茶樹NPF5基因克隆及其在不同氮素處理下的表達

唐 君,代 祥,李貴飛,,穆 兵,王 楓,楊亦揚

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

茶樹是葉用植物,生長過程中對氮肥的要求高。適宜的氮肥用量可以提高茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。由于茶園管理粗放,施入的氮肥往往過量。據(jù)調(diào)查,我國有30%的茶園土壤氮肥施用過量[2]。不僅造成資源浪費,還會加劇土壤酸化和水體富營養(yǎng)化[3],同時對茶葉品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[4]。通過精準施肥和選用氮高效品種,可以顯著提高茶園氮素利用率。研究表明,20年生的茗豐茶園,與習(xí)慣施肥相比,化學(xué)氮肥減施27.8%,產(chǎn)量不減[5]。篩選出黃棪對低氮不敏感,屬于氮高效茶樹品種[6]。

雖然目前關(guān)于NPF基因的研究已有較多報道,但大多集中在模式植物擬南芥、水稻中[9],而對于茶樹中的NPF基因鑒定及功能研究報道較少。為探討NPF蛋白在茶樹氮素響應(yīng)方面的功能,本研究克隆得到一個受氮素處理誘導(dǎo)表達的NPF轉(zhuǎn)錄本,根據(jù)其在茶樹基因組上分布位置,將其命名為CsNPF5。對該基因進行了生物信息學(xué)分析,研究CsNPF5在不同氮素水平下的表達模式,以期為進一步研究CsNPF5基因功能、提高氮素利用率并選育氮高效茶樹品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.2 CsNPF5基因克隆

基于茶樹基因組序列信息,設(shè)計CsNPF5基因全長擴增引物T1和T2(表1)在茶樹gDNA中和cDNA中擴增NPF5基因序列,通過對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳、切膠回收并連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,經(jīng)培養(yǎng)挑取陽性單菌落進行測序,并將測序序列在茶樹基因組中檢索驗證該基因存在,即克隆CsNPF5基因全長。

表1 PCR擴增的引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR amplification

1.3 CsNPF5基因染色體定位

利用克隆的CsNPF5基因序列,通過搜索茶樹基因組數(shù)據(jù)庫Tea Plant Information Archive(TPIA,http://tpdb.shengxin.ren/index.html),獲得與CsNPF5基因序列完全匹配的基因組位置信息和基因ID,對CsNPF5進行全基因組染色體分布定位及基因拷貝數(shù)分析。

1.4 CsNPF5基因序列分析

利用DNAMAN進行不同物種中CsNPF5基因同源序列的多序列比對。用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行CsNPF5基因的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)預(yù)測。用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線工具進行CsNPF5蛋白保守域預(yù)測。用ExPASy Compute pI/MW(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)在線工具進行蛋白分子量和等電點計算。用CsNPF5蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其他物種中該蛋白的同源序列,用MEGA 10軟件[20],將獲得的同源序列以鄰接法(Neighbor-joining,NJ;bootstrap=1 000)構(gòu)建進化樹。用TMHMM 軟件(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)預(yù)測蛋白亞細胞定位。

1.5 CsNPF5基因表達分析

利用Primer 6設(shè)計目的基因特異性定量引物(T3和T4)。以茶樹GAPDH[21]為內(nèi)參基因(T5和T6),熒光定量反應(yīng)體系TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa, Code No. RR820A) 10 μL,特異引物各1 μL(4 μmol/L),cDNA 模板1 μL(50 ng/μL),加雙蒸水到7 μL,終體積 20 μL。充分混勻,短暫離心后,于 ABI7500 Fast 實時定量PCR儀上進行熒光定量PCR擴增,參數(shù)為:95 ℃ 3 min預(yù)變性;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃10 s,40個循環(huán),每個循環(huán)結(jié)束時采集熒光信號,每個反應(yīng)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),2個技術(shù)重復(fù),最后采用2-ΔΔCt法來計算基因相對表達量,并采用ANOVA進行Duncan′s多重比較分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsNPF5基因gDNA和cDNA序列的克隆

利用引物T1和T2分別在茶樹葉片gDNA和氮素處理茶樹葉片cDNA文庫中,進行茶樹CsNPF5基因gDNA和cDNA序列PCR擴增,PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,擴增產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp(圖1),經(jīng)測序確認,以gDNA為模板的PCR擴增,獲得PCR擴增產(chǎn)物長度為2 096 bp,而以cDNA為模板,獲得PCR擴增產(chǎn)物長度為1 440 bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫中用ORF Finder分析擴增基因序列的編碼框,經(jīng)檢索ORF Finder分析測序,cDNA序列恰好包含一個完整基因編碼框,即擴增基因cNDA全長為1 440 bp,編碼479個氨基酸(圖2)。通過拼接PCR擴增的基因gDNA和cDNA序列,指出該基因包含2個內(nèi)含子和3個外顯子(圖3),經(jīng)比對NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該基因序列與中華獼猴桃NPF8.1(GenBank:PSS34634.1)具有較高的相似性,達79.54%,檢索茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(TPIA)NPF同源基因,發(fā)現(xiàn)該基因是位于茶樹1號染色體上的第5個NPF基因,故將其命名為CsNPF5。

M.2000 bp DNA Ladder;1.以cDNA為模板目的基因PCR擴增產(chǎn)物;2.以gDNA為模板目的基因PCR擴增產(chǎn)物。M.2 000 bp DNA Ladder;1.The PCR amplification product,which was obtained by using cDNA as a template to amplify the target gene;2.The PCR amplification product,which was obtained by using gDNA as a template to amplify the target gene.圖1 CsNPF5基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of CsNPF5 gene

陰影部分.指示PTR2結(jié)構(gòu)域在CsNPF5蛋白上的分布;紅色的ATG.起始密碼子;*.終止密碼子。Shaded area.Indicates the distribution of the PTR2 domain in CsNPF5 protein;Red ATG.Initiation codon;*.Termination codon.圖2 CsNPF5基因序列特征Fig.2 Sequence characteristics of CsNPF5 gene

圖3 CsNPF5基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of CsNPF5

2.2 CsNPF5 的染色體定位

以gDNA為模板的PCR擴增的CsNPF5序列作為搜索序列,在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源搜索,得到一個與CsNPF5基因序列完全相同的基因座(TEA015944.1)序列,獲得CsNPF5基因座物理位置信息為Chr1:226371356—226373449(-),指出CsNPF5基因定位于茶樹1號染色體上,且為單拷貝基因。

2.3 CsNPF5基因及其編碼蛋白序列分析

開放閱讀框分析指出,CsNPF5基因開放閱讀框全長為1 400 bp,編碼479個氨基酸,相對分子量53.12 ku,等電點7.13,包含一個PTR2保守結(jié)構(gòu)域?；蚪Y(jié)構(gòu)分析指出,CsNPF5基因的3個外顯子長度分別為540,48,844 bp,2個內(nèi)含子大小為105,549 bp。InterPro在線工具對CsNPF5基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明,CsNPF5蛋白的第2—403位氨基酸具有NPF蛋白家族共有的PRT2保守結(jié)構(gòu)域。對CsNPF5基因內(nèi)含子的剪切位點進行分析,結(jié)果表明,該基因的內(nèi)含子都符合經(jīng)典的GT-AG剪切法則,且CsNPF5基因的PRT2結(jié)構(gòu)域包含一個內(nèi)含子,這與植物NPF基因的內(nèi)含子分布模式一致。同時PSORT在線工具預(yù)測CsNPF5蛋白的亞細胞定位,結(jié)果指出CsNPF5蛋白定位于細胞質(zhì)中,這表明該蛋白具有在植物細胞核外行使功能的潛力。同時TMHMM分析結(jié)果表明,CsNPF5蛋白具有7個跨膜區(qū),符合NPF蛋白家族具有多跨膜區(qū)細胞核外行使功能的特征。

2.4 CsNPF5基因編碼蛋白的同源性及系統(tǒng)進化分析

以CsNPF5蛋白的氨基酸序列為搜索序列,用Blast搜索NCBI數(shù)據(jù)庫中與CsNPF5蛋白同源的蛋白,將搜索得到的不同物種中的同源蛋白用DNAMAN進行序列比對,發(fā)現(xiàn)CsNPF5蛋白與已報道的茶樹(Camelliasinensis)、中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、甜櫻桃(Prunusavium)、辣椒(Capsicumannuum)、中華辣椒(Capsicumchinense)、毛果楊(Populustrichocarpa)、木薯(Manihotesculenta)、葡萄(Vitisvinifera)、野生番茄(Solanumpennellii)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、月季(Rosachinensis)和歐洲草莓(Fragariavesca)中的NPF蛋白均具有同源性,聚類分析指出,這些NPF蛋白可分三類,其中茶樹CsNPF與中華獼猴桃NPF蛋白相似性較高,達79.54%,聚在同一進化支(圖 4),進一步表明CsNPF5保守的PRT2結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的植物NPF結(jié)構(gòu)是一致的。

節(jié)點自展值小于50%不顯示。The bootstrap values of nodes less than 50% is not displayed.圖4 不同植物中CsNPF5同源蛋白的聚類分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CsNPF5 orthologous proteins from different plants

2.5 氮素處理下茶樹CsNPF5基因表達分析

不同小寫字母表示不同氮素處理下CsNPF5表達差異達顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)of CsNPF5 expression under different nitrogen treatments.圖5 不同氮素處理下CsNPF5的相對表達模式Fig.5 Expression patterns of CsNPF5 gene under different nitrogen treatments

3 結(jié)論與討論

植物中轉(zhuǎn)運硝態(tài)氮的基因家族成員,功能不盡相同。PtNRTs基因在白楊的不同組織具有不同的表達模式,表明這些基因在白楊代謝過程中起著不同的作用[22]。硝態(tài)氮誘導(dǎo)能夠激活或抑制轉(zhuǎn)運蛋白家族中成員的表達。在擬南芥的根和葉中,AtNRT1.1、AtNRT2.1和AtNRT2.2能夠被硝態(tài)氮強烈誘導(dǎo)表達,AtNRT2.4雖被誘導(dǎo),但是表達量差異不顯著,AtNRT2.5的表達則會被氮素抑制[23]。茶樹中,硝態(tài)氮誘導(dǎo)下,CsNRT1.1和CsNRT1.2幼嫩葉中表達量上升,CsNRT1.7在成熟葉中表達量上升,CsNRT2.4則會在根中大量表達[18]。本試驗結(jié)果表明,CsNPF5在葉中的表達受到硝態(tài)氮的誘導(dǎo)。且硝態(tài)氮濃度越高,CsNPF5達到表達量的頂峰的時間就越快。硝態(tài)氮濃度越高,可能硝態(tài)氮受體就越容易感受到硝態(tài)氮信號,作為下游基因的CsNPF5表達也更快。目前,對植物感受硝態(tài)氮信號并作出響應(yīng)的機制的研究已取得很大的進展。環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)是動植物中普遍存在的離子通道[24]。擬南芥中,NRT1.1蛋白與CNGC15蛋白在質(zhì)膜上形成復(fù)合物,抑制CNGC15的Ca2+通道活性,NRT1.1感受到外界硝態(tài)氮信號后,NRT1.1-CNGC15復(fù)合物解離,CNGC15恢復(fù)正常功能,鈣離子內(nèi)流,隨之,轉(zhuǎn)錄因子NLP7被蛋白激酶磷酸化,進入細胞核激活一級硝態(tài)氮響應(yīng)[25]。一般可認為外界1 mmol/L的硝態(tài)氮濃度是硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白高低親和系統(tǒng)轉(zhuǎn)換的分界線[26]。本試驗中,在0.2,10 mmol/L的NO3-離子處理下,CsNPF5基因表達量都出現(xiàn)了一定程度的上調(diào)。說明該基因可能是雙親和的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白。

茶樹CsNRT2.4基因在擬南芥中過表達,可以增加擬南芥的根長、鮮質(zhì)量以及根在低氮素水平下的氮素吸收效率,提高氮素利用率[18]。CsNRT2.4和CsNRT3.2在中茶108和龍井43均會被硝酸鹽誘導(dǎo)表達,但與中茶108相比,龍井43中的CsNRT2.4和CsNRT3.2表達量更高,說明龍井43的對外界氮素的響應(yīng)更快[27]。有研究表明,龍井43屬于氮高效茶樹品種[28]。說明CsNRT2.4和CsNRT3.2表達量可以反映某一茶樹品種硝態(tài)氮的吸收能力[27]。對CsNPF5是否能反映某一茶樹品種的硝態(tài)氮吸收能力,還有待進一步研究。不過NO3-的吸收轉(zhuǎn)運調(diào)控是一個相當復(fù)雜的過程,涉及同化、運輸和信號傳遞的多個相互關(guān)聯(lián)的步驟,往往通過幾個基因的表達量的差異看不出該品種是否為氮高效的茶樹品種。因此,為了選育耐低氮和氮高效的茶樹品種,還需要對硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運的基因或者蛋白進行系統(tǒng)的研究。