甜玉米雄性不育突變體ms2020的表型分析和基因定位

熊才運(yùn),王 陽(yáng),裴 虎,莫海偉,湯蘊(yùn)琦,黃 君,2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,廣東 廣州 510640;2.廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

植物雄性不育(Male sterility,ms),是指植物在有性生殖階段雄性生殖器官發(fā)育異常,不能產(chǎn)生正常的小孢子或雄配子的現(xiàn)象。目前,已經(jīng)在玉米[1]、水稻[2]、油菜[3]、小麥[4]等多種主要農(nóng)作物中觀察到雄性不育現(xiàn)象。雄性不育不僅是研究植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要內(nèi)容,同時(shí)也是雜交育種的有效工具。玉米(ZeamaysL.)是一種雌雄同株的異花授粉作物,由于玉米植株相對(duì)容易分離,利用玉米雄性不育系進(jìn)行雜交制種已經(jīng)成為提高產(chǎn)量的重要途徑[5]。

玉米花藥的發(fā)育過(guò)程極其復(fù)雜,在發(fā)育過(guò)程中任何時(shí)期發(fā)生異常都可能會(huì)對(duì)花粉的育性產(chǎn)生影響。擬南芥[6]、水稻[7-8]等模式植物的花藥發(fā)育過(guò)程研究發(fā)現(xiàn)植物花藥發(fā)育的過(guò)程基本一致。Warmke等[9]將玉米花藥的形成過(guò)程大致分為以下8個(gè)時(shí)期:前胼胝質(zhì)期、中心胼胝質(zhì)期、減數(shù)分裂期、四分體時(shí)期、小孢子單核早期、小孢子單核晚期、二孢花粉時(shí)期、成熟花粉期。利用光學(xué)顯微鏡(Optical Microscope,OM)和電子顯微鏡(Electron Microscope,EM)觀察玉米核不育材料的花藥發(fā)育過(guò)程,發(fā)現(xiàn)育性相關(guān)基因主要影響花藥結(jié)構(gòu)的分化、花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂、花粉壁形成和小孢子發(fā)育等階段,基因功能的異常最終導(dǎo)致敗育表型的產(chǎn)生[10]。目前,已發(fā)現(xiàn)的玉米核不育基因在玉米的10條染色體上均有分布,而且部分基因已經(jīng)完成了克隆,例如ZmMs7[11]、ZmMs33[12]、ZmMs44[13]、ZmMs26[14]、ZmMs30[15]、ZmMS45[16],對(duì)其功能有也有了一些認(rèn)知。

甜玉米作為重要的鮮食玉米,因其具有營(yíng)養(yǎng)豐富、甜、鮮、脆、嫩等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者青睞[17]。甜玉米種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)對(duì)甜玉米制種尤為重要,優(yōu)質(zhì)的甜玉米雄性不育系可提高制種效率,但目前關(guān)于甜玉米雄性不育系的研究較少。本研究對(duì)甜玉米不育突變體ms2020的田間不育特征及遺傳特性進(jìn)行了分析,利用分子標(biāo)記對(duì)該不育基因進(jìn)行了精細(xì)定位,旨在為甜玉米雄性不育分子機(jī)理的研究鑒定理論基礎(chǔ),將雄性不育基因與雜種優(yōu)勢(shì)相結(jié)合直接服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以源自甜玉米自交系K78的雄性不育自發(fā)突變體malesterility2020(ms2020)及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)甜玉米課題組提供的甜玉米自交系材料M08為試驗(yàn)材料。以ms2020作為母本,與M08雜交,構(gòu)建F1及相應(yīng)的F2遺傳群體,進(jìn)行表型觀察、遺傳規(guī)律分析和基因定位。所有試驗(yàn)材料種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地,常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ms2020突變體的表型鑒定和遺傳分析 觀察F2群體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的植株形態(tài)差異;植株抽雄后,取即將開(kāi)花的小穗,在解剖鏡下觀察花藥的形態(tài)特征;用碘染法(1% I2-KI)鑒定花粉育性;取可育株和不育株的花藥,用戊二醛固定后,委托武漢邁斯普生物科技有限公司進(jìn)行掃描電鏡,觀察花藥和花粉的外部形態(tài)。

于散粉期考察F2群體中各單株的育性表現(xiàn),統(tǒng)計(jì)可育株和不育株株數(shù),并計(jì)算其比例,通過(guò)卡方測(cè)驗(yàn)進(jìn)行分離比檢驗(yàn)。

1.2.2 基因定位 散粉期分別選取F2的可育株和不育株各30株,用CTAB法提取基因組DNA,將濃度相近的DNA等體積混合后分別構(gòu)建“野生型池”和“突變體池”,利用40K靶向測(cè)序基因型分型GBTS(Genotyping by target sequencing)技術(shù),通過(guò)SNP-index關(guān)聯(lián)分析[18]和歐式距離(Euclidean Distance,ED)關(guān)聯(lián)分析[19]得到目的基因的初定位區(qū)間。在MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)網(wǎng)站下載玉米參考基因組(B73 RefGen_v4),使用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件在Perl語(yǔ)言環(huán)境下查找初定位區(qū)間內(nèi)的SSR位點(diǎn),利用Primer3Plus(https://www.primer3plus.com/index.html)在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物,并由北京擎科生物有限公司廣州分公司合成引物。擴(kuò)大定位群體,通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)在初定位區(qū)間內(nèi)篩選交換單株,通過(guò)加密標(biāo)記進(jìn)一步縮小定位區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 ms2020突變體的表型特征

在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,ms2020植株與野生型植株無(wú)明顯差異;生殖生長(zhǎng)階段,ms2020突變體植株雖能正常抽雄,但花藥不開(kāi)裂、不散粉(圖1-A、B)。小穗解剖觀察,發(fā)現(xiàn)與野生型花藥相比,突變體花藥瘦小且顏色淡黃(圖1-B)。I2-KI(1%)染色,發(fā)現(xiàn)野生型花粉能夠正常染色(圖1-C),突變體花藥中包含不能正常著色的敗育花粉粒(圖1-D,黑色箭頭所指)。

A.野生型(左)和ms2020 (右)植株表型;B.散粉期野生型(左)和ms2020 (右)雄穗及小穗表型;C,D.野生型 (C)和ms2020 (D)花粉鏡檢,黑色箭頭所指為突變體花藥中的敗育花粉粒。A.Plant phenotypes of wild type(left)and ms2020 (right);B.Tassel and spikelet phenotypes of wild type(left)and ms2020 (right)at the pollination stage;C,D.Microscopic examination of pollen of wild type(C)and ms2020 (D),black arrows point to abortive pollen grains in mutant anthers.圖1 ms2020突變體和野生型表型Fig.1 Phenotypic of the ms2020 mutant and wild type

散粉期野生型和突變體花藥掃描電鏡結(jié)果顯示,突變體花藥外壁與野生型差異較大 (圖2-A、B)。野生型花藥外壁表皮細(xì)胞均勻且細(xì)長(zhǎng),被致密的角質(zhì)層包裹,呈現(xiàn)立體網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu),這是玉米花藥特有的表皮脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)(圖2-C);而突變體花藥外壁細(xì)胞形狀不規(guī)則,且細(xì)胞表面無(wú)脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu),但其表面有氣孔,如白色箭頭所指(圖2-D)。野生型花藥內(nèi)部的花粉粒呈球形(圖2-E),突變體花藥內(nèi)部不可見(jiàn)完整的花粉粒(圖2-F);野生型花粉外壁有細(xì)網(wǎng)-刺狀復(fù)合結(jié)構(gòu)(圖2-G),突變體花粉粒已經(jīng)解體(圖2-H)。

A,C.野生型花藥外壁;B,D.ms2020花藥外壁。突變體花藥表面有氣孔,如白色箭頭所示(D);E,G.野生型花粉外壁;F,H.ms2020花藥內(nèi)部。A,C.Wild type anther outer wall;B,D.ms2020 anther outer wall.Mutant anther has stomata on the surface,as indicated by white arrows(D); E,G.Wild type pollen exine;F,H.ms2020 anther interior.圖2 ms2020和野生型花藥組織學(xué)觀察Fig.2 Histological observation of the ms2020 mutant and wild type

2.2 ms2020突變體遺傳分析

2.3 突變基因的定位

將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,質(zhì)控后的數(shù)據(jù)與參考基因組(B73 RefGen_v4)對(duì)比,并進(jìn)行區(qū)段SNP檢測(cè)。通過(guò)SNP-index關(guān)聯(lián)分析和歐式距離關(guān)聯(lián)分析(圖3),得到性狀候選區(qū)間位于第7號(hào)染色體1～7 922 318 bp。

A.F2 Δ(SNP-index)全基因組分布圖;B.ED關(guān)聯(lián)值在全基因組上的分布。A.Distribution profile of Δ(SNP-index)in F2 generation on whole genome;B.Distribution profile of ED values on whole genome.圖3 SNP-index關(guān)聯(lián)分析和歐式距離關(guān)聯(lián)分析Fig.3 SNP-index and Euclidean distance correlation analysis

在初定位區(qū)間內(nèi)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出在親本之間具有多態(tài)性的可用標(biāo)記,共篩選出13對(duì)多態(tài)性標(biāo)記,利用96株F2隱性不育單株進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在Y23和P6標(biāo)記處的交換單株數(shù)目分別為9和11(圖4-A)。進(jìn)一步在Z5標(biāo)記(位于Y23之前)和P6標(biāo)記之間開(kāi)發(fā)標(biāo)記,篩選出7對(duì)多態(tài)性標(biāo)記,最終將突變基因定位在S1和W10之間 (圖4-B),物理距離約11.30 kb,包含Zm00001d018802和Zm00001d0188032個(gè)候選基因(圖4-C)。精細(xì)定位中篩選到的部分隱性單株分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果列于表1。

表1 部分隱性單株分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Test results of markers in partial recessive individual plants

A.候選基因定位于7號(hào)染色體Y23和P6分子標(biāo)記之間;B.候選基因精細(xì)定位在S1和W10之間的11.3 kb范圍內(nèi); C.精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)包含2個(gè)候選基因。紅色數(shù)字為交換單株數(shù)。A.Candidate gene was located between Y23 and P6 molecular markers on maize chromosome 7;B.Candidate gene was fine mapped to a 11.3 kb region delimited by S1 and W10 markers;C.Two candidate genes in the fine-mapped region.The red figures are the number of exchanged plants.圖4 ms2020突變體的精細(xì)定位Fig.4 Fine mapping of ms2020 mutant

利用MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)網(wǎng)站對(duì)候選基因進(jìn)行注釋。Zm00001d018802注釋為一個(gè)雄性不育基因Ms22(malesterile22),編碼一個(gè)谷氧還蛋白(Glutaredoxin),導(dǎo)致花粉母細(xì)胞退化而造成雄性不育。Zm00001d018803功能未知。

3 結(jié)論與討論

BSA在作物改良方面具有廣闊前景,通過(guò)發(fā)展診斷和組成標(biāo)記(Diagnostic and constitutive markers)、農(nóng)藝基因組學(xué)(Agronomic genomics)、標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection)和表型選擇(Selective phenotyping)來(lái)促進(jìn)植物育種[20]。Zou等[20]結(jié)合BSA 和AFLP(Amplified fragment length polymorphism,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性),鑒定了玉米重組近交系中高粱霜霉病 (Sorghum downy mildew,SDM)抗性相關(guān)的4個(gè)AFLP標(biāo)記,其中EM227、EM216、EM159為抗性標(biāo)記,EM186為易感性標(biāo)記。Agrama等[21]結(jié)合BSA和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat,SSR),鑒定高耐寒品種和低耐寒品種之間的遺傳關(guān)系,其中bnlg1273、umc1124、dupssr21、mmc0251、mmc0181和phi041等SSR標(biāo)記具有作為玉米耐寒性分子標(biāo)記的巨大潛力。Klein等[22]結(jié)合BSA和單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP),將narrowodddwarf鑒定為teosintebranched1的增強(qiáng)子,并鑒定到一個(gè)defectivekernel1的新等位基因。本研究采用 BSA結(jié)合SSR標(biāo)記的定位策略,成功定位到ms2020突變體的候選基因。

在ms2020甜玉米雄性不育突變體的定位區(qū)間里包含2個(gè)候選基因,Zm00001d018803功能未知,Zm00001d018802注釋為一個(gè)雄性不育基因ZmMs22,該基因也被注釋為ZmMSCA1(MALESTERILECONVERTEDANTHER1),編碼一個(gè)谷氧還蛋白(Glutaredoxin,GRX),參與了雄蕊原基的起始與花藥原基的分化過(guò)程。ms22/msca1突變體雖然可以正常進(jìn)行雄蕊原基的起始,但之后不能進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂和分化,而是形成了一些表面含有氣孔的結(jié)構(gòu),包括實(shí)質(zhì)細(xì)胞及異位的非功能性微管,這些結(jié)構(gòu)通常不存在于正常玉米花藥中[23]。本研究中,掃描電鏡結(jié)果顯示,ms2020突變體花藥的表面存在與ms22/msca1突變體相似的氣孔結(jié)構(gòu),因此將Zm00001d018802作為ms2020甜玉米雄性不育突變體的重要候選基因。

谷氧還蛋白(GRXs)是一種生物體中普遍存在的谷胱甘肽依賴(lài)氧化還原酶,在NADPH和谷胱甘肽還原酶(GSH)存在下催化二硫鍵的還原,以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性[24]。谷氧還蛋白系統(tǒng)由GRX、GSH和還原NADPH組成,它們?cè)谥参矬w內(nèi)參與維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)所依賴(lài)的信號(hào)途徑。ZmMSCA1/Ms22除了控制著玉米花藥的發(fā)育,也被報(bào)道其轉(zhuǎn)位會(huì)引起莖尖分生組織的大小改變[25]。該基因調(diào)節(jié)莖分生組織大小的機(jī)制已有報(bào)道[25-26],但其引起雄性不育的機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究中,ms2020突變體的花藥中包含不能正常著色的敗育花粉粒,但高永鋼[27]發(fā)現(xiàn)ms22突變體為無(wú)花粉型完全敗育突變體,推測(cè)2個(gè)突變體的表型差異可能突變位點(diǎn)的不同導(dǎo)致的。高永鋼[27]通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)ms22突變體的不育表型并非由Ms22直接導(dǎo)致,而是該基因的TGA后900～1 300 bp處缺失62個(gè)堿基所導(dǎo)致。雖然缺失位點(diǎn)不在Ms22蛋白的翻譯區(qū)段,但約400 bp的片段丟失可能導(dǎo)致玉米7號(hào)染色體短臂附近的其他基因,或相鄰染色體同一染色體片段出現(xiàn)交換異常。本研究雖已明確ms2020突變體的突變基因?yàn)閆m00001d018802,但其突變位點(diǎn)和作用機(jī)制需進(jìn)一步深入。

玉米雄性不育突變體在發(fā)育后期,小孢子或花粉都會(huì)塌陷,本研究的掃描電鏡結(jié)果顯示,ms2020突變體符合這一基本特征。但不同的雄性不育突變體其敗育特征不盡相同,花粉壁和絨氈層結(jié)構(gòu)的異常極可能導(dǎo)致雄性不育?；ǚ郾诎ǚ蹆?nèi)壁和外壁,外壁的主要組成成分為脂肪族物質(zhì)及其衍生物[28],已報(bào)道的ZmMs26和ZmMs30基因都與脂質(zhì)合成代謝有關(guān),但敗育過(guò)程略有差異。ZmMs26突變導(dǎo)致脂肪酸代謝途徑異常,花藥發(fā)育所必需的脂肪類(lèi)物質(zhì)供應(yīng)不足,不能形成正常的花粉壁和花藥角質(zhì),最終植株敗育[14];ZmMs30編碼一種具有不同催化殘基的新型GDSL脂肪酶,在第7～9階段玉米花藥中特異性表達(dá),其功能的喪失導(dǎo)致花藥表皮缺陷、不規(guī)則的花粉外壁足層以致完全雄性不育[15]。研究表明,絨氈層細(xì)胞是植物花粉外壁發(fā)育過(guò)程的重要參與者,絨氈層細(xì)胞的程序化死亡為小孢子發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ),其降解后產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和胼胝質(zhì)是合成花粉壁所需的[29],特別是由絨氈層合成并分泌的孢粉素(Sporopollenin)物質(zhì),是形成花粉壁的最主要物質(zhì)[30]。此外,絨氈層和胼胝質(zhì)的適時(shí)降解是小孢子正常發(fā)育的重要保障[31-32]。ZmAPV1在脂肪酸羥基化途徑中起作用,該途徑參與形成孢粉素前體和角質(zhì)單體,這對(duì)玉米中花粉外壁和花藥表皮的發(fā)育至關(guān)重要[33]。ZmMs7過(guò)早表達(dá)會(huì)造成絨氈層發(fā)育異常及花粉壁異常,最終導(dǎo)致小孢子解體[11]。ms2020突變體的敗育機(jī)制和不育基因的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

本研究對(duì)甜玉米不育突變體ms2020進(jìn)行了田間不育性狀表型鑒定、遺傳分析和基因精細(xì)定位,研究結(jié)果顯示,ms2020的不育性狀是的不育性狀受單隱性核基因控制,突變體花粉表現(xiàn)為敗育。通過(guò)構(gòu)建分離群體,區(qū)間內(nèi)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記,最終將候選基因定位在S1和W10之間,物理距離約11.30 kb,包含Zm00001d018802和Zm00001d0188032個(gè)候選基因;通過(guò)候選基因分析,推測(cè)已報(bào)道為玉米雄性不育基因的Zm00001d018802(ZmMs22/ZmMSCA1)是導(dǎo)致ms2020甜玉米雄性不育突變體表型的功能基因,但其突變位點(diǎn)及發(fā)揮功能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入。本研究為進(jìn)一步解析ms2020基因調(diào)控甜玉米雄性不育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為創(chuàng)造優(yōu)良甜玉米雄性不育系提供了新的研究材料。