HLA-B*15∶02基因型的快速鑒別方法建立及臨床應用*

初亞男,封利穎,李玉嬌,張婕妤

中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學科,江蘇南京 210002

卡馬西平是常用的抗癲癇藥物,史蒂文斯-約翰遜綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)是這種藥物可能引起的致死性皮膚不良反應。VigiBase數(shù)據(jù)庫中單一藥物引起 SJS 排名前三的藥物中就包括苯妥英鈉和卡馬西平[1]。此外,奧卡西平作為卡馬西平的酮基衍生物也會發(fā)生類似的嚴重不良反應?？R西平、苯妥英鈉、奧卡西平同屬于芳香族類抗癲癇藥物。近年發(fā)現(xiàn)攜帶人類白細胞抗原(HLA)-B*15∶02基因的亞洲人群服用上述藥物發(fā)生SJS/TEN的風險顯著高于不攜帶人群,因此,HLA-B*15∶02基因攜帶者應考慮避免使用上述3種藥物作為替代藥物[2]。常規(guī)的HLA分型方法有低分辨的聚合酶鏈反應-等位基因特異性引物法(PCR-SSP)[3]、聚合酶鏈反應-序列特異寡核苷酸探針法(PCR-SSOP)[4]及高分辨的聚合酶反應-直接測序法(PCR-SBT)[5]等,上述方法操作煩瑣、需要專用軟件、檢測成本高、耗時長[6],陸續(xù)有研究人員發(fā)現(xiàn)可以用單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)表征特定的HLA基因型。本研究擬采用操作簡便、靈敏度高、無須熒光標記的焦磷酸測序法建立rs144012689位點多態(tài)性分析方法,分析其與Sanger測序、商品化試劑盒的一致性,并采用已確診為SJS的病例進行驗證,初步評估本研究建立的測序方法的臨床適用性。

1 資料與方法

1.1一般資料 驗證標本來源于本科室標本庫中已完成HLA-B分型的40例患者的核酸標本(40份)及隨機核酸標本(20份),采用中國臺灣世基生物公司HLA-B位點 1502 基因檢測試劑盒(簡稱世基試劑盒)完成檢測的核酸標本40份。2019-2021年在本院確診為芳香族類抗癲癇藥物誘發(fā)的SJS不良反應患者2例。

1.2儀器與試劑 焦磷酸測序試劑盒及緩沖液購自德國QIAGEN公司,HLA-B位點 1502 基因檢測試劑盒購自中國臺灣世基生物公司,Taq酶購自日本TaKaRa公司,全血基因組提取試劑盒購自美國Promega公司,實驗用水為滅菌蒸餾水,其他試劑均為分析純。Q24焦磷酸測序儀購自德國QIAGEN公司,SLAN96S實時熒光定量PCR儀購自上海宏石公司,A200基因擴增儀購自杭州朗基科學儀器公司,微量紫外分光光度計購自南京伍義公司。

1.3方法

1.3.1全血基因組DNA提取 本研究采用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取全血中基因組DNA,對提取的基因組DNA進行純度和濃度測定,確保A260/A280在1.8～2.0,按照說明書將世基試劑盒檢測的基因組DNA標本的質量濃度控制在12.5～50.0 ng/μL。

1.3.2焦磷酸測序引物的設計和合成 采用Assay Design Software 2.0進行引物設計,使用Primer 5.0進行篩選,所有引物由Invitrogen公司合成,引物序列見表1。

表1 rs144012689位點的焦磷酸測序引物

1.3.3PCR體系優(yōu)化和焦磷酸測序 PCR反應體系和焦磷酸測序方法參考作者已發(fā)表的文章所述[7]。測序推注堿基的順序為“GTAGCA”,其中第2個堿基“T”為rs144012689位點的野生信號峰,第3個堿基“A”為rs144012689位點的突變信號峰,根據(jù)測序圖譜“A”信號峰的有無判別是否攜帶HLA-B*15∶02基因。將引物組進行配對后,根據(jù)單堿基峰高和比例篩選最佳引物。分別考察55 ℃、60 ℃、65 ℃退火溫度下的擴增效率,根據(jù)單堿基峰高評價最適的退火溫度。梯度稀釋人基因組DNA至10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、0.4 ng/μL及空白對照4個梯度平行擴增并測序3次,根據(jù)單堿基峰高和比例評價本方法的檢測限。

1.3.4靈敏度和特異度考察 HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型是鑒別該基因分型的金標準。為了評價本研究建立的rs144012689位點焦磷酸測序法表征HLA-B*15∶02基因型的性能。對40份已完成HLA-B基因PCR-SBT高分辨分型的標本采用焦磷酸測序檢測進行rs144012689位點檢測,評估rs144012689位點的靈敏度(采用焦磷酸測序檢測rs144012689正確判定檢測標本含有HLA-B*15∶02基因型的比例)和特異度(采用焦磷酸測序檢測rs144012689正確判定檢測標本不含有 HLA-B*15∶02基因型的比例)。

1.3.5焦磷酸測序與Sanger測序和商品化試劑盒的一致性評價 本研究使用的焦磷酸測序技術屬于邊合成邊測序的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術,Sanger測序基于雙脫氧鏈終止法進行測序屬于一代測序,是驗證測序結果準確性的金標準。因此本研究從標本庫中選擇20份標本,同時采用焦磷酸測序和Sanger測序對rs144012689位點進行檢測,比較兩種測序方法的一致性。選擇標本庫中的40份標本,按照世基試劑盒說明書要求進行HLA-B*15∶02基因檢測,同時將40份標本進行焦磷酸測序,比較本研究建立方法與商品化試劑盒檢測的一致性,將篩查出的陽性標本外送進行HLA-B基因的高分辨分型,檢測結果使用Kappa分析進行一致性評價。

1.3.6建立的方法對SJS綜合征患者的臨床應用 收集本院2019-2021年確診為芳香族類抗癲癇藥物所致SJS的患者,同步進行PCR-SBT分型和rs144012689位點焦磷酸測序檢測。評價本方法對確診病例的檢出性能。

2 結 果

2.1PCR體系優(yōu)化結果 根據(jù)單堿基峰高和測序峰比例篩選出上游引物1、下游引物1、測序引物2為最優(yōu)引物組,55 ℃、60 ℃、65 ℃退火溫度下,單堿基峰高分別為240 mV、275 mV和170 mV,因此60 ℃為最佳退火溫度。本方法的檢測限為0.4 ng/μL,見圖1。

注:圖中灰色區(qū)域為 SNP 的判別區(qū)域。

2.2靈敏度和特異度結果 40份標本中,HLA-B高分辨分型含有HLA-B*15∶02型的標本有2份,分別為HLA-B*15∶02及HLA-B*44∶03型標本1份和HLA-B*15∶02及HLA-B*51∶01型標本1份,不含有HLA-B*15∶02型的標本有38份,包括與HLA-B*15∶02型相近的HLA-B*15∶01型、HLA-B*15∶11型、HLA-B*15∶18等型別。焦磷酸測序結果為TA型的標本有2份,TT型標本有38份,見表2。表明使用rs144012689位點表征HLA-B*15∶02基因型的靈敏度和特異度均為100%。

表2 40標本焦磷酸測序和HLA-B高分辨分型結果(n)

2.3一致性評價結果 20份標本rs144012689位點Sanger測序和焦磷酸測序檢測得到TT型16份,TA型4份,2種方法一致性比較的Kappa值為1,見表3;40份標本焦磷酸測序結果顯示有4份為TA型,與商品化試劑盒檢測出的4份陽性標本一致;2種方法一致性比較的Kappa值為1,見表4。2019-2021年共計對89例考慮服用芳香族類抗癲癇藥物和已經(jīng)發(fā)生藥物性皮炎(藥疹)的患者進行rs144012689位點的檢測,共計篩查出12份“A”型基因攜帶者,其中2例為SJS確診患者,1例為服用卡馬西平后誘發(fā)的藥疹,1例有奧卡西平過敏史,在服用丙戊酸鈉和托吡酯時發(fā)生了交叉過敏反應[8],2例患者rs144012689位點檢測結果為TA型。將上述10份TA型標本外送進行HLA-B基因的高分辨分型,結果顯示10份標本均含有HLA-B*15∶02基因型。上述驗證結果說明本研究建立的方法與另外兩種方法的一致性良好,具有良好的臨床應用潛力。

表3 20標本焦磷酸測序和Sanger測序結果(n)

表4 40標本焦磷酸測序和世基試劑盒結果(n)

3 討 論

我國已經(jīng)在一些地區(qū)施行了按疾病診斷相關分組(DRGs)完成支付的試點改革,對細化臨床用藥方案,提升合理用藥水平和提高醫(yī)療質量做出了更高的要求。藥物的不良反應是造成患者住院時間延長、住院和藥品費用增加的重要因素[9]。用藥前進行HLA-B*15∶02基因型篩查將為避免不良反應發(fā)生,降低患者治療成本,實現(xiàn)個體化給藥提供技術支撐。本研究結果表明,rs144012689位點“A”等位基因與HLA-B*15∶02基因型存在100%的連鎖關系,與前期中國香港漢族人群和美國亞洲人群中的研究結果(96.7%～100.0%)相近[10-11]。因此,可以使用rs144012689位點的分型檢測代替?zhèn)鹘y(tǒng)的HLA分型方案。rs144012689位點附近的rs2596496多態(tài)性會影響rs144012689位點的分型結果,尤其干擾以雜交原理為基礎的TaqMan探針法、芯片法等技術的靈敏度和特異度,直接測序可以克服這一缺點,常見的一代測序方法中焦磷酸測序法因其操作簡單、檢測時間短、通量高的優(yōu)點更適用于SNP分型。本研究基于焦磷酸測序建立的rs144012689位點檢測方法,檢測限低至0.4 ng/μL基因組DNA,高于商品化試劑盒的12.5～50.0 ng/μL基因組DNA,檢測時間從獲得標本采集到測序完成僅需要3 h,遠低于HLA高分辨分型3～5 d的檢測時間,與HLA高分辨分型和HLA-B位點基因檢測試劑盒陽性和陰性的篩查結果一致。該方法較高分辨分型方法[12]的檢測成本低,是實現(xiàn)成本效益優(yōu)勢的一個可行手段。但是本研究也存在一些不足,需要進一步增加樣本量和陽性病例數(shù)對本方法的檢測性能進行進一步評價。