多聚磷酸鹽聚合酶VTC復合體的結構和功能*

劉 偉 葉 升

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

磷在生命活動中扮演核心角色，它是生物遺傳物質核酸和細胞膜磷脂的重要組成成分，是生物細胞能量代謝的載體物質三磷酸腺苷（ATP）的結構元素，還是動物骨骼和牙齒的主要成分。自然界中大多數(shù)磷以不溶性的無機磷存在于礦物、土壤、巖石中，只有少量的可溶性磷，主要以無機磷酸鹽（Pi）的形式為生命所利用。細胞對磷酸鹽的需求隨著細胞生理情況的變化而變化，在細胞分裂間期的S 期因DNA 復制而達到峰值。然而磷酸鹽是所有核苷酸降解反應的產物，細胞質中過量的磷酸鹽會改變核苷酸降解反應的平衡，降低反應的自由能，從而影響相關的細胞生理。細胞質磷酸鹽供應不足會影響細胞的生長和分裂，而磷酸鹽過量則會抑制細胞生理活動從而對細胞造成傷害。因此，細胞需要維持細胞質中磷酸鹽的穩(wěn)態(tài)，在滿足自身對磷酸鹽需求的同時防止細胞質中產生過多的磷酸鹽對細胞造成傷害。磷酸鹽穩(wěn)態(tài)在所有生物體中都是一個受嚴格調控的過程，其功能障礙會導致人類腎范科尼綜合征（Fanconi syndrome）［1］、植物生長遲緩［2-3］和微生物致死［4］等多種功能紊亂。

生物體從多個層次維持機體的磷酸鹽穩(wěn)態(tài)。在機體層面，多細胞生物（如人類）可以通過腎臟的過濾和重吸收維持體液循環(huán)中的Pi濃度［5-6］。他們可以獲取骨骼中的磷灰石作為巨大的Pi儲備。同時，人類組織在質膜中廣泛表達受調節(jié)的Pi輸出者（XPR1）［7］，這表明它們也可能保持對胞漿Pi峰值的保護。有趣的是，XPR1 也被發(fā)現(xiàn)與Pi在腎臟腎小管的重吸收有關［1］。對于植物來說，植物生長需要大量的Pi，但大多數(shù)土壤中的Pi水平是有限的，并且不斷變化［8］。為了在自然界中生存克服這種Pi營養(yǎng)“脅迫”，植物不僅進化出了強大的Pi吸收和轉運能力，還進化出了復雜的調控機制［9］，將多余的Pi儲存在液泡中，以應對土壤Pi的變化狀態(tài)。事實上，大部分（>90%）游離的Pi儲存在植物細胞的典型液泡中［10］。在單細胞生物如釀酒酵母中，Pi的感知、獲取和儲存主要由磷酸響應信號通路（稱為PHO 通路）介導［11］。在Pi缺乏的情況下，PHO 操縱子被觸發(fā)，該操縱子控制一組旨在提高Pi攝入和Pi利用的基因。在釀酒酵母中，Pi獲取系統(tǒng)由4個定位在細胞膜的Pi轉運蛋白組成，其中2個低親和力Pi轉運蛋白質，即Pho87、Pho90普遍表達［12］，而2 種高親和力Pi轉運蛋白Pho84 和Pho89 由PHO 途徑調節(jié)［13］。最初被認為是低親和力Pi攝取系統(tǒng)的Pho91 最近被證明位于液泡膜上，并參與將Pi從液泡輸出到細胞質［14］。有趣的是，Pho87、Pho90 和Pho91 都具有SPX 結構域，該結構域通常存在于參與調節(jié)Pi穩(wěn)態(tài)的蛋白質中［15］。

為了在Pi的生物合成需求和胞質Pi濃度過高的風險之間實現(xiàn)微妙的平衡，細胞以無機多聚磷酸鹽（polyP）的形式將Pi儲存在膜結合的酸鈣小體樣細胞器中［16］。酸鈣小體是從細菌到哺乳動物都保守的一類膜結合細胞器，但其功能尚不清楚。酵母細胞有一個類似的酸鈣小體樣細胞器，即液泡，它攜帶所有集中在酸鈣小體中化合物的轉運蛋白［17］。polyP 是由數(shù)十至數(shù)百個正磷酸鹽殘基通過高能磷酸酐鍵連接而成，存在于所有生物中。polyP 參與真核生物中的許多過程，包括激活炎癥反應［18-19］、促進血液凝固［20］、促進軟骨的發(fā)育和再生［21］、誘導癌細胞凋亡［22］、蛋白質多聚磷酸化修飾［23］以及調節(jié)離子通道活性［24］等。polyP 儲存在酸性鈣小體管腔中，同時多磷酸酶（Ppn1/Ppn2）也位于該管腔中。假設這些酶可以水解polyP，這可能允許釋放的Pi再輸出進入細胞質［25-26］。因此，酸鈣小體樣細胞器可能是胞漿Pi的重要緩沖裝置。

釀酒酵母液泡轉運蛋白伴侶（vacuolar transporter chaperone，VTC）復合體作為已知的真核生物多聚磷酸鹽聚合酶，利用ATP在胞質中合成polyP，并將其轉運到液泡中儲存起來以維持細胞內Pi穩(wěn)態(tài)。近年來，隨著VTC 復合體的聚合酶和轉位酶功能被鑒定［27-28］，polyP 合成和轉運的偶聯(lián)機制也被確定［29］。雖然目前已經獲得了一些結構域的結構［27-28］，但是有限的信息限制了生理狀態(tài)下VTC 復合體的組裝、調控以及激活機制的研究。最近發(fā)表的完整VTC 復合體的結構極大地推動了對VTC復合體結構和功能的理解。

1 VTC復合體的研究現(xiàn)狀

釀酒酵母VTC 復合體包含了至少4 個亞基：Vtc1、Vtc2、Vtc3和Vtc4，同源蛋白質在其他低等生物中也已經被發(fā)現(xiàn)［30-31］。Vtc1是一個僅包含3次跨膜螺旋的小整合膜蛋白。Vtc2、Vtc3 和Vtc4 在序列上高度同源，在C 端與Vtc1 共享類似的跨膜結構域，并具有在Pi穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用的N端SPX（Syg1/Pho81/XPR1）結構域和隧道形狀的中心結構域（圖1）。 酵母中Vtc4 的中心結構域（Vtc4189-480）已經被證實具有多聚磷酸鹽聚合酶活性，而Vtc2 或Vtc3 的中心結構是無催化活性的［27］。最近還發(fā)現(xiàn)了VTC 復合體可能的第5 個亞基Vtc5［32］，該亞基由具有和Vtc2、Vtc3和Vtc4相似的結構域組成，但是序列相似性很低。Vtc5 對VTC 復合體的活性不是必需的，表明它是一個可選的調節(jié)亞基［32］。

Fig. 1 Domain composition of VTC complex subunits圖1 VTC復合體亞基的結構域組成

Vtc4的中心結構域（Vtc4189-480）的結構揭示了一個隧道狀的催化合成口袋（圖2），而且重組表達的Vtc4 中心結構域具有聚合酶活性，能夠利用ATP合成polyP［27］。Vtc4中心結構域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸（K200、R264、R266、K281、R361、K458）、絲氨酸（S457）和酪氨酸（Y359），這些氨基酸已經被證實在polyP合成中發(fā)揮著重要作用。Vtc4189-480與Pi、PPi、底物類似物AppNHp （adenosine-5'-[(β,γ)-imido]triphosphate） 和polyP 的晶體結構也已經被獲得［27］。從Pi、PPi、AppNHp 到polyP，這些晶體結構或許暗示著VTC復合體利用ATP合成polyP并將其轉運的過程。同時，PPi能夠高度刺激Vtc4 催化結構域的polyP合成活性，Pi和PPPi刺激效果較弱。因此，PPi可能提供啟動合成polyP鏈的引物。Vtc4的催化結構域對ATP 和dATP 具有相似的親和力，對CTP 和GTP 的親和力僅僅低5 倍。在晶體結構中，核苷部分沒有結構，蛋白質僅與底物三磷酸腺苷的三磷酸部分發(fā)生相互作用。polyP 結合在Vtc4的隧道內，該隧道由保守的堿性殘基組成，并包含活性位點。Vtc4 的中心結構域在結構上與RNA 三磷酸酶Cet1 相似［27］。雖然這些晶體似乎暗示著polyP 合成和轉運的過程，但是由于缺乏完整VTC復合體的結構，難以確定生理狀態(tài)下的polyP合成和轉運過程。

Fig. 2 The crystal structure of the central domain of Vtc4 that combines different substrates and products圖2 Vtc4的中心結構域與不同底物和產物的晶體結構

盡管VTC 蛋白的跨膜結構域和中心結構域序列在多細胞生物中并不保守，但是位于N端的SPX結構域在植物、蒼蠅和哺乳動物中都被發(fā)現(xiàn)。包含SPX結構域的蛋白質已經被發(fā)現(xiàn)在調控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。Vtc4 SPX 結構域的晶體結構顯示包含6個α螺旋，其中2個小螺旋αI和αII形成N端螺旋發(fā)夾，以及由2 個長螺旋αIII 和αIV 以及C端2 個較小的螺旋αV 和αVI 形成的三螺旋束［28］。SPX結構域具有一個大的帶正電荷的表面，分布著眾多的賴氨酸殘基，這些賴氨酸殘基在不同物種含SPX結構域的蛋白質中是高度保守的（圖3）。

Fig. 3 The structure of SPXScVtc4 reveals a conserved ligand binding surface圖3 SPXScVtc4的結構揭示了保守的配體結合表面

SPX 結構域能夠與含磷酸鹽的配體相互作用，但對Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性。InsP6激酶Kcs1（其產生肌醇焦磷酸（PP-InsP）信號分子）的缺失消除了VTC 產生的polyP 儲存，PP-InsP 可能調控體內polyP 的積累［33］。Gerasimaite 等［34］化學合成了5-InsP7，一種Kcs1 反應產物，并發(fā)現(xiàn)它在濃度高于100 nmol/L 時能夠顯著刺激VTC 催化合成polyP。相反，Pi和SO42-僅在毫摩爾濃度下才能激活VTC 復合體，InsP5、InsP4或InsP3不能刺激VTC催化合成polyP［28］。后續(xù)體內和體外證據(jù)都表明，5-InsP7是SPX 依賴性VTC 復合物的生理相關刺激因子。由于化學合成的5-InsP7含量很低，同時SPX結構域對5-InsP7和InsP6具有相似的親和力，因此InsP6可以當做5-InsP7的商業(yè)化替代品用于后續(xù)功能和結晶實驗。SPX結構域保守的堿性表面簇殘基突變降低了VTC復合體的polyP合成活性，相反發(fā)現(xiàn)唯一一對突變Vtc3K126A/Vtc4K129A顯著增強了VTC 復合體的polyP 合成活性［28］。研究還發(fā)現(xiàn)，Vtc3K126A/Vtc4K129A雙突變也增加了酵母細胞內polyP含量［34］，這或許暗示雙突變的VTC 復合體可能處于激活狀態(tài)。

VTC 復合體可能以兩種穩(wěn)定的亞復合體形式存在，Vtc4/Vtc2/Vtc1 復合體和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體。熒光定位實驗顯示：Vtc3 主要位于液泡膜上；Vtc2 的位置隨環(huán)境中Pi濃度變化而變化［27］。當細胞處于Pi饑餓狀態(tài)，Vtc2 主要定位在液泡膜上；當細胞處于Pi豐富的環(huán)境中，Vtc2在細胞內分布比較分散，分布在內質網(wǎng)膜、細胞核膜、線粒體膜和細胞膜等［27］。細胞可能需要存在兩種不同的VTC亞復合體以創(chuàng)建具有不同調節(jié)的polyP池來響應不同的應急壓力。與此相一致，polyP 不僅被發(fā)現(xiàn)集中在酸鈣小體樣液泡中，在細胞核中也有一個獨特的polyP池，通過多聚磷酸化控制拓撲異構酶1（Top1）的定位和活性［23］。

近年來，關于VTC 復合體的研究取得了長足的進步，但是幾個相關的基本問題仍然懸而未決。首先，生理狀態(tài)下的VTC 復合體是如何組裝的？雖然Vtc2 和Vtc4 中心結構域的結構［27］以及Vtc4 SPX 結構域的結構［28］陸續(xù)被獲得，然而這些結構提供了有關VTC 復合體的化學計量比和組裝的有限信息。因此，獲得完整VTC 復合體的結構將有助于很好地理解VTC 復合體的組裝。其次，VTC復合體的功能完整性。VTC 復合體不僅是一種polyP 聚合酶，也是一種polyP 易位酶。為了避免polyP在細胞質中積累的毒性，polyP合成和立即轉運到液泡中是耦合的［29］。然而，這種耦合機制仍是不清楚的。最后，VTC復合體是如何調控polyP的合成？當胞漿Pi濃度足夠高時，VTC復合體應合成polyP；而當胞漿Pi濃度較低時，VTC 復合體應關閉polyP 的合成，以避免從胞漿中耗盡Pi。VTC復合體的活性受到肌醇磷酸信號分子的調節(jié)，包括高度磷酸化、可擴散的肌醇多磷酸鹽（InsPs）和肌醇焦磷酸鹽（PP-InsPs）［28，34］。但是，目前尚不清楚這種調控機制。最近發(fā)表的完整VTC 復合體的結構對以上科學問題提出了見解，下面將著重介紹。

2 VTC復合體的結構

近年來，Vtc2和Vtc4中心結構域的結構［27］以及Vtc4 SPX結構域的結構［28］陸續(xù)被獲得，然而這些結構提供了有關VTC 復合體的化學計量比和組裝的有限信息。最近，完整VTC 復合體的結構被發(fā)表，包括本實驗室解析的處于非激活態(tài)（apo state）的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體［35］以及華中農業(yè)大學劉主課題組［36］解析的結合InsP6的激活態(tài)Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1 復合體。這兩篇文章都報道了Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構，結構揭示了一個意想不到的異源五聚體，包含1 個Vtc4、1 個Vtc3和3個Vtc1亞基（圖4）。每個亞基的3次跨膜螺旋（TM1~3）以贗對稱的方式組裝，形成圓柱形五聚體跨膜結構域。Vtc3 的胞質結構域和Vtc4 的胞質結構域形成非對稱的異源二聚體。考慮到Vtc2 和Vtc3 在序列上是高度同源的，Vtc4/Vtc2/Vtc1復合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1復合體相似的化學計量比和組裝方式。

在本課題組的文章中，基于結構分析和功能數(shù)據(jù)，對polyP 的合成和轉運、polyP 通道的門控機制及VTC 復合體的激活機制進行了研究。結構和體外polyP 合成實驗都支持VTC 偶聯(lián)polyP 聚合酶和轉位酶活性。同時，利用純化的液泡和5-InsP7以及1,5-InsP8等生理性配體對VTC 的功能展開了研究。結果發(fā)現(xiàn)，純化的VTC 復合體以ATP-和肌醇多聚磷酸鹽（PP-InsPs）依賴的方式合成polyP。進一步分析發(fā)現(xiàn)，只有Vtc4 的SPX 結構域對于polyP 的合成和PP-InsPs 調控是至關重要的，而Vtc3 主要通過磷酸化的loop 來調控polyP 的合成。該結構中，跨膜區(qū)形成一個polyP選擇性通道，可能采用靜息態(tài)構象，其中Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋（HH）限制了polyP的進入。Vtc4的催化中心結構域位于贗對稱polyP 通道的頂部，為新合成的polyP 創(chuàng)造了一個強正電性通路，該通路可以將合成與易位耦合。Vtc4 的水平螺旋以及亞基間多對保守的鹽橋形成的“離子鎖”有助于探究polyP通道的門控機制?；谝陨辖Y構和功能信息，推測了一個簡化的VTC激活機制模型。

Fig. 4 Structure of the intact VTC complex圖4 完整VTC復合體的結構

在華中農業(yè)大學劉主課題組的文章中，作者利用Vtc4 中心結構域的三突變（R264A/R266A/E426N）和PP-InsPs的商業(yè)化替代品InsP6解析了處于激活態(tài)的VTC的結構。他們發(fā)現(xiàn)，PP-InsP只是特異性結合在SPXVtc4，而非SPXVtc3，暗示只有SPXVtc4發(fā)揮感知PP-InsP 信號的功能。同樣地，作者也證實VTC偶聯(lián)polyP的合成和轉運。此外，作者運用smFRET 技術，在單分子水平研究了VTC感知PP-InsP 信號后結構的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，PP-InsP 作為信號分子，它結合Vtc4，通過別構調控，誘導VTC的構象發(fā)生變化，使polyP的合成結構域向跨膜通道靠近，VTC 從抑制態(tài)轉變?yōu)榧せ顟B(tài)，開啟polyP的合成與轉運。

雖然這兩個結構是高度相似的，但是也存在一些差異。首先，在apo state中，Vtc4中心結構域的隧道狀口袋中包含三磷酸鹽-Mn2+，這可能與復合體的內源性表達相關，相反，在InsP6結合的激活態(tài)中，Vtc4 中心結構域的隧道狀口袋被一個InsP6分子占據(jù)，這或許是因為1 mmol/L 的InsP6并非生理濃度而導致的非特異性結合。除此之外，結構中還包含另外2個InsP6分子，1個結合在Vtc4 SPX結構域的肌醇多磷酸鹽（PP-InsPs）結合表面，另外1 個結合在Vtc3 和Vtc4 的中心結構域之間，可能促進了這兩個結構域的結合（圖4）。其次，在靠近胞質側轉運通道的入口處，在apo state中，Vtc4的一段水平螺旋（horizonal helix，HH）橫跨在入口，堵塞polyP的進入，相反，在InsP6結合的激活態(tài)中，兩個磷酸鹽分子在通道入口處（圖4）。再次，在apo state 中，由Vtc1 的M42、Vtc3 的L716和Vtc4的L640 組成了轉運通道的最窄點，直徑僅有4 ?，小于polyP 的鮑林半徑（3 ?），不允許polyP 通過，而在InsP6結合的激活態(tài)中，Vtc1 的R31、Vtc3的R709和Vtc4的R629組成了轉運通道的最窄點，直徑僅有3 ?，同樣地不允許polyP 通過。最后，在apo state 中，內源性表達的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體具有完全的polyP 合成活性，相反，在InsP6結合的激活態(tài)中，包含3 個突變的Vtc4R264A/R266A/E426N/Vtc3/Vtc1復合體的polyP合成活性被完全廢除。這兩個處于不同狀態(tài)的結構展示了完整VTC 復合體的化學計量比和組裝方式，極大地推動了后續(xù)VTC復合體的功能研究。

3 VTC復合體的功能

酵母中polyP 聚合酶是一種大型膜蛋白復合物，最初被命名為VTC［30］。在其polyP聚合酶的催化活性被確定之前，VTC 復合物被發(fā)現(xiàn)是V-ATP酶穩(wěn)定性和運輸、酵母液泡膜融合和微自噬所必需的［31，37-38］，但是目前并不清楚是polyP還是VTC復合物本身參與了這些過程。VTC 復合體作為唯一已知的真核生物polyP聚合酶，利用ATP在胞質中合成polyP，并將其轉運到液泡中儲存，以維持細胞內Pi穩(wěn)態(tài)。因此，VTC復合體具有polyP聚合酶和轉位酶的雙重功能。在細胞內，VTC 復合物的活性受到肌醇磷酸鹽信號分子的調節(jié)，包括高度磷酸化、可擴散的肌醇多磷酸鹽（InsPs）和肌醇焦磷酸鹽（PP-InsPs）［28，34］。具體研究詳述如下。

3.1 VTC復合體偶聯(lián)polyP的合成和轉運

VTC復合體不僅是一個polyP聚合酶，還是一個polyP 轉位酶。為了避免polyP 在胞質中的積累對細胞造成的毒害作用，polyP 的合成和立即轉運到液泡是偶聯(lián)的［29，39］。最近獲得的兩個完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構都清晰地支持這種偶聯(lián)機制［35-36］。

在完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構中，Vtc4的中心結構域和跨膜結構域是共價連接的（圖5）。Vtc4作為催化亞基，負責polyP的合成，Vtc4敲除顯著降低細胞內polyP含量［40］。Vtc4中心結構域的隧道狀口袋分布著眾多保守的堿性氨基酸（K200、R264、 R266、 K281、 R361、 K458）、 絲 氨 酸（S457）和酪氨酸（Y359），這些氨基酸已經被證實在polyP合成中發(fā)揮著重要作用［27，35］。一段由眾多堿性氨基酸（R196、 R253、 K256、 K291、K294、R373、K428、K455、R618）組成的蜿蜒曲折通道連接了Vtc4 中心結構域的活性位點和跨膜通道入口，暗示新生的polyP可能從此通道行進到跨膜孔，從而完成跨膜轉運。這一結構信息為polyP 合成和轉運的偶聯(lián)機制提供了理論支持。同時，這些堿性氨基酸突變成酸性氨基酸也已經被證實能夠顯著降低細胞內polyP的含量［35］。

Fig. 5 The structure of the Vtc4 /Vtc3 /Vtc1 complex supports a coupled mechanism of polyP synthesis and transport圖5 Vtc4/Vtc3/Vtc1復合體的結構支持polyP合成和轉運的偶聯(lián)機制

Vtc4、Vtc3和3個Vtc1的跨膜螺旋以贗對稱的方式排列成異源五聚體。每個亞基的TM1 螺旋形成圓柱體的內環(huán)作為polyP轉運的核心通道，每個亞基的TM2 和TM3 螺旋形成圓柱體的外環(huán)包裹著內環(huán)。在apo state 和InsP6-activated state 結構中，由于最窄點直徑都小于polyP直徑，因此，跨膜轉運通道都不允許polyP通過。同時也發(fā)現(xiàn)，在靠近胞質側轉運通道的入口處，在apo state中，Vtc4的一段HH 橫跨在入口，堵塞polyP 的進入，相反，在InsP6結合的激活態(tài)中，2個磷酸鹽分子在通道入口處（圖4）。由于2個結構被捕獲在不同的功能狀態(tài)，因此結構差異也是合理的。

生化實驗也顯示，單獨表達的Vtc4 中心結構域表現(xiàn)出很低的polyP合成活性，而完整的VTC復合體在體內具有很高的活性［27，29］，而且相比于去垢劑溶解的VTC 復合體，攜帶VTC 復合體的液泡表現(xiàn)出超過100 倍的polyP 合成活性［29］，這表明VTC 復合體的完全催化活性需要一個完整的膜環(huán)境。因此，提出polyP合成和轉運的偶聯(lián)機制也是合理的，其中來自跨膜區(qū)域的驅動力將新生的polyP 鏈拉入跨膜通道進行轉運，從而將帶負電的聚合物從帶正電的催化中心排出，并允許添加新的磷酸鹽殘基。

3.2 肌醇多磷酸鹽（PP-InsPs）調控polyP的合成

VTC復合體精確調控polyP的合成對于維持細胞內Pi穩(wěn)態(tài)是必需的。包含SPX結構域的蛋白質已經被發(fā)現(xiàn)在調控Pi穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用［41］。單獨表達的SPX 結構域能夠與含磷酸鹽的配體發(fā)生相互作用，但對Pi本身表現(xiàn)出很小的特異性和選擇性［28］。PP-InsPs 也被發(fā)現(xiàn)在控制酵母和哺乳動物細胞磷酸鹽穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用［42-43］。VTC復合體的polyP合成活性在體內收到肌醇焦磷酸鹽（5-InsP7和1,5-InsP8等）的調控［28］，同時肌醇磷酸鹽（InsP6）也被發(fā)現(xiàn)在體外能夠刺激VTC 復合體合成polyP［28，35-36］。

SPX結構域存在于所有真核生物中，并具有共同的序列和結構特征，保守的賴氨酸殘基形成肌醇多磷酸鹽和焦磷酸鹽的高親和力（亞微摩爾）結合位點［28］。純化的SPX 結構域在結合不同的肌醇多磷酸鹽或焦磷酸鹽異構體方面表現(xiàn)出相對較低的選擇性，并且它們的親和力隨化合物的凈電荷降低而降低（InsP8>InsP7>InsP6）［34］。與低選擇性形成鮮明對比的是，不同異構體的激動劑性質差異很大。例如，VTC復合體被1,5-InsP8強烈激活，但被攜帶相同數(shù)量磷酸基團的5-PPP-InsP5激活效果非常弱［34］。同樣地，5-InsP7激活VTC，而InsP6幾乎沒有作用［34］。因此，盡管肌醇多磷酸鹽具有極高的電荷密度及其類似的結合親和力，SPX結構域必須解碼配體的精確結構特征，并將其轉化為不同程度的活性。

釀酒酵母的基因組包含10 個編碼SPX 結構域的蛋白質，其中8種蛋白質具有與Pi代謝相關的功能。它們分別是：2 個低親和力Pi轉運蛋白質Pho87 和Pho90 定位在細胞膜上［13，44］；Pho91 位于液泡膜上并參與將Pi從液泡輸出到細胞質［14］；細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑Pho81［45］；甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶1（Gde1），可水解甘油磷酸膽堿，從而釋放膽堿和甘油3-磷酸，可作為Pi來源［46］；酵母gpa1 抑制劑（Syg1）［47］和Ydr089（最近被鑒定為Vtc5）［32］；多聚磷酸鹽聚合酶VTC復合體的3個 亞 基Vtc2、Vtc3 和Vtc4［48］。除 了Syg1 和Ydr089 之外，所有含有SPX 結構域的酵母蛋白都被證明是維持酵母中Pi穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子。

Vtc3和Vtc4 SPX結構域的結構是高度相似的，135個Cα原子的均方根偏差為1.7 ?。相比于Vtc4，Vtc3 的SPX 結構域在C 端還包含1 個額外的螺旋αVII，與αIV 和αVI 螺旋形成疏水相互作用（圖6）。兩個SPX 結構域都具有由螺旋αII 和αIV 上的多個保守賴氨酸殘基形成的帶正電荷的表面（圖6），并且可以與含磷酸鹽的配體相互作用，在之前的研究中猜測兩者都是PP-InsPs 的受體［28］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，不論是對SPX 結構域進行截斷［35］，還是對SPX 結構域上的保守賴氨酸殘基突變［36］，攜帶突變體的VTC復合體體外polyP合成實驗結果都表明，只有Vtc4 的SPX 結構域能夠作為PP-InsPs感受器，響應polyP合成和PP-InsPs調節(jié)。與此相一致，在InsP6-activated state 結構中，InsP6只結合在Vtc4 的SPX 結構域上（InsP6A）［36］。同時，在Vtc3 和Vtc4 的中心結構域之間也發(fā)現(xiàn)了一個InsP6B，可能促進了這兩個結構域的結合［36］。

除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，Vtc3 通過磷酸化的loop 調控polyP 的合成［35］。在Vtc3 的非催化中心結構域中存在一段不同尋常的loop（殘基234~292），在該loop 的C 端包含一簇磷酸化位點。研究人員通過取代6 個絲氨酸殘基（S263、S265、S267、S269、S270、S274）為丙氨酸或天冬氨酸來模擬該loop 的非磷酸化和磷酸化狀態(tài)，證實該loop 的磷酸化對polyP 的合成具有負調節(jié)作用。結合PP-InsPs 對VTC 復合體的調控作用，該loop 可以增強VTC調節(jié)polyP合成活性的動態(tài)范圍，支持在Pi缺乏的情況下完全停止polyP 合成，同時在Pi充足時保持完全激活的潛力。

Fig. 6 Structure of the SPX domain of the VTC complex圖6 VTC復合體的SPX結構域的結構特征

3.3 VTC復合體的激活機制

完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構揭示了一個意想不到的異源五聚體組裝，包含1 個Vtc4、1 個Vtc3 和3 個Vtc1 亞基。Vtc4 中心結構域與跨膜區(qū)的連接以及二者之間形成的轉運通道結構清晰地支持polyP合成和轉運的偶聯(lián)機制。Vtc4的SPX結構域作為PP-InsPs 感受器，響應polyP 合成和PP-InsPs 調節(jié)。Vtc3 通過磷酸化的loop 調控polyP的合成?；谶@兩個處于不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體結構和功能信息，允許大家合理地推測一個VTC復合體的激活機制。

在apo state結構中，研究人員提出了一種可能的polyP通道門控機制［35］。首先，作者發(fā)現(xiàn)由TM1螺旋組成的polyP 通道的五重對稱性被破壞。同時，觀察到形成界面的2個跨膜結構域具有不同的相對位置，其中Vtc1（β）-Vtc1（γ）和Vtc3-Vtc4緊密堆積，Vtc1（γ）-Vtc3松散堆積，Vtc1（α）-Vtc1（β）和Vtc4-Vtc1（α）介于二者之間。相應地，Vtc3-Vtc4掩埋了最多的蛋白質表面積（4 150 ?2），接下來分別是Vtc1（β）-Vtc1（γ） （2 920 ?2）、Vtc4-Vtc1（α）（2 870 ?2）和Vtc1（α）-Vtc1（β） （2 660 ?2）。Vtc1（γ）- Vtc3 相互作用界面掩埋了最少的蛋白質表面積（2 350 ?2），這一數(shù)據(jù)也與觀察到的VTC 通道不對稱性相一致。有趣的是，在以疏水相互作用為主的亞基相互作用界面中心發(fā)現(xiàn)了幾對特殊的鹽橋，將其命名為亞基間“離子鎖”。其中Vtc1 的E30 和R83、Vtc3 的E704 和R762，以 及Vtc4 的E628 和R681 都是非常保守的（圖7a）?；诖?，作者假設polyP通道在靜息狀態(tài)下被捕獲，入口由Vtc4 的閂鎖狀水平螺旋固定。Vtc4 的水平螺旋在通道入口處的不對稱排列對polyP通道施加了不對稱的力，導致亞基間相互作用界面的相對位置不同。3 個松散堆積的亞基間相互作用界面，加上2個緊密堆積的亞基間相互作用界面，使得由TM1螺旋形成的通道直徑從胞質側向液泡內側逐漸變窄，形成一個可能用作門控的最窄點。亞基間的“離子鎖”可以將各亞基維持在一起。然而，在polyP 通道打開期間，水平螺旋閂鎖被抬起，VTC復合體的各亞基被“離子鎖”拉在一起，可能導致亞基之間形成所有的5個“離子鎖“。在這種狀態(tài)下，TM1 螺旋可能在胞質側向內傾斜，在液泡側向外傾斜，從而打開通道（圖7b）。

相反，在InsP6-activated state 結構中，作者認為PP-InsPs 的結合使得Vtc4 的中心結構域向跨膜通道入口靠近，從而偶聯(lián)polyP 的合成和轉運［36］。作者認為Vtc4 中心結構域的取向主要由Vtc4 中心結構域與跨膜結構域間的連接以及與Vtc1（α）的N端（殘基1~21）之間相互作用來維持。其中Vtc1（α） N端的敲除會降低VTC復合體的催化活性，完全廢除液泡polyP的產生。為了闡明Vtc1的N端缺失是否會導致Vtc4 催化結構域的運動，作者進行了單分子熒光共振能量轉移（smFRET）分析，這是一種單分子水平表征蛋白質動力學和構象變化的方法。實驗結果顯示，InsP6的結合使得Vtc4 的中心結構域靠近跨膜結構域，遠離跨膜結構域。而且，Vtc1 的N 端缺失會導致VTC 復合體不再被InsP6激活。

基于處于不同功能狀態(tài)的2 種Vtc4/Vtc3/Vtc1復合體的結構，本課題組推測了一個可能的VTC復合體的激活機制（圖7c）。我們認為VTC復合體包含1個polyP聚合酶和1個polyP通道，并在非活性狀態(tài)和活性狀態(tài)之間平衡存在。在非活性狀態(tài)，Vtc4 的中心結構域遠離跨膜通道，polyP 合成和轉運的偶聯(lián)機制被破壞，具有很低的聚合酶活性，同時Vtc4 的水平螺旋HH 堵塞在通道入口使得polyP轉運通道處于關閉狀態(tài)；在肌醇磷酸等信號分子的刺激下，Vtc4的中心結構域在Vtc1（α） N端的幫助下靠近polyP 轉運通道，完成polyP 合成和轉運的偶聯(lián)，同時，Vtc4的水平螺旋HH遠離通道入口使得polyP轉運通道處于開放狀態(tài)，VTC復合體從非活性狀態(tài)快速轉變成活性狀態(tài)，高效催化ATP 合成polyP。

Fig. 7 Activation mechanisms of the VTC complex圖7 VTC復合體的激活機制

進一步，之前的研究也報道了液泡polyP 的合成需要一個跨膜電化學勢能，可能由位于液泡上的V-ATPase 提供［29，49］。在體內，通過添加V-ATPase的抑制劑可以抑制液泡polyP 的合成；同時，V-ATPase 亞基Vph1 的敲除會使得酵母細胞內polyP含量降低20%（相比野生型）［29］。基于polyP合成缺陷突變體的高通量篩選已經識別了超過250種相關基因，其中也包括V-ATPase 的幾個亞基［50］。因此，跨膜區(qū)內外的質子梯度及其對細胞應激的變化或許將調節(jié)VTC 的活性，如通道本身的構象變化，從而刺激polyP的合成和跨膜轉運。

4 總結與展望

釀酒酵母VTC復合體作為已知的真核polyP合成酶，通過偶聯(lián)polyP的合成和轉運過程來維持細胞內Pi穩(wěn)態(tài)。近十年來，隨著VTC 復合體的相關研究逐漸增多，其結構信息和作用機制也越來越清晰。最近發(fā)表的完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構極大地推動了對VTC 復合體結構和功能的理解。完整Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體的結構揭示了一個異源五聚體組裝，結構和功能信息都支持polyP合成和轉運的偶聯(lián)機制。Vtc4的SPX結構域作為PP-InsPs感受器，響應polyP 合成和PP-InsPs 調節(jié)，同時Vtc3 通過磷酸化的loop 調控polyP 的合成。基于Vtc2 和Vtc3 在序列上的高度同源，Vtc4/Vtc2/Vtc1復合體可能采取和Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體相似的化學計量比和組裝方式。目前還不清楚酵母細胞內為什么存在兩種VTC復合體。相比Vtc4/Vtc3/Vtc1復合體只定位在液泡膜上，Vtc4/Vtc2/Vtc1 復合體在酵母細胞的定位隨環(huán)境中Pi的濃度而發(fā)生變化，這種廣泛的分布（細胞核膜、線粒體膜、細胞膜和液泡膜等）或許暗示Vtc4/Vtc2/Vtc1 復合體不僅具有polyP 聚合酶和轉位酶活性，或許還參與細胞內其他生物學功能。因此，解析Vtc4/Vtc2/Vtc1 復合體的結構對于理解VTC 復合體的作用機制也是十分有幫助的。最近，雖然發(fā)表了處于兩種不同功能狀態(tài)的Vtc4/Vtc3/Vtc1 復合體結構，但是二者結構的高度相似性或許暗示VTC 復合體的激活可能不需要大的構象轉變，目前的結構信息還不足以闡明VTC 復合體的分子作用機制。因此，未來獲得其他功能狀態(tài)的結構（包括polyP催化合成的不同階段以及轉運通道完全開放狀態(tài)的結構等）對于理解VTC復合體的分子作用機制是十分重要的。