RhoB的翻譯后修飾與細(xì)胞命運(yùn)*

曾濤玲 王洪睿

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361102）

謹(jǐn)以此文獻(xiàn)給鄒承魯先生百年誕辰，先生一生致力于科學(xué)研究，治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，堅(jiān)持真理，展示了一代學(xué)術(shù)大師的領(lǐng)袖風(fēng)范，實(shí)為我等后輩之楷模。

Rho 家族小G 蛋白屬于Ras 超家族小GTP 酶，在細(xì)胞骨架重組、基因表達(dá)及細(xì)胞周期的調(diào)控中起著重要的開關(guān)作用［1-2］。目前已知Rho家族有20多個(gè)成員，其中RhoA、Rac1 和Cdc42 的研究最為廣泛和深入，特別是關(guān)于它們?cè)诩?xì)胞骨架、細(xì)胞極性以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面所起的關(guān)鍵調(diào)控作用方面的研究［3］。RhoA、RhoB 和RhoC 同屬Rho 亞家族，然而，盡管它們都參與了細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程，它們的細(xì)胞生物學(xué)功能和特性卻不盡相同，在包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用也有很大的不同［4］。近年來，關(guān)于RhoB的功能及其在疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用的研究也受到越來越多的關(guān)注。

與RhoA 促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用不同，過表達(dá)RhoB 的細(xì)胞生長(zhǎng)更為緩慢，并易于發(fā)生凋亡。敲低內(nèi)源的RhoB后，癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物表現(xiàn)出不敏感性，凋亡比例明顯下降，并且小鼠腹腔注射RhoB-/-腫瘤細(xì)胞的成瘤效率明顯高于RhoB+/+細(xì)胞［5-6］。此外，在化學(xué)誘變劑處理的情況下，RhoB敲除型小鼠的皮膚癌癥發(fā)病率要明顯高于野生型小鼠［7］。同時(shí)，臨床樣本也顯示，隨著肺癌和頭頸癌等惡性程度的增加，RhoB 的蛋白質(zhì)水平呈逐漸下降的趨勢(shì)［8-9］，這些研究結(jié)果表明RhoB 是個(gè)重要的抑癌因子［10-12］。然而，隨著對(duì)RhoB研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，在一些類型的腫瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌中，RhoB 很可能起著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用［13］。RhoB在不同類型的腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有不同作用的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步的深入研究，然而目前對(duì)RhoB調(diào)控的研究大都停留在其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控上，關(guān)于RhoB蛋白的翻譯后修飾，特別是除了脂化修飾以外的其他翻譯后修飾對(duì)其功能影響的研究仍然十分缺乏。

1 RhoB的脂化修飾

RhoA、RhoB 和RhoC 具有很高的同源性（~85%），與RhoA 和RhoC 的氨基酸序列相比，RhoB 最大的不同是其C 端的氨基酸序列。除了C端保守的CAAX 序列（其中C=Cys，A=aliphatic（脂肪族氨基酸），X=any amino acid（任意氨基酸））中的半胱氨酸殘基（Cys）可以被脂化修飾，相比于RhoA 和RhoC，RhoB 的C 端還有另外兩個(gè)半胱氨酸殘基（Cys189 和Cys192）也可以被脂化修飾。RhoA 和RhoC 的CAAX 序列中的半胱氨酸殘基只可以被香葉酰香葉?；╣eranylgeranyl）修飾，而RhoB 的CAAX 序列中的半胱氨酸殘基既可以被香葉酰香葉?；揎?，也可以被法尼基（farnesyl）修飾。此外，RhoB 的Cys189 和Cys192 還可以被棕櫚?；╬almitoyl）修飾［4］（圖1）。

Fig. 1 Domain organization of Rho GTPases圖1 Rho家族蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖

RhoB的C端脂化修飾的可變性使得RhoB在細(xì)胞內(nèi)的定位與RhoA 和RhoC 有著很大的區(qū)別。RhoA 和RhoC 主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，而RhoB 分布于細(xì)胞膜、內(nèi)體（endosome）、多泡體（multivesicular body，MVB）以及細(xì)胞核上，并因此導(dǎo)致了其細(xì)胞和生理功能上的特異性［4，14-17］。內(nèi)體和多泡體是細(xì)胞囊泡運(yùn)輸（endosome trafficking）的樞紐環(huán)節(jié)，有研究報(bào)道RhoB參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸，在原癌基因酪氨酸蛋白激酶src（SRC）、蛋白激酶B（AKT）和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的運(yùn)輸囊泡運(yùn)送到到細(xì)胞膜與之融合的過程中起著重要的調(diào)控作用［18-22］。有趣的是，人們發(fā)現(xiàn)用來靶向Ras蛋白的法尼基化修飾的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（farnesyltransferase inhibitors，F(xiàn)TIs）能夠顯著抑制RhoB 的法尼基化修飾，進(jìn)而導(dǎo)致RhoB 的香葉酰香葉酰化修飾水平上調(diào)［15］，并且RhoB香葉酰香葉?；揎椝降纳险{(diào)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡［15-16，23-24］。目前法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在臨床上并未取得預(yù)期效果的原因有很多，其中RhoB作為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機(jī)制有待更進(jìn)一步的深入研究和闡明，以期能夠推動(dòng)法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑在腫瘤臨床治療上的應(yīng)用。

2 RhoB的磷酸化修飾

雖然磷酸化修飾是細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)分子最為普遍的翻譯后修飾方式，但相對(duì)于脂化修飾，Rho家族蛋白磷酸化修飾的研究卻非常有限，目前關(guān)于RhoB磷酸化修飾的研究也僅有少數(shù)幾篇文章報(bào)道。Tillement等［25］報(bào)道了酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）可以特異性地磷酸化RhoB 的185位絲氨酸殘基（Ser185）而不能磷酸化修飾RhoA和RhoC。抑制CK1 介導(dǎo)的RhoB Ser185 的磷酸化修飾會(huì)導(dǎo)致RhoB活性水平上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞骨架微絲的形成并抑制EGFR 的內(nèi)吞降解。因此，RhoB 的Ser185 的磷酸化修飾在抑制RhoB 的活性上可能起著重要的作用。另外，Ballif等［26］通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法鑒定出了RhoB的另一個(gè)磷酸化位點(diǎn)，154位的酪氨酸殘基（Tyr154），但是該位點(diǎn)磷酸化的生物學(xué)功能及介導(dǎo)該位點(diǎn)磷酸化的上游激酶都不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在單鏈DNA 損傷的情況下，激活的Chk1 激酶會(huì)磷酸化RhoB 的173 和175位的蘇氨酸殘基（Thr173 和Thr175），而Thr173和Thr175的磷酸化修飾會(huì)促進(jìn)RhoB從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中與催化SUMO 化修飾的SUMO E3 連接酶PIAS1（protein inhibitor of activated STAT1）結(jié)合進(jìn)而被進(jìn)一步SUMO化修飾。阻斷RhoB的Thr173和Thr175的磷酸化修飾會(huì)抑制單鏈DNA 損傷誘導(dǎo)的RhoB 從細(xì)胞質(zhì)膜上的解離，而將Thr173 和Thr175 突變成谷氨酸（Glu）模擬Thr173和Thr175的磷酸化修飾則會(huì)使RhoB 在細(xì)胞未受DNA 損傷的情況下就從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，充分說明Thr173和Thr175的磷酸化修飾在調(diào)控RhoB與細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)合中起著重要的作用［27］。

3 RhoB的泛素化修飾

與經(jīng)典的Ras超家族蛋白質(zhì)分子的活性調(diào)控方式一樣，RhoA、RhoB 和RhoC 的活性主要也是通過與GTP 或GDP 的結(jié)合來調(diào)控的［28］。但是，與RhoA 和RhoC 在細(xì)胞中屬于組成性表達(dá)不同，RhoB 的表達(dá)屬于誘導(dǎo)性表達(dá)，紫外線照射、抗癌藥物處理、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）以及血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）等處理均可使RhoB的表達(dá)水平快速上調(diào)［5，29-31］。相應(yīng)地，RhoB 的mRNA 和蛋白質(zhì)的半衰期都非常短，分別只有20 min 和2.5 h，而RhoA 和RhoC 相對(duì)則要穩(wěn)定得多，RhoB因此被認(rèn)為是一個(gè)短壽蛋白［32］。

細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平的經(jīng)典途徑是泛素化修飾介導(dǎo)的蛋白酶體或溶酶體的降解途徑。蛋白質(zhì)的泛素化修飾是通過一系列的酶促反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。泛素蛋白經(jīng)過泛素活化酶（E1）的活化后，被轉(zhuǎn)移到泛素綴合酶（E2）上，再通過泛素連接酶（E3）共價(jià)連接到特定的目標(biāo)蛋白質(zhì)上［33］。在人類細(xì)胞中，目前發(fā)現(xiàn)有2種E1、40種E2以及600多種E3。每一種E3 可以識(shí)別一定的目標(biāo)蛋白質(zhì)底物，從而決定了蛋白質(zhì)泛素化降解的特異性［34］。同時(shí)，一個(gè)蛋白質(zhì)底物可以有不同的E3 在不同的條件下對(duì)其進(jìn)行泛素化修飾，以達(dá)到精細(xì)調(diào)控的目的。

Nedd4 家 族 的Smurf1 （SMAD ubiquitination regulatory factor-1）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的能夠泛素化降解RhoB 的E3 泛素連接酶。Nedd4 家族屬于HECT 類型E3 泛素連接酶，都由1 個(gè)C2 結(jié)構(gòu)域、2~4個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)具有保守序列的有催化活性的HECT 結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，因此又稱為C2-WW-HECT家族［35］。Smurf1最早是被鑒定為細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β信號(hào)途徑的下游分子Smad1的泛素調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中起著重要的作用［36］。有趣的是，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，Smurf1 可以泛素化降解RhoA，在細(xì)胞極性、運(yùn)動(dòng)和上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中起著重要的作用［37-38］，并且Smurf1是通過其C2結(jié)構(gòu)域來識(shí)別小G蛋白底物RhoA的［39］。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Smurf1可以同樣通過C2 結(jié)構(gòu)域識(shí)別RhoB，并對(duì)RhoB 進(jìn)行Lys48 位的泛素化修飾來介導(dǎo)RhoB 的降解。通常狀態(tài)下，細(xì)胞通過Smurf1泛素化降解RhoB使其蛋白質(zhì)水平處于一個(gè)相對(duì)較低的水平；當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激如紫外照射導(dǎo)致單鏈DNA 損傷時(shí)，細(xì)胞會(huì)激活A(yù)TM/ATR信號(hào)通路，其中ATR會(huì)激活其下游的蛋白激酶Chk1 以磷酸化Smurf1 的Thr145、Thr161 和Thr682，Smurf1 的磷酸化修飾會(huì)誘導(dǎo)其自身的泛素化降解，使得RhoB蛋白得以累積，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［40］（圖2）。

Fig. 2 Schematics of Smurf1-mediated RhoB ubiquitination圖2 Smurf1介導(dǎo)的RhoB泛素化降解

另外，其他研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RhoB還可以被RING類型Cullin家族的E3泛素連接酶復(fù)合體所泛素化修飾。Xu等［41］發(fā)現(xiàn)Cullin 2-RBX1 E3泛素連接酶復(fù)合體可以泛素化降解RhoB，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。Kovacevic 等［42］發(fā)現(xiàn)，Cullin 3-RBX1-KCTD10 E3 泛素連接酶復(fù)合體可以對(duì)RhoB 進(jìn)行K63 泛素化修飾，介導(dǎo)RhoB 通過溶酶體途徑降解來調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障的完整性，并且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Cullin 3-RBX1-KCTD10介導(dǎo)的RhoB 泛素化降解對(duì)于HER2 陽(yáng)性的乳腺癌中的Rac1的激活是必需的［43］。此外，Liu等［44］發(fā)現(xiàn)，Cullin3-TNFAIP1 E3泛素連接酶復(fù)合體可以介導(dǎo)RhoB通過泛素蛋白酶體途徑降解來影響肝癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 RhoB的SUMO化修飾

前面提到細(xì)胞在紫外照射等刺激誘導(dǎo)單鏈DNA損傷的情況下，激活的Chk1激酶不僅會(huì)磷酸化修飾Smurf1 促進(jìn)Smurf1 的自身泛素化降解使得RhoB 蛋白得以累積［40］，而且還會(huì)直接磷酸化RhoB 以誘導(dǎo)RhoB 從細(xì)胞質(zhì)膜上解離下來進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與PIAS1 結(jié)合［27］。PIAS1 對(duì)RhoB 進(jìn)行SUMO化修飾，而SUMO化修飾的RhoB則會(huì)與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1 （mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）抑制復(fù)合體中的結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白2（tuberous sclerosis 2 protein，TSC2）結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體以抑制mTORC1的活性，從而啟動(dòng)細(xì)胞自噬。阻斷RhoB 的SUMO化修飾會(huì)抑制單鏈DNA 損傷引起的細(xì)胞自噬和進(jìn)一步的細(xì)胞凋亡［27］（圖3）。

Fig. 3 Schematics of RhoB sumoylation and autophagy圖3 RhoB的SUMO化修飾與細(xì)胞自噬

綜上所述，RhoB 的泛素化修飾和SUMO 化修飾在調(diào)節(jié)RhoB的水平和活性上起著完全相反的作用。細(xì)胞在正常狀態(tài)下會(huì)通過Smurf1 泛素化降解RhoB 使RhoB 處于低水平狀態(tài)，使得細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)；而當(dāng)細(xì)胞的DNA 受到損傷的情況下，DNA損傷應(yīng)答信號(hào)通路ATR/Chk1一方面通過磷酸化修飾Smurf1促進(jìn)Smurf1的自身降解來提高RhoB的蛋白質(zhì)水平，另一方面則通過磷酸化修飾RhoB使其從細(xì)胞質(zhì)膜上解離進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)被SUMO 化修飾，從而將TSC2轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體抑制mTORC1的活性以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并且進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的死亡（圖4）。由此可見，RhoB 可以通過不同的翻譯后修飾來決定細(xì)胞的命運(yùn)。

Fig. 4 RhoB determines cell fate by switching between ubiquitination and sumoylation圖4 RhoB泛素化修飾和SUMO化修飾之間的轉(zhuǎn)變與細(xì)胞命運(yùn)

5 總結(jié)與展望

RhoB 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并且與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，RhoB 的研究將對(duì)于理解腫瘤的發(fā)病機(jī)理并探索特異的腫瘤治療方法具有重要的意義。但是，關(guān)于RhoB在不同類型的腫瘤中所起不同作用的分子機(jī)理還不完全清楚，不同類型的組織和細(xì)胞環(huán)境是否存在著特異性的修飾類型或修飾位點(diǎn)？除了DNA 損傷外，是否還存在其他生理性刺激來調(diào)控RhoB 的水平及活性？而目前RhoB 自身的水平和活性調(diào)控機(jī)制的研究也相當(dāng)缺乏，亟待進(jìn)一步的深入和完善。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)水平及活性的關(guān)鍵因素，目前已知的蛋白質(zhì)翻譯后修飾已達(dá)數(shù)百種，除了文中提到的已知的翻譯后修飾，RhoB很可能還有許多其他尚未發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾在不同的生理或病理情況下調(diào)節(jié)其水平、活性、細(xì)胞定位以及相互作用蛋白質(zhì)的改變等。因此，針對(duì)RhoB的翻譯后修飾進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究將會(huì)對(duì)了解其調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能起到積極的促進(jìn)作用，也是全面闡明RhoB信號(hào)通路相關(guān)的分子機(jī)理不可或缺的一環(huán)。