R-loop的調(diào)控及其生理功能*

張譯勻 葉素敏 金建平

（1）浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院，杭州 310058；2）浙江大學(xué)紹興研究院生命科學(xué)分中心，紹興 321000；3）浙江大學(xué)癌癥中心，杭州 310058）

1 R-loop的基本功能

R 環(huán)（R-loop）是細(xì)胞內(nèi)在DNA∶RNA 雜合鏈和雙鏈DNA上的被置換的單鏈DNA之間形成的一種特殊的三鏈核酸結(jié)構(gòu)（圖1）。最初，DNA∶RNA 雜合鏈多被認(rèn)為是在岡崎片段合成過(guò)程中形成的，以及轉(zhuǎn)錄過(guò)程中RNA 聚合酶活性中心內(nèi)形成的雜合鏈。之后的研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)可以以順?lè)词降姆绞叫纬梢环N更長(zhǎng)的DNA∶RNA 雜合鏈，由此催生出R-loop 的基本概念［1］（圖1）。當(dāng)一條新生的RNA與模板DNA結(jié)合，暴露出一條游離的單鏈DNA，從而形成一種非B型的DNA結(jié)構(gòu)，這種長(zhǎng)可達(dá)1~2 kb的三鏈核苷酸結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為R-loop［2-3］。R-loop 是A 型RNA 和B 型DNA 之間形成的雜合體，其穩(wěn)定性比雙鏈DNA 更高［4］。R-loop 曾被認(rèn)為是一種罕見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，但是，越來(lái)越多的證據(jù)表明，R-loop可以在細(xì)菌到人類(lèi)等生物體細(xì)胞內(nèi)頻繁地形成，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性［4］，哺乳動(dòng)物基因組上約有5%的區(qū)域會(huì)形成R-loop，多數(shù)集中在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域［5］。另一方面，R-loop 對(duì)轉(zhuǎn)錄終止［6］、基因調(diào)控［7］、線粒體穩(wěn)定性［8］等生物學(xué)過(guò)程也有著積極的作用。然而，細(xì)胞是怎樣抑制R-loop 的負(fù)面作用、同時(shí)又保證其積極作用，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制仍有很多亟待解決的疑問(wèn)。本文將對(duì)R-loop的調(diào)控機(jī)制及其生理功能的研究進(jìn)展、R-loop的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述及討論。

2 R-loop的調(diào)控

R-loop的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜。越來(lái)越多不同生理過(guò)程中的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)參與R-loop 的調(diào)控（圖2）。目前有研究針對(duì)已發(fā)表的R-loop數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合，構(gòu)建了系統(tǒng)化的R-loop 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)集［8］。本文也對(duì)已發(fā)表的R-loop 調(diào)控因子進(jìn)行分類(lèi)歸納（表1），并進(jìn)行討論。

Fig. 2 Regulators of R-loop圖2 R-loop的調(diào)控因子

Table 1 Regulators of R-loop in mammalian cells表1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的R-loop的調(diào)控因子

2.1 轉(zhuǎn)錄和RNA加工對(duì)R-loop的調(diào)控

正常生理情況下，轉(zhuǎn)錄過(guò)程中信使核糖核蛋白體通過(guò)對(duì)新生RNA 進(jìn)行加工以幫助其出核。而當(dāng)RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄一些特殊的序列時(shí)，負(fù)超螺旋雙鏈DNA 展開(kāi)，這可能使模板DNA 與新生RNA 退火，暴露出一條游離的DNA 單鏈，從而導(dǎo)致R-loop的產(chǎn)生。這也是著名的Thread back模型［9］。R-loop 多在富含鳥(niǎo)嘌呤（G-rich）的區(qū)域形成，該區(qū)域可被稱(chēng)為G簇。通常在5'端附近包含4個(gè)及以上連續(xù)鳥(niǎo)嘌呤殘基的RNA 更易于形成R-loop［10］，比如嘌呤含量很高的抗體基因的轉(zhuǎn)換區(qū)（switch region）［11］。R-loop 的形成起始后，DNA∶RNA 雜交鏈被延長(zhǎng)，并通過(guò)隨后的G-rich 序列穩(wěn)定下來(lái)。當(dāng)鳥(niǎo)嘌呤的含量降低，延長(zhǎng)減少，R-loop的形成停止［7］。在G 簇附近形成的R-loop 可以保護(hù)該區(qū)域不被甲基化，從而保證基因轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程的正常進(jìn)行［12］。除了G-rich 序列之外，其他因素也可以促進(jìn)R-loop 的形成。例如，轉(zhuǎn)錄泡后面分叉上的負(fù)超螺旋增加可以提高新生RNA和模板鏈DNA之間相互作用的可能性［13］。此外，即使G-rich 序列位于起始G簇的遠(yuǎn)端，非模板鏈上的缺口也可以促進(jìn)新生RNA 與模板鏈的DNA 結(jié)合［14］。除了順式的R-loop形成方式之外，近年來(lái)，有研究表明R-loop也可以反式形成，即在一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的RNA 可以和另一個(gè)位點(diǎn)的同源 DNA 結(jié)合形成R-loop［15］（圖1）。

因?yàn)镽-loop 的形成機(jī)制和轉(zhuǎn)錄密不可分，所以其水平也受轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。在基因富集區(qū)的高轉(zhuǎn)錄基因上可以檢測(cè)到更多的R-loop，包括rRNA 和tRNA 位點(diǎn)；反之，基因密度較低的區(qū)域上R-loop則較少，并且其位置也是動(dòng)態(tài)變化的［16］。單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）結(jié)合蛋白隔離非模板ssDNA 也可以促進(jìn)R-loop 的形成，如線粒體ssDNA 結(jié)合蛋白穩(wěn)定了R-loop 的形成［17］。無(wú)論是單鏈還是雙鏈DNA 的斷裂，都可以提供一個(gè)自由的3' DNA 末端，這有利于新生RNA 和DNA 雜交形成R-loop［18］。除了DNA 之外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA ，如Lnc530 也會(huì)與R-loop 結(jié)合，并與DDX5和TDP-43形成復(fù)合體來(lái)抑制R-loop［19］。

R-loop 的水平與正常細(xì)胞的高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)，但其水平的增加不僅僅是高轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，RNA 加工、輸出和剪切等功能的異常，同樣會(huì)導(dǎo)致R-loop的積累［20］。早期的研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)和RNA輸出有關(guān)的THO/TREX 復(fù)合體中導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄缺陷的hpr1突變體會(huì)引起R-loop 的異常積累［21］，并 且THO與Sin3A組蛋白去乙酰化酶復(fù)合物相互作用可以抑制R-loop 的形成［22］。這些現(xiàn)象都暗示了轉(zhuǎn)錄和RNA加工、RNA輸出過(guò)程可以參與對(duì)R-loop的調(diào)控。研究者發(fā)現(xiàn)，用RNA 剪接抑制劑異銀杏素（isoginkgetin，ISO）處理細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致R-loop的積累以及DNA損傷，暗示了RNA的剪接可以參與R-loop的調(diào)控［23］。該研究發(fā)現(xiàn)了一系列RNA剪接 因 子， 包 括 SF3A3、 SF3B3、 SNRPA1、SUPT6H、PHF5 等與U2 小核核糖核蛋白復(fù)合體有關(guān)的剪接因子被抑制后會(huì)導(dǎo)致R-loop 的積累［23］。在骨髓增生異常綜合征、白血病等疾病中，一些RNA剪接因子的失調(diào)或突變會(huì)導(dǎo)致R-loop的異常，例如SF3B1、U2AF1、SRSF2 等，并引起DNA 損傷、細(xì)胞凋亡、基因組穩(wěn)定性等生理過(guò)程的改變［24-26］。這些都證明了RNA 的加工與出核可以參與R-loop 的調(diào)控，并且大多數(shù)是抑制R-loop 的形成。

2.2 RNA修飾和染色質(zhì)修飾對(duì)R-loop的調(diào)控

真核生物中，甲基化和去甲基化是調(diào)控DNA和RNA代謝的重要修飾途徑。其中，N6-甲基腺苷（m6A）是最為普遍的調(diào)控RNA 代謝的修飾［27］。和甲基化及去甲基化相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化結(jié)合蛋白都會(huì)參與R-loop 的調(diào)控。甲基轉(zhuǎn)移酶可以在RNA上加上甲基，介導(dǎo)RNA的甲基化修飾。如METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶可以介導(dǎo)R-loop在DNA雙鏈斷裂處積累，防止被m6A修飾的RNA被 降 解，以 促 進(jìn)RNA 與DNA 的 雜 合［28］；被SUMO 化修飾后的METTL8 可以進(jìn)入細(xì)胞核，修飾RNA上的m3C以增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)R-loop 形成［29］。甲基化結(jié)合蛋白可以識(shí)別甲基化修飾的信息，并參與下游RNA 的翻譯、降解等過(guò)程，例如YTHDF2 可以與R-loop 結(jié)合，阻止有m6A 修飾的R-loop 積累［30］。去甲基化酶可以去除RNA 上的甲基，例如去甲基化酶ALKBH2 和ALKBH3可以移除R-loop上的1-meA和3-meC［31］，這可能會(huì)導(dǎo)致RNA的不穩(wěn)定，從而抑制R-loop。

除了RNA 的修飾之外，染色質(zhì)的修飾也可以調(diào)控R-loop。DNMT3B和CDCA7通過(guò)甲基化DNA來(lái)抑制R-loop 的形成［32］。甲基化CpG 的結(jié)合蛋白MeCP2 同樣可以抑制R-loop 的積累，但其機(jī)制仍不清楚［33］。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可以參與R-loop的調(diào)控，例如，PRMT5 可以通過(guò)甲基化DDX5 從而介導(dǎo)R-loop的降解［34］。去甲基化酶PHF2通過(guò)使H3K9me2 在啟動(dòng)子處保持低水平來(lái)抑制R-loop 的形成［35］。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT8可以抑制R-loop的形成，從而抑制其介導(dǎo)的DNA復(fù)制壓力［36］。

2.3 DNA損傷應(yīng)答對(duì)R-loop的調(diào)控

為了應(yīng)對(duì)在生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)遇到的DNA 損傷和基因組不穩(wěn)定性帶來(lái)的危害，細(xì)胞進(jìn)化出了一系列應(yīng)對(duì)DNA損傷的機(jī)制，包括對(duì)DNA損傷的檢測(cè)和修復(fù)。這些機(jī)制與R-loop 的調(diào)控存在密不可分的關(guān)系。DNA損傷檢查點(diǎn)是檢測(cè)DNA損傷的重要環(huán)節(jié)之一，例如絲氨酸蛋白激酶ATM、ATR、CHK1和CHK2都可以通過(guò)抑制R-loop的積累以保障基因組的穩(wěn)定性［37］。ATM-CHK2 信號(hào)通路通常是檢測(cè)到DNA 雙鏈斷裂（double strand break，DSB）后激活的，而ATR-CHK1 信號(hào)通路主要感應(yīng)會(huì)誘導(dǎo)單鏈DNA 斷裂產(chǎn)生的一系列壓力而激活的，包括復(fù)制壓力等。有研究結(jié)果表明，ATM-CHK2 的缺陷會(huì)引發(fā)R-loop 的積累，但其導(dǎo)致的DNA 斷裂并不依賴(lài)于R-loop，研究者因此推測(cè)這種積累是由于未修復(fù)的DNA 雙鏈斷裂形成的。ATR-CHK1 的缺陷也會(huì)導(dǎo)致R-loop 的積累，但其引起的部分DNA 斷裂是依賴(lài)于R-loop的［37］。

細(xì)胞還可以通過(guò)DNA 修復(fù)的機(jī)制來(lái)抑制R-loop 的積累。同源重組相關(guān)蛋白BRCA1 和BRCA2的缺陷會(huì)導(dǎo)致R-loop的增加。BRCA1可以直接識(shí)別R-loop［38］，并與SETX 互作一起防止R-loop 導(dǎo)致的DNA 損傷、復(fù)制壓力和基因組不穩(wěn)定性［39］；BRCA2也可以通過(guò)促進(jìn)RNA聚合酶II的釋放、招募RNase H2到DNA雙鏈斷裂處的R-loop上［38］、刺激DDX5 的解旋酶活性等方式來(lái)抑制Rloop 的積累。范可尼貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）通路中的許多因子都參與R-loop 的調(diào)控，缺乏FANCA、FANCD2、FANCG、FANCL、FANCM等FA因子會(huì)造成R-loop的積累，從而影響DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生DNA 損傷［38，40-42］。核苷酸切除修復(fù)通路中兩個(gè)內(nèi)切酶——XPF 和XPG 可以修復(fù)基因組上不同類(lèi)型的DNA損傷。XPF和XPG 先前被證明可以在體外切割免疫球蛋白位點(diǎn)S 區(qū)形成的R-loop［11］。它們也可以在體內(nèi)抑制因NF-κB激活、AQR 缺失、TOP1cc 停滯等原因引起的R-loop 積累，并阻止因R-loop 積累而造成的DNA 雙鏈斷裂［43-45］。

2.4 拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)R-loop的調(diào)控

轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都會(huì)積累DNA正超螺旋，而DNA正超螺旋的形成會(huì)在相反的方向上產(chǎn)生等量的負(fù)超螺旋，這會(huì)促進(jìn)R-loop的形成。拓?fù)洚悩?gòu)酶可以通過(guò)減少負(fù)超螺旋，減少新生mRNA 與模板DNA 上G簇結(jié)合的可能性，從而抑制R-loop的積累。拓?fù)洚悩?gòu)酶1（topoisomerase，TOP1）的抑制劑喜樹(shù)堿（camptothecin，CPT）可以刺激R-loop 的形成［46］。TOP1 和TOP2 都被證明可以緩解扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，并防止rDNA 位點(diǎn)的R-loop 的聚集［47］，TOP1 缺失的細(xì)胞會(huì)在高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域形成依賴(lài)于R-loop 的DNA 雙鏈斷裂，并降低復(fù)制叉的速度［48］。TOP3B 也可以通過(guò)減少負(fù)超螺旋來(lái)抑制R-loop，并保障轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行，從而保護(hù)細(xì)胞免于DNA損傷，減少染色體易位的頻率［49］。

2.5 核糖核酸酶和解旋酶對(duì)R-loop的調(diào)控

及時(shí)清除過(guò)多的R-loop是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的必要措施。不同的酶可以進(jìn)行互補(bǔ)作用，以防止R-loop的過(guò)度積累。雖然R-loop可以拮抗RNase A，但是RNase H1 和RNase H2 可以利用5'→3'外切酶活性去除R-loop中的RNA單鏈［50］。這些酶在原核生物和真核生物中是高度保守的，并且是已知的唯一能特異地分解雜合RNA 的核糖核酸酶。鄒力實(shí)驗(yàn)室［51］發(fā)現(xiàn)，復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA） 可以結(jié)合單鏈DNA，促進(jìn)RNase H1 與R-loop的結(jié)合，從而抑制R-loop的積累。在RNase H2 上游，雙鏈RNA 特異性腺苷脫氨酶ADAR1p11 0則可以識(shí)別DNA∶RNA雜合鏈內(nèi)的錯(cuò)配堿基對(duì)，從而促進(jìn)RNase H2 對(duì)RNA 鏈的消化，導(dǎo)致端粒R-loop的降解［52-53］。

細(xì)胞中還具有去除R-loop的解旋酶，可以解開(kāi)R-loop 或者抑制它的產(chǎn)生。酵母中的SEN1 及其在人類(lèi)中的同源基因SETX被發(fā)現(xiàn)與R-loop的調(diào)控有關(guān)。SEN1最初被鑒定為一種DNA和RNA解旋酶，在體外具有5'→3' RNA-DNA 解旋活性［54］。SETX的失活會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上R-loop的增加，并且依賴(lài)于其解旋酶活性［55］。Hasanova等［56］的研究表明，SEN1/SETX在解開(kāi)R-loop中，特別是在轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程中起作用。在人和酵母細(xì)胞中，解旋酶AQR通過(guò)對(duì)RNA的加工過(guò)程降解R-loop，并介導(dǎo)同源重組修復(fù)。敲低AQR 會(huì)引發(fā)細(xì)胞在S 期的DNA 損傷［43，57］。很多DEAD-box和DEAH-box家族的解旋酶可以抑制R-loop的形成，例 如DDX1［58］、DDX5［49］、DDX11［59］、DDX19B［60］、DDX21［61］、DDX23［62］、 DDX39B［63］、 DDX43［64］、DDX47［40］、DHX9［65］都被證明可以參與R-loop的降解。除此之外，BLM的解旋酶活性受TOP1刺激而被激活后抑制R-loop的形成［66］，線粒體RNA解旋酶SUPV3L1 可以抑制有害線粒體R-loop 的積累［67］。但是，解旋酶并不全都參與解開(kāi)R-loop。在剪接體缺陷的情況下，DEAH-box蛋白DHX9可以促進(jìn)R-loop 的積累［68］，DDX1 可以將RNA G 四鏈體轉(zhuǎn)換為R-loop以促進(jìn)IgH的類(lèi)別轉(zhuǎn)換重組［69］。

3 R-loop的生理功能

雖然對(duì)于R-loop 導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性的研究更為廣泛，但是R-loop 的作用是一把雙刃劍，對(duì)多種生理過(guò)程不僅有著負(fù)面的作用，更有著無(wú)法替代的積極作用（圖3）。細(xì)胞通過(guò)不同的調(diào)控機(jī)制維持R-loop 的穩(wěn)態(tài)，在保證其積極作用的情況下消除其不利影響。R-loop 的調(diào)控與其功能密不可分，相輔相成。很多生理過(guò)程既可以是R-loop 的調(diào)控機(jī)制，也可以是R-loop 導(dǎo)致的結(jié)果，如DNA損傷應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等。因此，如此復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)給R-loop的研究帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

R-loop 對(duì)生命活動(dòng)發(fā)揮的積極作用常常被忽視。R-loop 是很多重要生物學(xué)過(guò)程必需的中間產(chǎn)物，例如S 區(qū)的R-loop 是免疫球蛋白類(lèi)開(kāi)關(guān)重組（immunoglobulin class switch recombination，ICSR）過(guò)程的天然來(lái)源［2］；CRISPR-Cas9 系統(tǒng)中，由gRNA 和雙鏈DNA 形成的R-loop 直接引導(dǎo)Cas9 核酸酶活性，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂［70］。R-loop對(duì)基因的表達(dá)也起著重要的調(diào)控作用，例如在擬南芥中，啟動(dòng)子區(qū)域的R-loop 能夠沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA COOLAIR 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)開(kāi)花位點(diǎn)對(duì)低溫的響應(yīng)［71］。R-loop 不僅可以調(diào)控單個(gè)基因的表達(dá)，也可以調(diào)控整體的基因表達(dá)水平。R-loop 可以保護(hù)CpG 島的啟動(dòng)子免于甲基化修飾，保障基因轉(zhuǎn)錄的通暢［5］。由于R-loop 多在基因的轉(zhuǎn)錄起始和終止區(qū)域形成，暗示其可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。R-loop的位置會(huì)影響RNA聚合酶從染色體上釋放的區(qū)域，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄終止過(guò)程［6］。R-loop也可以在RNA聚合酶II后的G-rich區(qū)域形成，招募SETX降解新生RNA 鏈，終止轉(zhuǎn)錄過(guò)程［72］。當(dāng)DNA 雙鏈斷裂時(shí)，細(xì)胞可利用R-loop的新生RNA作為橋梁，以其為模板介導(dǎo)雙鏈DNA斷裂的修復(fù)過(guò)程［73］。

R-loop 對(duì)生命活動(dòng)的不利影響同樣不容忽視，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。R-loop可以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活、DNA 損傷和染色體重排［74］。R-loop 可以暴露化學(xué)性質(zhì)更不穩(wěn)定的單鏈DNA，容易引發(fā)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的突變和重組［75］。R-loop也可能直接阻斷DNA的復(fù)制，導(dǎo)致分叉塌陷與DNA雙鏈斷裂［76］。R-loop導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定性與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。異常R-loop引發(fā)先天免疫的激活可能導(dǎo)致許多疾病，如神經(jīng)退行性變和癌癥［77］。在一些綜合征、人類(lèi)神經(jīng)紊亂和癌癥中都發(fā)現(xiàn)了大量的R-loop 積累［78-79］。乳腺癌中BRCA2的減少導(dǎo)致了R-loop的積累［80］，在白血病、淋巴瘤、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、睪丸癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞系中RAD51 水平增加促進(jìn)了R-loop 的形成［81］。自身免疫性疾病Wiskott-Aldrich 綜合征也與R-loop 有關(guān)，在輔助性T 淋巴細(xì)胞中，WAS 蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致R-loop 積累［82］?？傊琑-loop 和許多人類(lèi)疾病病因之間的因果關(guān)系十分重要，但仍有許多疑點(diǎn)值得進(jìn)一步探究。

Fig. 3 Functions of R-loops圖3 R-loop的功能

4 研究R-loop的常用手段

由于R-loop被如此精細(xì)地調(diào)控，并能具有重要的生理功能，研究者們開(kāi)發(fā)了多種多樣研究R-loop的方法（表2）。最初人們?cè)隗w外通過(guò)X 射線［83］、電子顯微鏡［84］觀察到了R-loop 的結(jié)構(gòu)。R-loop 結(jié)構(gòu)中的單鏈DNA 的胞嘧啶殘基可以在非變性條件下被亞硫酸氫鹽修飾，因此一些早期的研究利用該原理和Sanger 測(cè)序，在特定的基因組位點(diǎn)上探測(cè)R-loop［2］。遷移位移分析、原位雜交也常被用于研究R-loop。

隨著能特異性識(shí)別R-loop 的S9.6 抗體出現(xiàn)，R-loop的研究方法也得到了更好的改進(jìn)。S9.6抗體不依賴(lài)于序列而能和R-loop結(jié)合，因此利用該抗體可以對(duì)R-loop進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)、提取基因組后進(jìn)行dot blot 檢測(cè)，還可以用S9.6 做免疫沉淀，再進(jìn)行qPCR 分析和全基因組測(cè)序，此方法也叫做DNA∶RNA 免疫沉淀測(cè)序技術(shù)（DNA∶RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing，DRIPseq）［85］。為了提高DRIP-seq 的分辨率、特異性或敏感性，研究者基于DRIP 進(jìn)行了改進(jìn)，例如，將DRIP 與亞硫酸氫鹽印跡技術(shù)相結(jié)合，可以識(shí)別R-loop 的ssDNA，如bisDRIPseq （bisulfite DNA∶RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing）技術(shù)［86］。S1-DRIP-seq 通過(guò)S1 核酸酶切，在超聲前去除R-loop 的非模板ssDNA，以防止其在免疫沉淀過(guò)程中重新和模板DNA退火，但是其對(duì)AT富集的區(qū)域的檢測(cè)有偏好性［20］。DRIPc-seq 是用DNase I處理后，將R-loop中的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA之后再進(jìn)行測(cè)序［5］。除此之外，近年來(lái)也發(fā)明了基于S9.6抗體開(kāi)發(fā)的CUT&TAG和CUT&RUN技術(shù)［87］。

DRIP-seq技術(shù)也有局限性。S9.6抗體對(duì)R-loop的親和力僅為對(duì)雙鏈RNA 親和力的5 倍，因此可能與雙鏈RNA結(jié)合造成大量的假陽(yáng)性結(jié)果［88］，尤其是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)AU 富集的雙鏈RNA 會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果［62］。而DRIP 技術(shù)檢測(cè)到的R-loop 所在DNA 區(qū)域的長(zhǎng)度也依賴(lài)于其打斷基因組的手段，如超聲或酶切，這對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)帶來(lái)一定的影響。此外，DRIP-seq 流程中的甲醛交聯(lián)會(huì)增加假陽(yáng)性檢測(cè)的數(shù)量。DRIP-seq不僅可以檢測(cè)到R-loop，還可以檢測(cè)到它們相關(guān)的DNA 和RNA 片段［89］。RNA 的一部分可能參與R-loop的形成，而其他部分并沒(méi)有參與，既包含單鏈區(qū)域，也包含雙鏈區(qū)域，這種情況無(wú)法被DRIP-seq 鑒別區(qū)分。因此，在利用S9.6 檢測(cè)R-loop時(shí)，用RNase H1做陰性對(duì)照是必要的。

針對(duì)這些問(wèn)題，付向東實(shí)驗(yàn)室利用失去催化活性的RNase H1 開(kāi)發(fā)了一種更精確地檢測(cè)R-loop 的手段，稱(chēng)為R-ChIP［90］。R-ChIP是在細(xì)胞中表達(dá)外源催化失活的RNase H1。這種失活的RNase H1 在不清除R-loop 的前提下結(jié)合RNA∶DNA 雜合鏈。隨后， 進(jìn)行RNase H1 的染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin Immunoprecipitation，ChIP），并構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。RNase H1對(duì)RNA∶DNA雜合鏈的親和力是雙鏈RNA的25倍，雙鏈DNA的100倍，相較于DRIP-seq 準(zhǔn)確性更高［91］。同時(shí)，R-ChIP具有可在體內(nèi)檢測(cè)、分辨率更高等優(yōu)點(diǎn)。但R-ChIP 也存在一些缺點(diǎn)，如RNaseH1 有可能只結(jié)合基因組中一部分R-loop而非全部。此外，由于與其他因子的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)或某些特殊的DNA/染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，外源RNase H1可能無(wú)法完全結(jié)合部分R-loop。由于RNase H1和S9.6抗體識(shí)別的是RNA∶DNA雜交鏈而非整個(gè)R-loop結(jié)構(gòu)，所以迄今為止的R-loop檢測(cè)方法都不能將R-loop 與其他類(lèi)型的RNA∶DNA雜合鏈區(qū)分開(kāi)來(lái)。基于RNase H1的HBD結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別并結(jié)合R-loop的機(jī)制，研究者進(jìn)一步開(kāi)發(fā) 了 基 于RNase H1 的MapR、 BisMapR［92］、CUT&RUN、CUT&TAG［87］等一系列技術(shù)。

Table 2 Technologies for detecting R-loop表2 檢測(cè)R-loop的技術(shù)

5 總結(jié)與展望

過(guò)去幾十年對(duì)R-loop 的研究加深了對(duì)基因組穩(wěn)定性和基因表達(dá)調(diào)控的理解，并為一些疾病的發(fā)生發(fā)展和治療提供了新的思路，但仍有一些科學(xué)問(wèn)題亟待解決。在正常的生理狀況下，基因組上的R-loop 保障了表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 修復(fù)等生理過(guò)程的正常進(jìn)行。但是，一些病理性的R-loop 又會(huì)導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂，引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性。那么，什么類(lèi)型的R-loop 是對(duì)生物體有益的？ 什么類(lèi)型的R-loop 會(huì)導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性以至于引起細(xì)胞死亡或疾病的發(fā)生呢？基因組上不同區(qū)域的R-loop 是否具有特定的功能？不同調(diào)控因子是否調(diào)控基因組上所有的R-loop，還是只調(diào)控特定區(qū)域的R-loop？針對(duì)這些問(wèn)題，將R-loop進(jìn)行歸類(lèi)分析，并將其特征與不同的功能對(duì)應(yīng)聯(lián)系起來(lái)，可以更好地理解R-loop 的調(diào)控機(jī)制與功能。除此之外，目前的研究中對(duì)R-loop 的調(diào)控機(jī)制與功能的區(qū)分并不嚴(yán)謹(jǐn)。例如，DNA 損傷會(huì)導(dǎo)致R-loop 的積累，但過(guò)多的R-loop 也會(huì)導(dǎo)致DNA 損傷。那么在實(shí)驗(yàn)中觀察到的DNA 損傷現(xiàn)象，究竟是R-loop 的成因，還是R-loop 積累的結(jié)果？除了DNA損傷之外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)等生理過(guò)程與R-loop 的上下游關(guān)系也需要謹(jǐn)慎對(duì)待?？偠灾琑-loop作為一個(gè)高度動(dòng)態(tài)、調(diào)控精細(xì)、功能強(qiáng)大且普遍存在的結(jié)構(gòu)，探索其調(diào)控機(jī)制和功能可以幫助我們更深入了解基因組上多種多樣的生理過(guò)程，為治療與R-loop相關(guān)的疾病提供新的思路。