耐鹽薄荷的離體培養(yǎng)與植株再生的研究

王貽蓮,魏艷麗,李紀順,楊合同

(山東省科學院中日友好生物技術(shù)研究中心/山東省應用微生物重點實驗室,濟南,250014)

耐鹽薄荷的離體培養(yǎng)與植株再生的研究

王貽蓮,魏艷麗,李紀順,楊合同

(山東省科學院中日友好生物技術(shù)研究中心/山東省應用微生物重點實驗室,濟南,250014)

為研究耐鹽薄荷的快速繁育技術(shù)，以耐鹽的椒樣薄荷莖段為外植體，采用正交試驗4（23）篩選其愈傷誘導培養(yǎng)基。研究結(jié)果表明，NAA是影響耐鹽薄荷誘導愈傷能力的重要因素，其最適濃度為0.2 mg/L，愈傷誘導率達92%以上。在此基礎(chǔ)上，通過擴大培養(yǎng)基中6-BA濃度進行不定芽增殖培養(yǎng)基篩選，最終確定增殖培養(yǎng)基為2/3 MS+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂，pH值6.0（滅菌前）；此培養(yǎng)基下培養(yǎng)，增殖系數(shù)達19.23。在誘導生根培養(yǎng)基的篩選中，綜合分析植株生長量（株高）、生根數(shù)量（根數(shù)）及根生長量（根長），確定生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂，pH值6.0。

椒樣薄荷；離體培養(yǎng)；誘導；增殖；植株再生

土壤鹽漬化問題是困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大難題。當前,世界上灌溉地面積約為230 Mhm2,其中遭鹽害影響的土壤約占45 Mhm2。旱地農(nóng)業(yè)面積約為1 500 Mhm2,其中遭鹽害影響的土壤約占32 Mhm2。耕地土壤鹽漬化的退化面積正在以3 hm2/min的速度增長。據(jù)FAO估計,世界范圍內(nèi),每年因鹽害喪失生產(chǎn)力的土地面積達0.25 M～0.50 Mhm2[1]。就我國而言,在1億hm2耕地中有667萬hm2鹽堿化土壤,另有0.346億hm2鹽堿荒地[2]。隨著人口的劇增及工業(yè)的高速發(fā)展,我國可耕地面積急劇下降,同時,不合理灌溉又造成了大量良田的次生鹽漬化。因此,開發(fā)和利用大面積鹽漬化土地,利用耐鹽植物資源發(fā)展鹽漬地生態(tài)農(nóng)業(yè)十分必要。

耐鹽薄荷是山東省科學院中日友好生物技術(shù)研究中心經(jīng)耐鹽性試驗篩選出的,系椒樣薄荷的一種,耐受NaCl脅迫濃度為0.8%。耐鹽薄荷除具有薄荷的一般功效外,還因具有耐鹽堿性而作為藥賞兩用植物逐漸被關(guān)注。耐鹽薄荷是水薄荷與綠薄荷雜交而成的一個不育性中間類型,以分株繁殖為主。但長期采用無性繁殖,易發(fā)生病害,引起品種退化和產(chǎn)量、質(zhì)量下降[3,4]。研究證明,成熟完善的植物組織培養(yǎng)技術(shù)是解決品種退化和更新的有效手段之一[5,6]。因此,本研究以耐鹽的椒樣薄荷莖段為外植體,對其離體培養(yǎng)及植株再生條件進行了研究,以期為耐鹽薄荷的品種改良和快速繁殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試薄荷外植體取自山東省科學院生物中心中澳鹽生植物實驗基地。

1.2 試驗方法

①外植體滅菌 從苗圃中取生長旺盛的薄荷植株,去葉留莖和芽點,流水沖洗20 min后,用濾紙吸干水分,在超凈工作臺上用75%酒精消毒1 min、0.1%HgCl2溶液消毒8～10 min后,用無菌水沖洗4～5遍,吸干水后用手術(shù)剪對外植體進行修剪,截取長度2～3 cm的莖段,并將其接種在1/2 MS培養(yǎng)基中,置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后挑取無污染莖段轉(zhuǎn)接至愈傷誘導培養(yǎng)基中。

③不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選 取3 cm長的健壯無菌苗,接種到不同濃度6-BA和NAA配比的2/3 MS培養(yǎng)基中,并添加30 g/L蔗糖和4 g/L瓊脂進行不定芽誘導。培養(yǎng)50 d(期間轉(zhuǎn)接1次)后,調(diào)查增殖系數(shù)。不定芽增殖系數(shù)(%)=不定芽總數(shù)/接種的莖段數(shù)×100%。

表1 愈傷誘導培養(yǎng)基正交試驗因素和水平設(shè)計

④生根培養(yǎng)基的篩選取3 cm長的健壯無根苗,接種到不同濃度6-BA和NAA配比的1/2 MS培養(yǎng)基中,并添加30 g/L蔗糖和4 g/L瓊脂進行生根誘導。培養(yǎng)2周后,統(tǒng)計植株生長量(株高)、生根數(shù)量(根數(shù))及根生長量(根長),3周后進行比較分析。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 不同培養(yǎng)基的增殖效果

⑤培養(yǎng)條件以上每個處理各接種5瓶,每瓶5株,重復5次。培養(yǎng)基pH值均為6.0(滅菌前),光照培養(yǎng)箱溫度(24±2)℃,生根光照時間12 h/d(日光燈光照強度2 000 lx),其他光照時間14 h/d。

對所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件包計算方差,對處理間進行0.05水平上的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷誘導培養(yǎng)基的篩選

由表2可知,正交優(yōu)選配方為A(1,2)B1C2,即1/2 MS(2/3 MS)+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂。由值可知,NAA(C)是重要因素,6-BA(B)是較重要因素,MS(A)是影響較小因素,即影響因素C＞B＞A。因此,通過該試驗確定NAA是耐鹽薄荷誘導愈傷能力的重要因素,其最適濃度為0.2 mg/L,此條件下愈傷誘導率達92%以上。

2.2 不定芽增殖培養(yǎng)基的篩選

由表3可知,在NAA(0.2 mg/L)濃度相同,6-BA濃度小于6.0 mg/L的情況下,不定芽的增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增加(配方B除外)。結(jié)果表明,配方G的增殖系數(shù)最高,達19.23,且與配方A,B,C,D,E,H間存在顯著差異。因此,通過該試驗確定耐鹽薄荷的增殖培養(yǎng)基為2/3 MS+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂,pH值6.0。

表4 不同培養(yǎng)基的誘根效果

2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

由表4可知,耐鹽薄荷在不同濃度6-BA和NAA配比的培養(yǎng)基中誘根效果不同。綜合植株生長量(株高)、生根數(shù)量(根數(shù))及根生長量(根長)來看,不添加6-BA更有利于耐鹽薄荷生根,如配方①、⑧、⑨與其他配方之間差異顯著。當6-BA濃度為0時,誘根效果并不是隨NAA濃度的增加而增加,如誘根3周時,植株生長量基本是隨NAA濃度的增加而遞減的,且①、⑧、⑨號配方間差異顯著,生根數(shù)量最多的是⑨號配方,根生長量最大的是①號配方?？紤]到生根培養(yǎng)基應以生根數(shù)量為重要指標,故確定⑨號培養(yǎng)基為最佳配方,即1/2 MS+ 0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂,pH值6.0。

3 結(jié)論與討論

影響椒樣薄荷組織培養(yǎng)的因素很多,如溫度、光照、濕度、外植體種類、培養(yǎng)基成分、植物激素、接種密度等[4,7]。本試驗是在外界培養(yǎng)條件不變的情況下,采用耐鹽的椒樣薄荷莖段為愈傷組織的誘導材料,在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA,篩選愈傷誘導培養(yǎng)基、不定芽增殖培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基。結(jié)果表明,NAA對愈傷組織的形成影響最大。在不定芽增殖過程中,NAA濃度為0.2 mg/L時,不定芽的增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增大,但6-BA濃度不宜超過5.0 mg/L。因此,本研究確定分化耐鹽薄荷不定芽的最佳培養(yǎng)基為2/3 MS+5.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+4 g/L瓊脂,pH值6.0。

據(jù)王小敏等[4]報道,椒樣薄荷的組織培養(yǎng)較薄荷對激素濃度的要求低,椒樣薄荷只需較低的植物激素即可滿足分化增殖和生根的需要,這可能與不同植物內(nèi)源激素含量不同相關(guān)。本試驗表明,高濃度6-BA(5.0 mg/L)與低濃度NAA(0.2 mg/L)有利于耐鹽椒樣薄荷不定芽的增殖,增殖系數(shù)達19.23。耐鹽椒樣薄荷極易生根,只需在1/2 MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加少量的NAA(0.2 mg/L)進行瓶內(nèi)生根誘導即可,這與李曉東等[8]研究結(jié)果相一致。

[1]王小彬.關(guān)注水資源利用與氣候變化對土壤鹽漬化的重疊影響[J].中國土壤與肥料,2009(2):80.

[2]賈利霞,張眾.NaCl脅迫對苜蓿種子萌發(fā)的影響[J].內(nèi)蒙古草業(yè),2008,20(1):40-42.

[3]張俠,宋莉璐,任艷,等.椒樣薄荷對NaCl脅迫的生理響應[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(13):5 967-5 969.

[4]王小敏,李維林,梁呈元,等.椒樣薄荷的組織培養(yǎng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2007,35(11):3 159-3 160,3 162.

[5]陳英.植物體細胞無性系變異與育種[M].南京:江蘇科學技術(shù)出版社,1991:1-10.

[6]王茂斌,馬宗新,趙紅,等.薄荷品種提純途徑及程序[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2002,28(2):235-236.

[7]錢森和,厲榮玉,王洲,等.薄荷離體培養(yǎng)及植株再生的研究[J].作物雜志,2008(6):41-44.

[8]李曉東,程智慧,文志華,等.唇萼薄荷的組織培養(yǎng)與植株再生[J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2007,35(1): 87-90.

Tissue Culture and Plantlet Regeneration of Salt-tolerant Mint

In order to research the rapid propagation technology of salt-tolerant mint,we took the stem segments of salttolerant mint as explants to screen out suitable callus induction medium by using the orthogonal design4(23).The results showed that naphthylacetic acid(NAA)was the important factors affecting the callus induction ability of salt-tolerant mint, and its optimum concentration was 0.2 mg/L with the callus induction rate over 92%.On this basis,we screened out the proliferation medium by increasing the concentration of 6-BA,and the optimum proliferation medium was 2/3 MS+5.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L sucrose+4 g/L gelose,with the pH value of 6.0(prior to sterilization),and the multiplication coefficient was 19.23.Taking plant growth(height),root number(root number)and root growth(root length)into account, the best rooting culture medium was 1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L sucrose+4 g/L gelose,with the pH value of 6.0.

culture;Induction;Proliferation;Plantlet regeneration

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.04.004

國際科技合作項目（2007DFA30630），國際科技合作項目（2011DFA30990）

王貽蓮（1978-），女，碩士，助理研究員，從事應用生物的研究，電話：13573791095，E-mail：yilianwang@163.com

楊合同，通信作者，電話：13953109086，E-mail：yanght@keylab.net

2012-12-05