緩步動物熱溶性蛋白的獨有特性及其在極端環(huán)境適應中的功能*

王澤峰

（中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所，上海 200031）

水是生命之源，在細胞生命活動與新陳代謝反應中必不可少。但在低溫下，水結成的冰晶會破壞細胞結構并造成生物大分子不可逆的損傷，也是生命體脆弱的根本原因［1］。而某些生物的細胞在大幅度脫水后， 可以進入一種叫做隱生（cryptobiosis）的特殊狀態(tài)［2-3］，使細胞脫水萎縮并停止新陳代謝，從而可以允許其在極端條件下生存多年。這類生物對極端環(huán)境的適應，依賴于其細胞在脫水后進入隱生保護狀態(tài)并在遇水補液后進行復蘇的能力［3］。通過隱生狀態(tài)來適應極端環(huán)境，目前只發(fā)現(xiàn)于細菌、真菌、原生生物、植物和一些低等動物中，而人類等高等動物缺乏類似的適應能力。然而，實現(xiàn)對人體細胞、器官或個體的隱生保護和極端條件適應，在生物醫(yī)學等領域有著重要用途。

大多數(shù)耐干燥的生物是通過在體內積累非還原糖類（主要為雙糖）的方法來保護細胞，以免其受到干燥脫水所引起的損傷［4］。這類非還原雙糖主要包括蔗糖（sucrose）與海藻糖（trehalose）［5-6］。海藻糖在許多耐干燥植物、真菌或一些節(jié)肢動物中的含量非常高，可達干重的20%［7］，并且已經(jīng)被證明對這類生物的極端條件耐受能力有著重要作用［8］。雙糖保護長期被認為是可脫水生物的普遍特性，尤其是在植物種子和微生物的脫水冷凍中發(fā)揮重要作用，其原理也被用于高等動物細胞的凍存技術。然而，動物細胞本身無法合成此類雙糖。

近年來，在一些適應極端條件的動物（如緩步動物與輪蟲）研究中發(fā)現(xiàn)，這些動物在脫水過程中并不存在雙糖的高濃度積累，而是以表達抗凍蛋白的形式提供脫水保護。這類生物所表達的抗凍蛋白是一類含有大量重復序列的內在無序蛋白（intrinsically disordered proteins，IDP，也稱內在紊亂蛋白），可通過不同途徑高效地結合并固定水分子，從而保護蛋白質復合體和細胞膜等關鍵生物大分子結構，對極端條件帶來的細胞損傷起到脫水保護效果［9-10］。這類生物中，緩步動物以其在極端環(huán)境中生存的能力而聞名，其可以適應干燥［9］、冰凍［11］、強輻射［12］、極端壓力［13］和151°C 的高溫［14］等極端環(huán)境。近年來，研究人員在其基因組中發(fā)現(xiàn)了3 個特有的IDP 蛋白新家族。這3 個蛋白質新家族包括細胞質豐富熱溶蛋白（cytosolicabundant heat-soluble proteins，CAHS）、分泌型豐富熱溶蛋白 （secretory-abundant heat-soluble proteins， SAHS）和線粒體豐富熱 溶 蛋 白（mitochondrial-abundant heat-soluble proteins，MAHS），統(tǒng)稱緩步動物紊亂蛋白（tardigrade disordered proteins，TDP），在緩步動物的極端環(huán)境適應中起到了脫水保護作用［15］。TDPs是緩步動物所獨有的，除了高度無序的特征之外，其內部3個家族彼此并不相似。這些緩步動物的熱溶蛋白可以說是廣義上的抗凍蛋白中的一類。盡管有研究初步證明，熱溶蛋白可以幫助細胞適應高滲透壓等極端環(huán)境，但是對這類蛋白質的性質和功能研究尚處于初期階段。其在極端條件下對細胞的脫水保護作用機理有很多未知的問題，尤其是一些關鍵的基本問題，例如這些熱溶性蛋白特有的內在序列怎樣決定了其結構？其三維結構在脫水和復蘇過程中怎樣變化？尚待進一步解答。而這些問題的研究，將促進熱溶蛋白在生物醫(yī)學上的廣泛應用。

1 熱溶性蛋白基本特征

通常情況下，水溶液中多數(shù)蛋白質在超過50°C的溫度下會發(fā)生變性，形成蛋白質聚集沉淀。多數(shù)情況下蛋白質的變性伴隨著一個不可逆的蛋白質失活過程，而酶蛋白的活性中心與其他區(qū)域相比通常對變性更為敏感［16-17］。不同蛋白質發(fā)生熱變性溫度也大有差別，而一些蛋白質在高溫下仍然可以保持穩(wěn)定的結構并具有活性。其中一個著名的例子就是嗜熱細菌中發(fā)現(xiàn)的Taq DNA 聚合酶，在70~80°C 可以發(fā)揮最優(yōu)的活性［18］，被廣泛應用于聚合酶鏈反應（PCR）反應中。而有一類特殊的熱溶性蛋白（heat-soluble proteins）是分子質量較小的內在無序蛋白，它們的序列中富含大量的親水氨基酸，形成無結構區(qū)域，具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性，可在超過90°C 的高溫水溶液甚至煮沸條件下保持水溶狀態(tài)而不發(fā)生聚集沉淀。含有大量內在無序序列的抗凍蛋白也具有熱溶性質，因此也可歸于這一類熱溶性蛋白。

在植物基因組中大量存在的胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein，LEA）就是這類熱溶性蛋白的代表。LEA 蛋白的編碼基因在植物種子胚胎發(fā)育晚期表達升高，而在干旱、低溫、鹽脅迫、紫外輻射等極端應激條件下其mRNA 也會大量累積［19］。LEA 蛋白在細胞中可以穩(wěn)定細胞膜結構，作為水分子伴侶具有結合不同離子和防止氧化等作用，也被認為是在極端環(huán)境中對植物起保護作用的關鍵分子，并在植物脫水抗旱抗凍中起到重要作用［19］。為了研究緩步動物中是否存在類似的熱溶性蛋白，東京大學的Kunieda 團隊［20］將具有耐脫水性質的緩步動物Ramazzottius varieornatus碾碎經(jīng)高溫處理后（92°C，15 min），進行全蛋白質組的測定，發(fā)現(xiàn)了兩類新型的含量豐富的熱溶性蛋白，分別存在于細胞質中或被分泌到細胞外，因此稱為CAHS 和SAHS。之后又發(fā)現(xiàn)了富集于線粒體的MAHS［21］。之后通過序列分析，在其他的緩步動物種類中也發(fā)現(xiàn)了類似的熱溶性蛋白家族并發(fā)現(xiàn)了它們在脫水保護中有著重要作用［9］。

這些熱溶性蛋白為緩步動物獨有，除了熱溶性外每個蛋白質家族彼此間并不具有序列保守性或結構相似性。在同一個家族中的成員間有較好的結構相似性（或者說具有共有的結構特征），而序列相似性并不高，但都包含有一些在本家族中保守的蛋白質結構域（conservative domain）（圖1）。由于緩步動物基因組的標注尚不完備，目前每個熱溶性蛋白家族中包含的蛋白質成員數(shù)目尚不清楚。以模型動物Ramazzottius varieornatus為例，至少發(fā)現(xiàn)了16種CAHS 蛋白、13 種SAHS 蛋白和兩種MAHS 蛋白，同時還有多個基于保守序列預測的LEA 蛋白家族的成員［22］。這些蛋白質的功能和機制研究才剛開始，目前的分析結果都表明，它們在脫水等極端條件下的生存中可能起到極為重要的作用。

Fig. 1 The sequence features and conserved motifs of the CAHS and SAHS proteins in Ramazzottius varieornatus圖1 緩步動物Ramazzottius varieornatus中的CAHS家族（a）和SAHS家族（b）的蛋白質成員序列特征

2 細胞質豐富熱溶蛋白（CAHS）

CAHS蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的兩種TDP之一，長度通常在200~300個氨基酸之間。其在脫水時表達量升高，CAHS蛋白被發(fā)現(xiàn)可以保護其他蛋白質免受脫水所引起的損傷。這表明CAHS蛋白可能在緩步動物中發(fā)揮著維持蛋白質穩(wěn)定性的重要作用［9］。在酵母中人工表達CAHS蛋白后也可以提高細胞的脫水耐受［9］。其主要序列特征是在N端和C端有兩個內在無序區(qū)域，而中間是一個較長的coil-coil區(qū)域可形成一個α 螺旋（根據(jù)Alphafold 預測，圖2a）。此外在N 端有著相對保守的ASAAR（I/VI）S 的序列，而其他區(qū)域的序列為此類蛋白質特有。富含α螺旋和無序結構的蛋白質構架，也在LEA蛋白等已知的脫水保護蛋白中大量存在。根據(jù)結構可以推測，CAHS 蛋白兩邊的無序區(qū)域可以相互結合，而中間的α螺旋可以在脫水時變得更穩(wěn)定，形成纖維樣的超級網(wǎng)格結構（類似于無規(guī)蛋白的“相分離”）。這樣的結構有利于將水分子吸附固定，防止其在低溫時形成較大的冰晶。

CAHS蛋白在脫水過程中，可以通過多種互不排斥的潛在機理發(fā)揮對細胞內蛋白質和核酸等生物大分子的保護作用。簡言之，CAHS蛋白可以在脫水過程中通過特定的結構變化，來介導細胞質的玻璃化（vitrification）過程。在此過程中，緩慢脫水導致剩余的水分子被相對均勻地固定限制在細胞質不同區(qū)域中，使得細胞黏度平穩(wěn)增加，成為介于經(jīng)典液態(tài)和固態(tài)間的非晶玻璃態(tài)，同時蛋白質、核酸等大分子被可逆地“冰凍保護”在一種活性結構狀態(tài)，而不是因為脫水造成結構坍塌變性。細胞的玻璃化是其在脫水冰凍條件生存的主要機理，在玻璃化過程中通常需要一種分子介質作為“分子伴侶”來緩沖失水導致的氫鍵喪失以及細胞質內的黏度變化。植物中的雙糖（蔗糖或海藻糖）是已知的很好的玻璃化介質，在不同系統(tǒng)中可以起到脫水冰凍保護作用［23］。而廣泛存在于細胞質中的CAHS蛋白，也可以起到類似作用。近期的研究表明，緩步動物的脫水過程中可以發(fā)生玻璃化，而這種玻璃化是其在極端條件下生存的必要條件［24］。然而此方向的研究剛剛開始，有大量未知問題需要解答。

失水過程可以造成的水分子和蛋白質間的氫鍵喪失，而產(chǎn)生的游離親水基團間可能發(fā)生氫鍵重構，從而破環(huán)蛋白質結構。在細胞質玻璃化過程中，CAHS蛋白可能通過介導蛋白質大分子的水取代（water replacement）和優(yōu)先水化（preferential hydration）來進行脫水保護。水取代假說提出，在細胞中廣泛表達的CAHS蛋白中含有大量的親水集團，它們可以和其他蛋白質形成氫鍵來取代水分子，從而保障脫水時維持蛋白質的基本結構；而優(yōu)先水化假說提出，在細胞脫水時盡管水分子大量流失，許多關鍵蛋白質分子的表面親水區(qū)域仍保留一個水化層來鎖定部分水分子，從而維持其結構與功能。作為脫水保護蛋白，CAHS蛋白可以鎖定一部分水分子，在它和其他蛋白質間造成一個優(yōu)先水化層，從而協(xié)助其他蛋白質保持穩(wěn)定結構。

最新研究表明，CAHS蛋白在體外可在高滲脅迫下可逆聚合成許多細胞骨架樣纖維，并可進行可逆凝膠轉化，同時還增加細胞硬度來抵消因脫水的滲透壓改變引起的細胞收縮，從而提高了高滲脅迫下的存活率［15］。緩步動物細胞內存在大量的CAHS 蛋白，但目前還不知道是否不同的CAHS蛋白間在功能上是否可以互相替代。不同CAHS蛋白有可能在不同細胞類型中起作用，或者對不同種類的蛋白質進行脫水保護。此外，在脫水過程中不同的CAHS蛋白也許可以在不同階段發(fā)揮作用。這些都是未來需要進行研究的問題。

Fig. 2 Common structure of different types of TDP using the CAHS，SAHS and MAHS in Ramazzottius varieornatus as examples圖2 以Ramazzottius varieornatus 中的三個TDP家族為代表，簡示CAHS、SAHS和MAHS蛋白的典型結構特征

3 分泌型豐富熱溶蛋白（SAHS）

與 CAHS蛋白相比，SAHS蛋白中的無序序列較少，因此是目前唯一可以通過晶體衍射來研究其結構的TDP［25-26］。SAHS蛋白家族和哺乳動物中的脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs）有一定的序列保守性和較高的結構保守性。以RvSAHS1 的晶體結構為例，SAHS 蛋白主要是由大量β 折疊組成了β 桶狀結構，并在β 桶的頂端有個由2 個α 螺旋和1 個轉角結構（helix-turnhelix）形成的“蓋子”結構域（圖2b）。SAHS 蛋白在水化條件下的結構通常是富含β折疊，但在失水時轉為更富含α 螺旋的狀態(tài)［20］，這種結構轉化對脫水保護的作用尚不清楚。SAHS蛋白的N端有著介導細胞外分泌的信號肽序列，因此SAHS主要富集在細胞膜外和細胞間質中，此外定位在各類細胞內膜中（如內質網(wǎng)、高爾基體），但不清楚這種內膜定位是否只體現(xiàn)了蛋白質分泌路徑的中間步驟。SAHS蛋白這種特有的定位方式，讓人容易假設它們在脫水過程中發(fā)揮著保護細胞膜的作用。

類似于脂肪酸結合蛋白FABP，SAHS也有2個富含極性氨基酸的配體結合位點（ligand binding site，LBS）。這些LBS通常被認為是蛋白質結合脂肪酸的位點，但對FABP的研究表明，此類配體結合位點有較靈活的結合特異性，可以結合脂肪酸之外的多種分子［27］。因此SAHS 很可能通過這類位點來結合細胞膜和細胞間質中的多種分子，從而在脫水過程中固定這些分子的相對位置，從而達到保護細胞間結構的作用。此外，SAHS蛋白傾向于形成多聚體，而晶體結構中SAHS也是以二聚體的形式存在［25-26］。因此，一種可能的機理是SAHS 蛋白在細胞膜外通過多聚化形成纖維狀骨架，這種蛋白質纖維骨架在脫水時可能起到類似于細胞壁的作用，從而保護多細胞結構的穩(wěn)定性。

4 線粒體豐富熱溶蛋白（MAHS）

在3 種TDP 家族中，MAHS 蛋白在自然界中最為特別，目前在其他生物中尚未發(fā)現(xiàn)有類似的蛋白質序列，只是和某些LEA 蛋白有些較遠的相似度。比起CAHS和SAHS來，MAHS 蛋白家族的成員較少，但是很可能在脫水過程中起到一個極為關鍵的作用——保護線粒體的完整性。作為細胞內重要的能量工廠，線粒體雙層膜的完整性是氧化呼吸鏈反應的必要條件，也是細胞存活的關鍵因素。高等動物中線粒體雙層膜遭到破壞后會使細胞發(fā)生凋亡或焦亡。在極端條件下的隱生狀態(tài)需要將氧化呼吸鏈反應暫停，在此過程中線粒體由于脫水而縮小，而在復蘇恢復期需要重啟此反應，也需要線粒體恢復正常狀態(tài)。而線粒體損傷不僅會影響代謝反應，而且會釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）來導致細胞內其他分子的損傷。因此，保護線粒體雙層膜的完整性對脫水保護至關重要。

MAHS 蛋白的結構中具有大量的無規(guī)序列區(qū)域和α 螺旋。結構預測表明，MAHS 蛋白由5 個α螺旋組成一個較松散的結構核心，而α螺旋間有大量的無規(guī)區(qū)域組成蛋白質外圍（圖2c）。這種結構可以讓人們假想MAHS 蛋白像一個具有較大彈性的球，而α 螺旋可以在兩邊具有疏水面和親水面，從而分散嵌入線粒體膜中。在線粒體脫水過程中，線粒體膜表面面積變小可以發(fā)生收縮，使膜脂的極性頭部緊密堆聚（pack）在一起形成膠狀狀態(tài)［28］。由于失去水分子過程的隨機性，這種收縮將會在局部導致線粒體膜產(chǎn)生不均一的孔洞。而吸水過程正好相反，線粒體膜的吸水擴展形成流動性較高的液晶狀態(tài)［29］，而從膠狀到液晶狀態(tài)的轉變如果發(fā)生不均勻的變化，也會造成線粒體膜的局部孔洞［29］。因此，一個可能的機理就是，MAHS 蛋白的嵌入，可以作為緩沖介質有效地平衡線粒體膜的收縮和擴展過程中的局部不均一性，使得線粒體膜在失水變?yōu)槟z狀過程中仍保有較好的流動性。當然，MAHS蛋白也很可能同時與線粒體膜上的蛋白質相結合，從而保護這些膜蛋白在脫水過程中的結構穩(wěn)定性，從而減少由于線粒體膜蛋白的結構變化導致的線粒體損傷。這些假想的機理并不互斥，反而有可能同時起作用。

5 TDP在極端環(huán)境適應中的潛在應用

作為緩步動物特有的內在無序蛋白，TDP 的功能和機理研究尚不深入。一系列重要的問題尚待回答，包括其進化歷史是什么？為什么不同家族中的成員數(shù)目相差很多？TDP 表達是否受到極端環(huán)境誘導？同一家族的不同成員間是否有功能的冗余和互補性？不同TDP 是否可以相互結合形成異質性纖維骨架？不同種緩步動物間它們的TDP 是否可以跨種發(fā)揮作用？緩步動物TDP 是否可以在其他動物中發(fā)揮類似作用？這些問題的解答將有助于理解它們超強的對極端環(huán)境能力，并可能帶來一系列潛在的創(chuàng)新性應用。

首先，這些TDP 在干燥條件下可以對細胞進行脫水保護，使其可以作為細胞冷凍保存介質來發(fā)揮作用。目前，細胞的常規(guī)保存方法主要有液體保存法（4℃）和超低溫保存法（-80℃或-196℃）。液體保存法（4℃）保存時間短，且易受到細菌污染；超低溫保存可長期保存，但需要昂貴、笨重的低溫設備，而且由于保護液中含有滲透性保護劑，解凍后需要反復洗滌，對細胞狀態(tài)產(chǎn)生影響。冷凍干燥法（凍干法）是目前很有潛力的一種新型保存細胞的方法。其是將含水物質在低溫下凍結，然后在真空條件下通過對凍結物質加熱，使其中的水分直接升華而獲得干燥物質的技術，為細胞的長期保存提供了一種新的選擇。經(jīng)冷凍干燥的細胞將能夠在常溫下長時間保存，并且容易重新復水而恢復活性，大大減少了運輸與保存的不便，優(yōu)點顯著。然而，絕大多數(shù)細胞對低溫、干燥這類極端條件非常敏感。在這些極端條件的發(fā)生過程中，細胞的物理與生理狀態(tài)均會發(fā)生變化，細胞內各亞細胞器的功能活性也會受到影響（主要是水的形態(tài)變化和失水造成損傷）。同時，細胞活力也會明顯下降。如何能夠減少細胞組分變性、保持細胞活性，是當前細胞凍干保存研究的重點與難點。目前冷凍干燥技術多見于對血小板、紅細胞等特殊的無核細胞保存研究上，而幾乎沒有對其他有核細胞的研究。而TDP 有可能作為冷凍干燥的保護性介質，在細胞保存中發(fā)揮重要作用。

類似的潛在應用，可以進一步在高等動物細胞內通過外源表達TDP，建立并改造此類細胞保護系統(tǒng)，從而賦予動物細胞超常的極端環(huán)境下生存能力，實現(xiàn)在干燥條件下對不同溫度的適應，實現(xiàn)長期保存與復蘇。內在無序蛋白在高等動物的基因組中也是大量存在，并通過介導細胞中液相分離來發(fā)揮重要生理作用。同時一些無序蛋白也是受細胞應激狀態(tài)調控的，有潛在的脫水保護作用。利用TDP對哺乳動物細胞進行改造，有望獲得適應極端條件的具有不同功能的工程化細胞，甚至可以賦予整個器官更好的極端環(huán)境適應能力，在器官移植中實現(xiàn)供體器官的脫水保存和復蘇。

最后，對完整人體進行休眠和復蘇是很久以來的理想，在一些古代傳說中，就認為人死后進行脫水干燥可以保護軀體讓其復活。而在現(xiàn)代冷藏技術發(fā)明以來， 也開始了對尸體的冷凍保存（cryonics），以期未來有技術將其復活。自1967 年James Bedford 作為第一個嘗試者將自己的尸體進行冷凍保存之后，至2015年已有超過1 500人立下遺囑進行尸體冷凍。然而，對于剛死去的人進行冷凍時，細胞已經(jīng)有了不可逆的損傷。所以尸體冷凍保存復蘇的技術目前看來可能只是一種幻想。而對于健康人在低溫條件下的休眠和復蘇，卻是一個有望實現(xiàn)的未來技術，或將在醫(yī)學領域和未來宇宙探索與星際移民中發(fā)揮極其重要的作用。而對緩步動物的極端條件耐受機理研究和工程改造，為此類技術的實現(xiàn)提供了一個潛在的路徑。