玉米PLATZ基因GRMZM2G006585啟動子的克隆及表達分析

王亞麗,魏琦超,李成偉

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院,河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001)

玉米(Zeamays)起源于美洲大陸,栽培歷史悠久,與水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)合稱為我國三大糧食作物,2021年國家統(tǒng)計局對全國31 個省(區(qū)、市)的統(tǒng)計結(jié)果表明,在播種面積和總產(chǎn)量2 項指標上,玉米均居糧食作物首位,分別為4 332.41萬hm2、27 255.2萬t。玉米具有類型多、用途廣、產(chǎn)量高、分布廣的特點,集糧(糧食)、經(jīng)(經(jīng)濟)、飼(飼料)3種用途于一身,開發(fā)潛力大[1]。

植物生物反應(yīng)器(Plant bioreactor)是指利用植物細胞、組織、器官或整株植株大量生產(chǎn)具有重要功能的蛋白質(zhì)或次生代謝產(chǎn)物等[2]。就藥用或飼用等蛋白質(zhì)的異源表達而言,以使用種子特異性啟動子驅(qū)動目標蛋白基因在受體植物種子中特異性表達為典型特征的種子生物反應(yīng)器,除具有植物生物反應(yīng)器的一般優(yōu)點(如成本低、易擴大、安全性好等[3])外,還具有以下優(yōu)勢:①種子在成熟過程中,含水量逐漸下降,蛋白酶活性也隨之降低,有助于外源蛋白的積累。待種子成熟,蛋白質(zhì)可在種子中長期保存且不影響活性,便于運輸和貯存[4]。②若種子本身可用作食物來源或飼料,則轉(zhuǎn)基因種子生產(chǎn)的蛋白質(zhì)可以在沒有純化的情況下使用,進而降低生產(chǎn)成本[5]。③外源蛋白在種子中特異性積累,一般不影響營養(yǎng)器官的生長[6]。

玉米、水稻等禾本科(Poaceae)植物的種子實際是其果實,植物學(xué)上稱為穎果(Caryopsis),俗稱籽粒(Grain)[7]。近年來,籽粒生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域取得了諸多進展:用水稻胚乳特異性啟動子Gt13a驅(qū)動人血白蛋白(Human serum albumin,HSA)在水稻籽粒中表達,該植物源性制品在理化性質(zhì)、生物學(xué)活性方面與傳統(tǒng)血源性制品一致[8];以玉米胚乳特異性啟動子Leg1A驅(qū)動植酸酶基因在玉米籽粒中表達,籽粒可直接用于飼料加工,無須對其進行純化等,降低了飼料成本[9];通過籽粒特異性啟動子驅(qū)動花青素(Anthocyanin)合成途徑相關(guān)基因的特異性表達,在水稻、玉米籽粒中均成功實現(xiàn)了花青素的積累[10-11]。

籽粒特異性啟動子是構(gòu)建目標基因表達載體,開展籽粒生物反應(yīng)器研究的前提條件之一。Qu等[12-13]以已知的水稻貯藏蛋白基因為切入點,克隆了GluB-4、GluC等多個水稻胚乳特異性啟動子。近年來,隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)數(shù)據(jù)的日益豐富,基于基因表達數(shù)據(jù)開展特異性啟動子的發(fā)掘工作,已有成功案例[14]。玉米表達譜芯片數(shù)據(jù)(Expression profile microarray)已于2011年公布[15],本研究擬對該數(shù)據(jù)進行分析,綜合考慮基因在不同組織器官、發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度,篩選出玉米籽粒高轉(zhuǎn)錄本豐度基因,克隆其編碼區(qū)上游序列并開展功能鑒定工作,以期獲得未報道的籽粒特異性啟動子,為玉米、水稻等禾本科植物籽粒生物反應(yīng)器的載體構(gòu)建流程提供候選啟動子資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 玉米自交系B104、水稻自交系中花11、擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞生態(tài)型(Columbia 0,Col0),其種子均由河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和分子生物學(xué)試劑 大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本中心提供,根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105、GV3101(pMP90)感受態(tài)細胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

載體pMD19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司,pCAMBIA1301(PCaMV35S∷GUS∷Tnos)、pENTRY(PCaMV35S∷GUS∷T35S)、pEarleyGate303均由本中心保存。

Flying SharkTMUniversal Plant RNA Isolation Kit(DNase I)購自北京諾貝萊生物科技有限公司,PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,Phire Plant Direct PCR Kit購自賽默飛世爾科技公司,pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit、EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,HiPure SF Plant DNA Mini Kit購自上海玉博生物科技有限公司,Super-Bradford Protein Assay Kit購自康為世紀有限公司,MonAmpTMSYBR? Green qPCR Mix、MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2購自莫納(武漢)生物科技有限公司,NotⅠ、AsiS Ⅰ、EcoR Ⅰ、NcoⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB(北京)有限公司,Gateway? LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix購自Invitrogen life technology公司(美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 高豐度籽粒特異性表達基因的表達譜分析 通過對玉米表達譜芯片數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)GRMZM2G006585在授粉后2,4 d等12 個不同發(fā)育時期籽粒中的表達量明顯高于其在根、莖、葉等營養(yǎng)器官中的表達量,故選擇該基因為研究對象。為了進一步明確該基因在不同組織(器官)中的表達量,利用Primer 6.0軟件,設(shè)計玉米組成型內(nèi)參基因(ZmTubulin[16]、ZmGAPDH[4])及GRMZM2G006585的特異性引物(表1)。收集大田種植的長勢一致且生長狀況良好的玉米根、莖、葉、花藥、花粉、苞葉、花絲、穗軸、不同時期的籽粒等組織(器官),提取其總RNA,對獲得的RNA溶液進行定量,取2.5 μg RNA采用PrimeScriptTMⅡ 1stStrand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,采用常規(guī)PCR技術(shù)分析待研基因的表達模式,并與公開的表達譜數(shù)據(jù)進行比較,判斷待研基因是否為籽粒特異性表達基因。

表1 表達譜分析用引物Tab.1 Primers for expression profile analysis

1.2.2 高豐度籽粒特異性表達基因在籽粒不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度分析 為了評估GRMZM2G006585的表達量,以ZmTubulin為內(nèi)參,選擇已報道的玉米籽粒特異性表達基因ZmZein27[17]、ZmLeg1[18]為對照,對玉米籽粒不同發(fā)育時期GRMZM2G006585進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。ZmTubulin、GRMZM2G006585引物同表1,其余基因qRT-PCR引物見表2,產(chǎn)物長度為80～150 bp。以玉米籽粒不同發(fā)育時期的cDNA為模板,采用MonAmpTMSYBR? Green qPCR Mix試劑盒進行qRT-PCR分析。

表2 實時熒光定量PCR引物Tab.2 Real time fluorescence quantitative PCR primers

1.2.3 籽粒特異性表達基因編碼區(qū)上游序列的順式作用元件注釋 以苗期的玉米葉片為材料,參照HiPure SF Plant DNA Mini Kit說明書提取玉米基因組DNA。根據(jù)Ensembl database(http://plants.ensembl.org/)網(wǎng)站公布的基因序列信息,以玉米基因組DNA為模板,對GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列進行克隆。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action)等網(wǎng)站的在線工具,對GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列進行啟動子順式作用元件預(yù)測。

1.2.4 啟動子序列驅(qū)動β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)表達載體的構(gòu)建(水稻遺傳轉(zhuǎn)化用) 將GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列參照pMD19-T Vector Cloning Kit說明書連接至pMD19-T Vector克隆載體,以測序無誤的克隆載體為模板,上游、下游引物均添加表達載體同源序列的18個堿基,對GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列進行PCR擴增并切膠回收。參考MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2試劑盒的說明書,將回收后的目的片段連入用EcoR Ⅰ/NcoⅠ雙酶切切除PCaMV35S啟動子的pCAMBIA 1301(PCaMV35S∷GUS∷Tnos)載體。將測序正確的重組載體命名為pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)。

1.2.5 根癌農(nóng)桿菌工程菌株的獲得及水稻的遺傳轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建好的pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)載體采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞,標記為EHA105[pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)]。將根癌農(nóng)桿菌工程菌株交由武漢伯遠生物科技有限公司進行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定工作,其中水稻遺傳轉(zhuǎn)化具體參考Yang等[19]的方法進行。

1.2.6 啟動子驅(qū)動GUS在水稻中表達的組織化學(xué)染色分析 參考Qu等[12]的組織化學(xué)染色方法進行GUS活性檢測。

1.2.7 啟動子序列驅(qū)動GUS表達載體的構(gòu)建(擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化用) 以測序無誤的克隆載體為模板,上游、下游引物均添加入門載體同源序列的18個堿基,對GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列進行PCR擴增并切膠回收。用AsiS Ⅰ/NotⅠ對入門載體pENTRY(PCaMV35S∷GUS∷T35S)進行雙酶切,把啟動子片段PCaMV35S切除,通過瓊脂糖凝膠電泳將條帶分離,切膠回收載體骨架。參考MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2試劑盒方法,將啟動子序列與載體骨架進行連接,重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑單克隆菌落進行菌液PCR鑒定,對陽性克隆測序。將測序正確的重組載體命名為pENTRY(promoter∷GUS∷T35S)。參考Gate way? LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix試劑盒說明書將入門載體pENTRY(promoter∷GUS∷T35S)與目的載體pEarleyGate303進行LR重組反應(yīng),獲得植物表達載體pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)。

1.2.8 根癌農(nóng)桿菌工程菌株的獲得及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 將植物表達載體pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)采用凍融法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞,記為GV3101[pEXPR(promoter∷GUS∷T35S)]。參考Clough等[20]的方法進行野生型擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選工作。

1.2.9 啟動子驅(qū)動GUS在擬南芥中表達的酶活性檢測 參考Brissonnet等[21]的熒光測定法進行GUS活性的檢測。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)分析,GraphPad軟件作圖,SPSS軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GRMZM2G006585在不同組織(器官)的轉(zhuǎn)錄本豐度

下載玉米自交系B73的表達譜芯片數(shù)據(jù),綜合考慮各基因在不同組織器官、發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度,篩選出1個在籽粒中優(yōu)勢表達的基因(GRMZM2G006585)作為研究對象。為了驗證該基因相關(guān)數(shù)據(jù)的準確性,以在玉米不同組織均穩(wěn)定表達的ZmTubulin、ZmGAPDH為內(nèi)參基因,對GRMZM2G006585在玉米B104的根、莖、葉等不同組織(器官)中的表達情況進行分析。結(jié)果表明,GRMZM2G006585僅在授粉后18 d的籽粒中表達,而在根、莖、葉等器官中未見表達(圖1)。

R、ST、L、A、PO、H、SI、C、G分別代表根、莖、葉、花藥、花粉、苞葉、花絲、穗軸、授粉后18 d的籽粒。R,ST,L,A,PO,H,SI,C and G respectively represent root,stem,leaf,anther,pollen,husk,silk,cob and grain at 18 days after pollination.圖1 RT-PCR檢測不同組織(器官)中GRMZM2G006585基因的轉(zhuǎn)錄本豐度Fig.1 Transcriptional abundance of GRMZM2G006585 in different tissues(organs)detected by RT-PCR

2.2 GRMZM2G006585在籽粒不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度

考察啟動子來源基因在籽粒不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度,可初步預(yù)測該啟動子是否具有較強的驅(qū)動下游基因轉(zhuǎn)錄的活性。以授粉后不同時期的玉米籽粒cDNA為模板,以ZmTubulin為內(nèi)參基因,采取qRT-PCR技術(shù)檢測GRMZM2G006585基因在玉米籽粒不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度(圖2)。已報道的籽粒特異性啟動子PZmZein27來源基因ZmZein27,其轉(zhuǎn)錄本在各發(fā)育時期相較于其他基因均表現(xiàn)出較高的豐度,在授粉后32 d,轉(zhuǎn)錄本豐度達到最高,幾乎是ZmLeg1的400倍,初步猜測PZmZein27啟動子為高轉(zhuǎn)錄活性的籽粒特異性啟動子;在籽粒發(fā)育中期GRMZM2G006585的轉(zhuǎn)錄本豐度較ZmLeg1高,初步猜測可能會得到一個比PZmLeg1啟動子轉(zhuǎn)錄活性更高的啟動子。在籽粒發(fā)育過程中,不同基因表現(xiàn)出不同的表達模式:GRMZM2G006585主要在發(fā)育中期表達;ZmLeg1和ZmZein27主要在發(fā)育中后期表達。

DAP3,6,9,12,18,24,32分別代表授粉后3,6,9,12,18,24,32 d。DAP3,6,9,12,18,24,32 represent 3,6,9,12,18,24,32 days after pollination,respectively.圖2 qRT-PCR檢測籽粒不同發(fā)育時期GRMZM2G006585基因的相對轉(zhuǎn)錄本豐度Fig.2 Relative transcript abundance of GRMZM2G006585 at different stages of grain development detected by qRT-PCR

2.3 GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列的啟動子順式作用元件分析

類別Ⅱ(Class Ⅱ)啟動子涉及眾多編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,通常位于該基因編碼區(qū)的上游且富含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。為了初步判斷GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列是否具備啟動子功能,對GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列進行克隆,GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列經(jīng) PCR 擴增出大小為 1 987 bp 的條帶(圖3),對所克隆DNA序列進行了啟動子順式作用元件的檢索工作。結(jié)果表明(圖4),該基因編碼區(qū)上游序列除了含有基本啟動子元件TATA box和轉(zhuǎn)錄起始位點外,還含有ABRE、A/T rich element、E-box等多個籽粒特異性啟動子相關(guān)順式作用元件[22],初步判斷所克隆的玉米籽粒特異性基因編碼區(qū)上游序列具有籽粒特異性啟動子功能,將該編碼區(qū)上游序列命名為PZm2G006585。

M.DNA 標準分子量DL5000+;1. PZm2G006585。M.DNA standard molecular weight DL5000+; 1.PZm2G006585.圖3 GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列克隆Fig.3 Cloning of upstream sequence of GRMZM2G006585 coding region

下劃線表示順式作用元件,+1表示轉(zhuǎn)錄起始位點。Cis-acting elements are indicated by underscores,and the transcription site is indicated by +1.圖4 GRMZM2G006585編碼區(qū)上游序列啟動子順式作用元件分析Fig.4 Promoter cis-acting element analysis of upstream sequence of GRMZM2G006585 coding region

2.4 PZm2G006585驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因水稻中的組織(器官)表達分析

相對玉米而言,水稻具有轉(zhuǎn)化率高、周期短、遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟等優(yōu)點。為了更迅速地驗證所克隆啟動子是否為籽粒特異性啟動子,利用同為禾本科植物的水稻對其進行驗證。將構(gòu)建好的植物表達載體EHA105[pCAMBIA 1301(promoter∷GUS∷Tnos)]進行水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化,得到轉(zhuǎn)基因苗后,對T0轉(zhuǎn)基因水稻組織(器官)和T0轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒(T1籽粒)進行GUS組織化學(xué)染色觀察。

經(jīng)染色,組成型啟動子Pubi著色正常(圖5-A1—D1),缺失啟動子未著色(圖5-A2—D2),說明所采用的水稻材料GUS組織化學(xué)染色方法可靠。PZm2G006585驅(qū)動GUS轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉、花等器官未見藍色(圖5-A3—D3)。作為本研究的陽性對照啟動子,POsGluB-4(圖5-A4—D4)和PZmZein27(圖5-A5—D5)、PZmLeg1(圖5-A6—D6)雖然分別為已報道的水稻和玉米胚乳特異性啟動子[23-24],但POsGluB-4和PZmZein27轉(zhuǎn)基因植株莖段仍有一定程度的著色(圖5-B4—B5)。參照Russell等[17]研究,仍將此類啟動子定義為胚乳特異性啟動子。

A.根;B.莖;C.葉;D.花。1.Pubi;2.缺失啟動子;3.PZm2G006585;4.POsGluB-4;5.PZmZein27;6.PZmLeg1。A.Root; B.Stem; C.Leaf;D.Flower. 1.Pubi; 2.Promoter deletion;3.PZm2G006585; 4.POsGluB-4; 5.PZmZein27; 6.PZmLeg1.圖5 T0轉(zhuǎn)基因水稻多個器官的GUS染色Fig.5 GUS staining of multiple organs in T0 generation of transgenic rice

為了研究各啟動子驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因水稻籽粒發(fā)育不同階段的表達模式,以組成型啟動子Pubi為陽性對照(圖6-A1—G1),缺失啟動子載體轉(zhuǎn)基因材料(圖6-A2—G2)為陰性對照,分別取各啟動子T0轉(zhuǎn)基因水稻開花后3 d(籽粒開始發(fā)育)、7 d(籽粒縱向發(fā)育到達穎殼頂部)、12 d(籽粒橫向發(fā)育完全充盈穎殼)、40 d(籽粒成熟)的籽粒材料進行GUS染色。

A.DAF 3(開花后3 d)穎殼;B.DAF 7 穎果;C.DAF 7 穎殼;D.DAF 12 穎果;E.DAF 12 穎殼;F.DAF 40穎果;G.DAF 40穎殼。1.Pubi;2.缺失啟動子;3.POsGluB-4;4.PZmZein27;5.PZmLeg1;6.PZm2G006585。A.Testa(3 days after flowering, DAF 3); B.Caryopsis(DAF 7);C.Testa(DAF 7); D.Caryopsis (DAF 12); E.Testa(DAF 12); F.Caryopsis(DAF 40); G.Testa(DAF 40) .1.Pubi; 2.Promoter deletion; 3. POsGluB-4; 4.PZmZein27; 5.PZmLeg1; 6.PZm2G006585.圖6 轉(zhuǎn)基因水稻T1籽粒不同發(fā)育階段的GUS染色Fig.6 GUS staining in different developmental stages of T1 generation grains of transgenic rice

本研究將POsGluB-4[23]作為水稻內(nèi)源胚乳特異性啟動子對照,GUS染色結(jié)果表明(圖6-A3—G3),雖然該啟動子在水稻成熟籽粒的胚乳中特異性表達,但未成熟籽粒的穎殼中,其也具有驅(qū)動下游基因轉(zhuǎn)錄的活性,穎殼材料顯示不同程度的藍色。PZmZein27、PZmleg1在籽粒發(fā)育各階段的穎殼和穎果中均具有啟動子活性(圖6-A4—E4、A5—E5),就成熟籽粒而言,其可驅(qū)動GUS在胚乳組織中優(yōu)勢表達(圖6-F4—G4、F5—G5)。

PZm2G006585可驅(qū)動GUS在未成熟籽粒的穎殼和穎果中表達(圖6-A6—F6),在成熟籽粒的穎殼中未檢出GUS活性(圖6-G6);就成熟籽粒的穎果而言,其驅(qū)動GUS在胚中的著色深度明顯高于胚乳組織(圖6-F6)。結(jié)合圖5及前人關(guān)于胚乳特異性啟動子的研究結(jié)果,認為PZm2G006585驅(qū)動外源基因表達的模式為籽粒特異、胚優(yōu)勢表達。

為了較為精細地考察PZm2G006585在水稻籽粒不同發(fā)育階段驅(qū)動外源基因的表達模式,對開花后12,20,30,35,40 d的穎果進行GUS染色。結(jié)果表明,陰性對照(缺失啟動子:圖7-A1)無著色,在開花后12 d,GUS在胚及胚乳中均表達(圖7-A2),隨著籽粒的發(fā)育其在胚乳中的表達量逐漸降低,在開花后40 d,主要在胚中表達(圖7-A3—B1、B2—B3)。

A1.缺失啟動子(DAF 40); A2. PZm2G006585(開花后12 d,DAF 12); A3.PZm2G006585(DAF 20); B1.PZm2G006585(DAF 30); B2.PZm2G006585(DAF 35); B3.PZm2G006585(DAF 40)。A1.Promoter deletion(DAF 40); A2. PZm2G006585(12 days after flowering, DAF 12); A3.PZm2G006585(DAF 20); B1.PZm2G006585(DAF 30); B2.PZm2G006585(DAF 35); B3.PZm2G006585(DAF 40).圖7 PZm2G006585在水稻籽粒中的表達模式Fig.7 Expression pattern of PZm2G006585 in rice grains

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及鑒定

鑒于所克隆的PZm2G006585在水稻成熟籽粒中表現(xiàn)為驅(qū)動外源基因在胚中優(yōu)勢表達,為評估候選基因啟動子序列的轉(zhuǎn)錄強度,選用轉(zhuǎn)化效率高、周期短的擬南芥作為受體材料進行啟動子轉(zhuǎn)錄活性的評價。

利用含有草銨膦和頭孢霉素抗性的MS篩選培養(yǎng)基對擬南芥進行篩選,轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因幼苗表型差異明顯(圖8-A)。以野生型為陰性對照,參照Phire Plant Direct PCR Kit說明書對抗性植株中的GUS進行鑒定,預(yù)期的片段大小為500 bp,部分結(jié)果見圖8-B,篩選出目標條帶與預(yù)期大小一致的轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)孟德爾分離定律(Law of segregation),篩選單拷貝純合體植株(圖8-C)。

A.轉(zhuǎn)基因植株的篩選;B.部分T1陽性株中GUS的 PCR鑒定(M.DNA分子質(zhì)量標準;1—47.轉(zhuǎn)基因擬南芥株系編號;48.陰性對照);C.T3單拷貝純合體幼苗。A.Screening of transgenic plants;B.PCR identification of GUS in some T1 generation positive strains(M.DNA Marker;1—47.Serial number of transgenic Arabidopsis;48.Negative control);C.T3 generation single copy homozygotic seedlings.圖8 單拷貝純合體擬南芥的篩選Fig.8 Screening of single copy homozygous Arabidopsis

2.6 PZm2G006585驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥成熟種子中表達的活性分析

為了比較不同啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄活性的差異,除采用前述的對照啟動子外,增加了菜豆球蛋白基因來源的種子特異性啟動子PPvphas作為雙子葉植物種子特異性啟動子對照。各啟動子單拷貝擬南芥株系種子的GUS活性檢測結(jié)果如圖9所示,PZm2G006585、POsGluB-4、Pubi、PPvphas、PZmLeg1、PZmZein27、缺失啟動子(ΔP)、野生型對照(WT)植株種子的GUS活性平均分別為909.52,5.60,628.73,5 753.20,10.45,15 588.91,5.85,3.76 nmol/(min·mg)。

不同字母代表0.05水平的差異顯著性。Different letters represent significant difference at the 0.05 level.圖9 擬南芥中GUS活性分析Fig.9 GUS activity analysis in Arabidopsis

前期研究表明,玉米籽粒特異性啟動子PZm2G006585可驅(qū)動外源基因在胚中優(yōu)勢表達,故雖然轉(zhuǎn)基因擬南芥的胚乳組織在種子成熟過程會被消耗,但其胚組織中GUS的表達量仍然可以作為評價啟動子轉(zhuǎn)錄活性的依據(jù)。所克隆的PZm2G006585,其轉(zhuǎn)錄活性與組成型啟動子Pubi差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

PLATZ(Plant AT-rich sequence and zinc-binding protein)是一類新型的植物鋅依賴性轉(zhuǎn)錄因子,最早發(fā)現(xiàn)于豌豆(Pisumsativum),命名為PLATZ1,可非特異性結(jié)合于富含A/T序列元件(A/T rich motif)而抑制轉(zhuǎn)錄[25]。本研究基于玉米表達譜芯片數(shù)據(jù)篩選出在籽粒中優(yōu)勢表達基因GRMZM2G006585,Li等[26]的研究發(fā)現(xiàn),GRMZM2G006585的產(chǎn)物floury3為PLATZ類轉(zhuǎn)錄因子,在玉米發(fā)育中的胚乳和胚中表達,而在根、莖、葉等器官不表達。本研究對PZm2G006585驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中表達模式的觀察結(jié)果與其一致。

強轉(zhuǎn)錄活性的種子特異性啟動子可驅(qū)動目標基因在受體植物種子中特異性高水平轉(zhuǎn)錄,是種子生物反應(yīng)器研究領(lǐng)域重要的目標基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。Russell等[17]克隆γ-玉米醇溶蛋白基因編碼區(qū)上游1.1 kb啟動子序列(PZmZein27)。研究發(fā)現(xiàn),該啟動子在胚乳組織中優(yōu)勢表達[17,27]。Boothe等[28]研究發(fā)現(xiàn),在受體植物擬南芥中β-菜豆蛋白基因啟動子PPvphas是參比的6 個種子特異性啟動子中轉(zhuǎn)錄活性最強的。該啟動子的順式作用元件研究較為深入且已成功應(yīng)用于驅(qū)動胰島素在擬南芥種子中特異性高水平表達[23,29]。通過轉(zhuǎn)基因水稻的GUS組織化學(xué)染色試驗發(fā)現(xiàn),所發(fā)掘的PZm2G006585在受體植株的胚中優(yōu)勢表達。為了準確評估該啟動子在胚中的轉(zhuǎn)錄活性,以GUS為報告基因,以PZmZein27、PPvphas等為對照,構(gòu)建了包括PZm2G006585在內(nèi)的多個表達載體;基于快速獲取可供統(tǒng)計分析的單拷貝轉(zhuǎn)基因株系的目的,開展了擬南芥的轉(zhuǎn)化、篩選和外源基因拷貝數(shù)檢測等系列工作。在分析各啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥T3單拷貝株系種子中GUS活性時,發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象:玉米來源的PZmZein27轉(zhuǎn)基因株系的平均酶活性為15 588.91 nmol/(min·mg),顯著高于PPvphas(5 753.20 nmol/(min·mg))。該結(jié)果為雙子葉植物種子生物反應(yīng)器提供了新的候選啟動子資源。

胚特異性啟動子在以玉米籽粒為生物反應(yīng)器的生物技術(shù)應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用,然而,有限的玉米胚特異性啟動子限制了玉米生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用,且啟動子強度較高、組織特異性強的Glb1和Glb2[30]均已被專利化,限制了我國生物技術(shù)育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。柳小慶[31]對胚特異性啟動子進行研究,基于玉米芯片數(shù)據(jù),發(fā)掘了一批玉米胚特異性強的啟動子,首次揭示了玉米、高粱、大豆中存在雙向基因?qū)?并鑒定了玉米中的雙向啟動子。本研究也基于玉米芯片數(shù)據(jù)對玉米來源的籽粒特異性啟動子進行研究,發(fā)現(xiàn)PZm2G006585驅(qū)動外源基因僅在水稻的籽粒中表達,在各營養(yǎng)器官及花中均不表達,可定義為籽粒特異性啟動子;就籽粒染色情況而言,其可驅(qū)動外源基因在胚中優(yōu)勢表達。轉(zhuǎn)基因擬南芥單拷貝株系T3種子中GUS活性檢測結(jié)果表明,PZm2G006585驅(qū)動的GUS活性為909.52 nmol/(min·mg),進一步證明其可驅(qū)動外源蛋白基因在受體植物種子中表達。

綜上,本研究利用玉米表達譜芯片數(shù)據(jù)發(fā)掘出籽粒特異性表達基因GRMZM2G006585,克隆其啟動子PZm2G006585,構(gòu)建了植物表達載體,通過對轉(zhuǎn)基因材料中GUS的組織化學(xué)染色和熒光化學(xué)檢測,認為PZm2G006585為籽粒特異性啟動子,且主要驅(qū)動GUS在胚中優(yōu)勢表達。