竹葉黃酮提取純化及其在輕工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李翱翔 趙一鶴

(1 西南林業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院 昆明 650224； 2 云南省林業(yè)和草原科學(xué)院 昆明 650201)

竹葉作為一種可食用和藥用的植物資源， 在中國(guó)乃至其他國(guó)家都有著悠久的歷史記錄。 竹葉提取物具有多種生理活性， 對(duì)于保護(hù)人體健康具有重要作用[1]， 1998 年中國(guó)衛(wèi)生部認(rèn)定竹葉是一種草藥。

竹葉中富含黃酮類化合物， 該類化合物也是植物中最重要的次生代謝產(chǎn)物之一[2]。 文獻(xiàn)分析顯示， 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)竹葉中有21 種黃酮類化合物， 主要以糖苷的形式存在于竹葉中， 分為O 苷和C 苷2 種， 并以黃酮C 苷為主[3]。 黃酮C 苷主要有4種活性化合物[4]。 魏琦等[5]通過(guò)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定竹葉中的13 種黃酮類化合物， 并用同樣方法與牡竹屬10 個(gè)竹種的竹葉黃酮類化合物進(jìn)行比較， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同竹種竹葉黃酮類化合物組成和含量存在差異； 李翱翔等[6]采用4 種黃酮碳苷標(biāo)品分析了5 種竹葉的黃酮類成分及含量[6]， 印證了該結(jié)果。 已有研究表明， 黃酮類化合物表現(xiàn)出一系列生物活性， 包括抗氧化[7]、 抗真菌活性[8]、 調(diào)節(jié)血脂血糖和抑制腫瘤活性[9]、 阻斷亞硝化反應(yīng)、 消除潰瘍以及降低患動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥、 帕金森綜合征病的風(fēng)險(xiǎn)[10]等。 竹葉中提取的黃酮類化合物由于其獨(dú)特的生物理化活性， 可用于醫(yī)藥產(chǎn)品、 功能保健產(chǎn)品以及日用化妝品， 也可進(jìn)一步制成抗氧化劑、 抑菌防腐劑、天然營(yíng)養(yǎng)性低甜度甜味劑等食品添加劑。 然而，到目前為止竹葉黃酮在輕工業(yè)上的應(yīng)用并未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。 本文綜述了國(guó)內(nèi)外竹葉黃酮提取和純化方法以及在輕工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀， 以期為竹葉黃酮工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)和參考。

1 竹葉黃酮類化合物的提取方法

常見(jiàn)的竹葉黃酮類化合物提取方法有煎煮法、共沉淀法、 超臨界流體萃取法(SPE)、 表面活性劑法、 微波輔助提取法(MAE)、 雙水相法、 超聲波萃取法、 離子液體提取法、 生物酶解提取法、閃蒸提取法等， 根據(jù)提取原理可將這些方法歸納為化學(xué)提取法、 生物提取法、 物理提取法以及聯(lián)合提取法4 類[11]。

1.1 化學(xué)提取法

化學(xué)提取法是將竹葉原料進(jìn)行粉碎過(guò)篩后，選擇合適的溶劑在最佳的提取工藝下進(jìn)行提取的方法。 常用的溶劑為水或有機(jī)溶劑， 即選擇黃酮類化合物和非目標(biāo)物質(zhì)之間具有極性差異的有機(jī)溶劑(例如常用的有丙酮、 乙醇、 甲醇、 乙酸乙酯及某些極性較大的混合有機(jī)溶劑) 進(jìn)行提取。何春雷等[12]采用水提取法分析了10 個(gè)不同竹種的竹葉黃酮， 其最佳提取工藝條件為: 固液比1 ∶20、 提取溫度80 ℃ (水浴加熱)、 提取時(shí)間30 min。 水提取法具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、 設(shè)備簡(jiǎn)單、 工業(yè)生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)， 但提取率較低， 也會(huì)附帶多種水溶性雜質(zhì)， 給分離純化帶來(lái)一定困難， 得到的產(chǎn)物含量少。 李坤平等[13]使用不同的有機(jī)溶劑對(duì)竹葉黃酮進(jìn)行提取， 認(rèn)為酒精為最合適的提取溶劑。 有機(jī)溶劑提取法便于操作、 經(jīng)濟(jì)適用、得率較高、 易處理， 相對(duì)于水提法更加常用， 但工業(yè)化生產(chǎn)耗量較大， 相對(duì)于水來(lái)說(shuō)， 有機(jī)溶劑存在環(huán)境污染和回收困難等問(wèn)題。 Wang 等[14]開(kāi)發(fā)了以離子液體為溶劑提取竹葉黃酮的方法， 提出的最佳工藝條件為1.5 mol/L [BMIM] Br 水溶液、 固液比1 ∶41。

1.2 生物提取法

生物提取法主要是酶解法， 即利用酶來(lái)分解植物細(xì)胞壁和果膠質(zhì)等， 加快提取溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部， 從而提高目標(biāo)化合物的提取率。 趙洪等[15]利用纖維素酶提取竹葉黃酮， 最佳提取工藝為:酶添加量0.5%， 提取溫度45 ℃， 固液比15 倍，提取時(shí)間1.5 h、 pH 值為5。 羅春連[16]在趙洪等的基礎(chǔ)上加入了一定比例的果膠酶， 用2 種混合酶優(yōu)化提取工藝， 得到的最佳工藝條件為:0.05%的果膠酶、 0.08%的纖維素酶， 固液比1 ∶20， 酶解溫度48 ℃， 酶解時(shí)間2 h， pH 值為5； 在該條件下提取效果最佳， 總黃酮的提取率可以達(dá)到85%～95%， 比傳統(tǒng)提取法的提取率提高了10%左右。

采用酶解法提取竹葉黃酮所應(yīng)用到的設(shè)備較為簡(jiǎn)易， 工藝簡(jiǎn)單， 操作簡(jiǎn)便， 成本低廉， 效率高， 而且相對(duì)有機(jī)溶劑提取更加環(huán)保安全。

1.3 物理提取法

物理提取法主要是借助外力作用創(chuàng)造出高溫、高壓、 高頻等提取條件， 從而獲取竹葉黃酮的方法。 物理提取方法主要有超臨界流體法、 破碎提取法等。 陶清等[17]利用超臨界流體CO2萃取技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化竹葉黃酮的提取工藝， 得到的最優(yōu)提取條件為: 萃取壓力40 Mpa、 夾帶劑用量1 mL/g、萃取溫度60 ℃、 萃取時(shí)間60 min， 最終的竹葉總黃酮提取量為4.978 mg/g。

與化學(xué)提取方法相比， 物理提取法不僅提高了目標(biāo)產(chǎn)物的得率， 而且節(jié)能省時(shí)。

1.4 聯(lián)合提取法

聯(lián)合提取法就是將幾種提取方法相結(jié)合進(jìn)行提取竹葉黃酮。 李燁等[18]利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取竹葉黃酮， 最佳工藝條件為: 70%乙醇，超聲功率190 kW， 超聲時(shí)間30 min； 在該條件下竹葉黃酮提取率為5.463%。 許子競(jìng)[19]以毛竹葉為原料， 通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取毛竹葉黃酮的工藝， 在固定微波功率3.0 kW 和以80%乙醇為溶劑條件下提取竹葉黃酮， 得出最佳提取工藝為: 固液比1 ∶24 (g ∶mL)， 在81 ℃條件下提取21 min， 黃酮的提取率為5.78%。 王博文等[20]應(yīng)用Design-Expert 法得到提取的最優(yōu)條件下(80%乙醇溶液作為溶劑， 固液比1 ∶17、 提取溫度82 ℃、 提取時(shí)間86 min、 氧化石墨烯加入量為1.5 mg/g) 竹葉黃酮的提取率可達(dá)88.4%， 相比只用乙醇回流提取提高約10.6%。 此外， 聯(lián)合提取法還有表面活性劑輔助超聲提取法[21]、 超聲波輔助雙水相提取法[22]、 超聲-微波協(xié)同輔助酶提取法[23]等都應(yīng)用在黃酮類化合物的提取上， 但這些方法尚未應(yīng)用在竹葉黃酮的提取上， 將來(lái)可能成為竹葉黃酮一種比較理想的提取方法。

2 竹葉黃酮類化合物的純化和含量測(cè)定方法

黃酮類化合物分離的傳統(tǒng)方法主要有配位反應(yīng)法[24]、 溶劑萃取法[25]、 醇沉法[26]等， 最近較為先進(jìn)的技術(shù)主要有高速逆流色譜技術(shù)(HSCCC)、 分子印跡技術(shù)(MIT)、 液滴逆流色譜技術(shù)(DCCC)， 以及較早方法中的壓液相色譜法(MPLC)、 循環(huán)液相色譜技術(shù)(CLC) 和離心制備薄層色譜法(CPTLC)。 目前， 應(yīng)用在竹葉黃酮的純化分離的方法主要有聚酰胺柱層析法、 大孔徑樹(shù)脂吸附法、 硅膠柱層析法以及超濾膜法4種。 根據(jù)各方法的理化性質(zhì)可歸為3 類: 柱層析法、 大孔樹(shù)脂吸附法以及超濾膜法。

2.1 竹葉黃酮類化合物的純化方法

2.1.1 柱層析法

可采用聚酰胺柱層析法、 硅膠柱層析法等方法。 郭雪峰等[27]通過(guò)對(duì)比6 種純化工藝， 認(rèn)為聚酰胺柱吸附法為最佳工藝， 純化后竹葉黃酮濃度可達(dá)0.59～0.60 mg/mL。 張春娟等[28]對(duì)比3 種聚酰胺樹(shù)脂的純化效果， 發(fā)現(xiàn)竹葉黃酮的4 種黃酮碳苷在聚酰胺純化后在竹葉黃酮粗品中純度達(dá)76.939 mg/g， 以選擇60 ～100 目的聚酰胺樹(shù)脂效果最佳。 孫武興等[29]采用薄層色譜法、 反向色譜柱(ODS) 法等方法進(jìn)行分離純化竹葉提取化合物， 效果良好。 郭雪峰等在用有機(jī)溶劑提取竹葉黃酮粗產(chǎn)物之后， 先用硅膠柱進(jìn)行一次純化， 用Sephadex LH-20 凝膠柱和RP-18 反相硅膠柱進(jìn)行二次純化分離， 發(fā)現(xiàn)硅膠柱層析法操作復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)， 而且硅膠的吸附性較大， 對(duì)黃酮分離效果較差。

2.1.2 大孔樹(shù)脂吸附法

姚林娜等[30]采用AB-8 大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)竹葉黃酮粗品進(jìn)行純化， 并確定了最佳工藝條件，純化后竹葉黃酮純度比純化前約提高2.7 倍。 周建飛等[31]對(duì)比了8 種大孔徑樹(shù)脂對(duì)竹葉黃酮的靜態(tài)吸附與解吸效果， 篩選出2 種較好的樹(shù)脂D101-1 和AB-8， 并采用混用技術(shù)進(jìn)行分離純化竹葉黃酮， 分離純化效果得到較好提升， 樣品中黃酮純度在原有的基礎(chǔ)上提升了19.7%。 由于竹葉黃酮碳苷極性較大， 與其他純化方法相比， 大孔樹(shù)脂吸附法的純化效果并非特別理想， 可以結(jié)合其他的純化方法進(jìn)行二次純化。

2.1.3 超濾膜法

近年來(lái)， 作為現(xiàn)代藥物純化工業(yè)中取代傳統(tǒng)分離法的重要方法， 超濾(UF) 膜分離被應(yīng)用于分離植物提取物中的不同組分， 該方法具有操作簡(jiǎn)便、 在常溫常壓即可進(jìn)行、 不需要?jiǎng)×曳磻?yīng)條件等優(yōu)點(diǎn)， 但存在膜污染的問(wèn)題。 唐浩國(guó)等[32]用5 種常見(jiàn)的超濾膜對(duì)麻竹葉黃酮進(jìn)行純化， 從中選擇出了分離純化效果較好的聚砜纖維膜PSF-500， 得到的竹葉黃酮的純度達(dá)到44.132%。 王文淵等[33]利用微濾-超濾二級(jí)膜聯(lián)用分離技術(shù)對(duì)竹葉黃酮提取液進(jìn)行處理， 去除部分雜質(zhì)后竹葉黃酮純度達(dá)到41.61%， 竹葉黃酮回收率超過(guò)91%。

2.2 竹葉黃酮含量測(cè)定方法

2.2.1 分光光度法

分光光度法具有靈敏度高、 快速、 便于操作等優(yōu)點(diǎn)， 是目前竹葉黃酮成分測(cè)定最常用的方法，但由于竹葉黃酮粗提取液中雜質(zhì)的存在， 使得最終測(cè)定值偏高， 因此應(yīng)先分離出雜質(zhì)再利用分光光度法測(cè)定竹葉黃酮成分含量， 以獲得較為理想的測(cè)定結(jié)果。 該方法的基本原理是黃酮類物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)上都有酚羥基或還原性羰基， 這些基團(tuán)能夠與金屬鹽離子形成有色絡(luò)合物， 從而在特定的紫外波長(zhǎng)下具有一定的吸光度。 池玉梅等[34]通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法和氯化鋁-乙酸鉀法比較了12 種黃酮類化合物的紫外和可見(jiàn)光譜， 分析了分光光度法對(duì)于測(cè)定黃酮類化合物的適用性， 結(jié)果認(rèn)為該方法只適用于部分黃酮類成分分析。

2.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(HPLC) 是生物化學(xué)、 藥理學(xué)和環(huán)境科學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的分析方法之一。 一些學(xué)者采用HPLC-外標(biāo)法測(cè)定了4 種叢生竹中總黃酮[35]。 張春娟等[28]采用高效液相色譜法結(jié)合紫外光譜法， 同時(shí)測(cè)定了4 種竹葉黃酮碳苷， 測(cè)得的結(jié)果分別為葒草苷13.73 mg/g、異葒草苷49.68 mg/g、 牡荊素7.85 mg/g 和異牡荊素30.70 mg/g。 高效液相色譜也可與其他技術(shù)聯(lián)用， 如Gao 等[36]采用高效液相色譜法與二極管陣列檢測(cè)技術(shù)和離子交換技術(shù)相結(jié)合， 以高效液相色譜儀為基礎(chǔ)， 從豬籠草中提取了14 種黃酮類化合物。

3 竹葉黃酮在輕工業(yè)中的應(yīng)用

竹葉黃酮由于具有多種生物學(xué)活性如抗氧化、抗腫瘤活性、 抗輻射、 抗病毒、 提高免疫力、 抑菌抗炎等而日益受到關(guān)注， 被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、 日化產(chǎn)品以及其他輕工業(yè)領(lǐng)域中。

1) 在功能食品中的應(yīng)用。 目前， 與竹葉相關(guān)的各種類型用于增強(qiáng)免疫力、 清熱解毒的藥品及保健品等系列功能產(chǎn)品(如片劑、 口服飲品、 膠囊等) 已經(jīng)上市。 例如， 浙江大學(xué)張英教授帶頭研制成功了竹葉黃酮類產(chǎn)品 (竹康寧膠囊)，2002 年新時(shí)代集團(tuán)在原有基礎(chǔ)上進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)研制出片劑型竹康寧產(chǎn)品， 該產(chǎn)品在當(dāng)年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為國(guó)產(chǎn)保健品。 竹啤是在啤酒中加入一定量的竹葉黃酮， 添加劑量在100 mg/L 以上， 這種啤酒不僅具有獨(dú)特的竹葉清香， 還具有增強(qiáng)免疫力、 緩解疲勞、 清除體內(nèi)過(guò)氧化物、 降低酒精對(duì)肝臟的傷害、 促進(jìn)新陳代謝和降低血糖血脂等得功效[37]。

2) 在天然藥物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。 早在漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》 中竹葉就被作為一味中草藥， 具有清熱解毒、 輕身益氣的功效。 30 多年前， 日本學(xué)者福山伍郎研究發(fā)現(xiàn)， 屋久島竹葉提取物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的贅生物細(xì)胞群(腫瘤) 具有良好的抑制作用[38]。 也有學(xué)者研究了竹葉提取物的藥理學(xué)作用， 并將其應(yīng)用在治療癌癥上， 取得了良好效果。隨著醫(yī)療科技的進(jìn)步和人們對(duì)天然藥物的需求，竹葉黃酮作為新生代天然化學(xué)產(chǎn)物將是未來(lái)的一大研究方向。 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院王兆斌[39]等通過(guò)體外、 體內(nèi)和動(dòng)物模型以及藥理實(shí)驗(yàn)， 研究了竹葉黃酮在心腦血管診斷中的作用， 研究發(fā)現(xiàn)竹葉黃酮對(duì)防止腦缺血有一定的作用。 竹葉黃酮有潛力成為預(yù)防心腦血管疾病的天然藥物。

3) 在日化產(chǎn)品中的應(yīng)用。 竹葉黃酮可以清除自由基、 抗輻射、 抑菌和抑制酪氨酸酶活性， 加快細(xì)胞的新陳代謝， 延緩表皮組織細(xì)胞衰老， 將自由基對(duì)人體細(xì)胞的傷害降到最低； 另外， 皮膚上的色素沉著主要是因?yàn)槔野彼崦笗?huì)促進(jìn)酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴色素， 經(jīng)一系列轉(zhuǎn)化變?yōu)楹谏兀?竹葉黃酮抑制酪氨酸酶活性， 可以達(dá)到美白皮膚等效果。 Lu 等[40]研究表明竹葉黃酮在皮膚上使用時(shí)不會(huì)刺激人體的粘膜和皮膚， 綠色安全， 無(wú)任何毒副作用， 因此可以將竹葉黃酮抗衰老、 抗氧化等功能性因子作為一種添加劑應(yīng)用在護(hù)手霜和防曬霜等日化產(chǎn)品中， 達(dá)到實(shí)物化利用。

4) 在其他方面的應(yīng)用。 竹葉黃酮作為一種具有多重生理功效的新型天然活性物質(zhì)， 也可應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中， 楊仕群等[41]對(duì)竹葉黃酮在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用做了較為詳細(xì)的闡述。 張運(yùn)紅等[42]以液體溶劑的形式對(duì)辣椒幼苗噴灑一定濃度的竹葉黃酮水溶液， 發(fā)現(xiàn)在辣椒發(fā)育過(guò)程中竹葉黃酮能提高辣椒的抗寒性并促進(jìn)辣椒的生長(zhǎng)。

4 竹葉黃酮工業(yè)化利用的發(fā)展趨勢(shì)

竹葉黃酮類化合物具有獨(dú)特的生物活性， 在很多行業(yè)領(lǐng)域都有較好的應(yīng)用前景， 因此竹葉黃酮的研究開(kāi)發(fā)一直都是學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。 然而，在相關(guān)研究領(lǐng)域還存在許多尚待解決的問(wèn)題， 比如竹葉黃酮類化合物的提取率較低， 含量測(cè)定方法不完善和應(yīng)用難以領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化等。 下一步研究的重點(diǎn)和方向應(yīng)是:

一是聯(lián)合提取法或者不同方法協(xié)同使用。 目前提取和純化分離竹葉黃酮的各種方法各有利弊，可結(jié)合各類方法的優(yōu)點(diǎn)組合成更多的聯(lián)合提取法或是不同方法協(xié)同使用， 篩選出更優(yōu)、 更適合的提取和純化分離的方法， 并應(yīng)用現(xiàn)代提取、 分離新工藝進(jìn)行竹葉黃酮等活性成分的提取和精制，提高竹葉黃酮提取得率和質(zhì)量， 增強(qiáng)產(chǎn)品的生物活性和生理功能， 減少雜質(zhì)和無(wú)效成分的副作用。

二是建立高效、 準(zhǔn)確測(cè)定竹葉黃酮類化合物含量的方法。 目前竹葉黃酮的測(cè)定方法一般采用比色法或液相色譜法， 比色法更為普遍， 經(jīng)過(guò)改進(jìn)后的比色法能克服一些常規(guī)比色法的弊端， 測(cè)量結(jié)果與HPLC 法相當(dāng)， 但目前還沒(méi)見(jiàn)到改進(jìn)比色法和HPLC 法二者比較的報(bào)道。

三是竹葉黃酮工業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。 竹葉黃酮類化合物具有優(yōu)良的清除氧自由基、 降低血脂、 抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖、 降低表皮組織細(xì)胞老化速度和降低心肌缺血風(fēng)險(xiǎn)等功效， 為科研工作者提供了豐富的想象空間， 也為竹葉黃酮類化合物應(yīng)用于保健食品功能因子、 膳食補(bǔ)充劑和天然藥物的開(kāi)發(fā)及功能定位提供了獨(dú)到的著力點(diǎn)。 雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量關(guān)于竹葉黃酮提取方法的研究成果， 但是這些成果存在一定的局限性， 還無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)量產(chǎn)化應(yīng)用， 未能將其應(yīng)用到民生領(lǐng)域。 如何快速、 高效地將竹葉黃酮產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化也將是下一步研究的重點(diǎn)。