抗-F（ab’）2、64Cu-NOTA-伊匹單抗、64Cu-DOTA-伊匹單抗］仍處于臨床前研究階段。89Zr-REGN3767是一種針對LAG-3的放射標(biāo)記抗體，已在淋巴瘤（NCT04566978）和其他晚期惡性腫瘤（NCT03005782）患者中進(jìn)行首次人體研究［70］。分子探針的特性也是臨床轉(zhuǎn)化中一個(gè)重要的因素?？贵w分子探針具有高特異性的特點(diǎn)，但抗體由于相對分子質(zhì)量較大（約150 000），其組織穿透能力有限。因此較小的蛋白質(zhì)，如納米抗體越來越受到關(guān)注，因?yàn)槠淇梢园邢蚰[瘤細(xì)胞上的靶點(diǎn)且可以迅速經(jīng)血液清除。納米抗體與表位之間的結(jié)合也因其結(jié)構(gòu)較小而更緊密，穩(wěn)定性和靈敏度都很高。大量臨床前研究［71］表明，ICI放射性探針與分子成像技術(shù)結(jié)合具有在腫瘤診斷和治療時(shí)可視化病灶、識(shí)別可能受益患者的潛力，這種方法有助于甄別不同患者之間的差異，在個(gè)性化醫(yī)療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

隨著越來越多新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，許多ICI探針也完成了臨床轉(zhuǎn)化，而臨床研究不僅注重ICI的療效，更注重藥物安全。面對這一挑戰(zhàn)，需要準(zhǔn)確地評估腫瘤中免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)情況。傳統(tǒng)的IHC雖能對病變組織中免疫檢查點(diǎn)進(jìn)行定量分析和分類，但該手段反映的是某時(shí)刻的靜態(tài)表達(dá)，且并非所有患者都可以進(jìn)行活檢，該方法還存在抽樣誤差和誤判的風(fēng)險(xiǎn)。而ICI放射標(biāo)記PET能通過非入侵的方式獲得患者全身表達(dá)信息，有助于在腫瘤免疫治療中進(jìn)行動(dòng)態(tài)評估，有利于把握抗體劑量和腫瘤攝取之間的關(guān)系，解決同種疾病患者之間治療效果和預(yù)后差異的問題。分子探針和分子影像是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要工具，可指導(dǎo)開發(fā)新藥物和尋找新的治療方法。本文旨在介紹腫瘤學(xué)中免疫檢查點(diǎn)成像的最新進(jìn)展，闡述分子成像示蹤劑在腫瘤免疫治療中的潛在價(jià)值，當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)是如何在疾病治療中實(shí)現(xiàn)這些成像方法，未來需要更多的轉(zhuǎn)化研究和大規(guī)模臨床試驗(yàn)來證明示蹤劑的臨床價(jià)值。