豬細小病毒VP2的原核表達與多克隆抗體制備

禹婷婷，黃 勇，張 樑，張洪玲，王振宇，趙志敏，童德文

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

豬細小病毒VP2的原核表達與多克隆抗體制備

禹婷婷，黃 勇，張 樑，張洪玲，王振宇，趙志敏，童德文*

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

克隆豬細小病毒(PPV)VP2基因全長1 740 bp，構(gòu)建其原核表達載體后進行蛋白的表達與純化，接種家兔制備多克隆抗體。用PCR方法擴增PPV VP2全長基因，擴增產(chǎn)物克隆至表達載體pET-32a并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中。分別用不同誘導時間、IPTG濃度、溫度誘導表達VP2重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳切膠回收純化目的蛋白。對家兔進行3次免疫后，采集血清制備抗體。PCR擴增得到1 740 bp的VP2基因片段；構(gòu)建原核表達載體pET-32a-VP2，經(jīng)37℃，IPTG濃度1.0 mmol/L誘導表達4 h可得分子質(zhì)量大小約為82 ku目的蛋白；間接ELISA檢測抗體效價可達1∶12 800；Western blot證明所制備的抗體能夠有效的應用于PPV VP2抗原的檢測。本研究成功構(gòu)建了表達PPV VP2基因的原核載體，獲得了VP2蛋白，制備了兔抗多克隆抗體，為建立檢測PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基礎。

豬細小病毒；VP2蛋白；原核表達；多克隆抗體

豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母豬繁殖障礙及仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的重要病原之一，臨床上常與其他導致母豬繁殖障礙的病原混合感染而致病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的損失[1-2]。豬細小病毒病常以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎、胎兒木乃伊化及弱仔等一系列癥狀為特征，目前該病在歐洲、美洲、亞洲等多個國家均有流行與報道[3]。我國在1984年首次分離到PPV，隨后相繼在上海、四川、廣西、黑龍江、天津、湖北等地分離到該病毒，表明PPV呈全國性分布，且國內(nèi)豬群PPV感染率很高，嚴重威脅到了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[4]。

PPV是一種自主復制型病毒，完整的病毒粒子由核衣殼蛋白和核酸組成，核衣殼由32個殼粒組成，核心含單股線狀負鏈DNA，大小約5.0 kb。其基因組包含2個開放性閱讀框(ORF)，3′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3；5′端編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3[4-5]。其中VP2為PPV主要的核衣殼蛋白，約占病毒衣殼蛋白總量的80%，具有在體外自我裝配呈類病毒粒子、動物體內(nèi)誘導產(chǎn)生抗PPV中和抗體，并可作為抗原轉(zhuǎn)運載體，是PPV的主要免疫原性抗原[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，缺失VP2蛋白的突變體均喪失了對宿主細胞的再感染性[9-11]。VP2蛋白已成為PPV在診斷、免疫學及疫苗研究方面的熱點。本研究擬克隆PPV的VP2基因，通過原核表達獲得重組結(jié)構(gòu)蛋白，用純化后的重組VP2蛋白接種家兔，制備兔抗PPV VP2多克隆抗體，為進一步研究PPV與宿主細胞互作關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株、質(zhì)粒 PPV(GenBank JN860197.1)YL株由本實驗室時樂[10]分離并鑒定，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、E.coli BL21(DE3)及原核表達質(zhì)粒pET-32a均為西北農(nóng)林科技大學動物病理實驗室保存。

1.1.2 試劑 rTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR V、SalI限制性內(nèi)切酶、dNTPs均購自TaKaRa公司；4×SDS Loading buffer購自Solarbio公司；DNA快速回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小劑量提取試劑盒均購自Omega公司；弗氏完全佐劑、HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物科技公司；TMB底物溶液購自南京凱基生物科技公司；ECL發(fā)光液購自西安晶彩生物科技公司。

1.1.3 試驗用動物 成年健康雌性家兔3只，2 kg左右，購自當?shù)仞B(yǎng)兔場。

1.2 方法1.2.1 VP2基因擴增 根據(jù)GenBank(JN860197.1)上公布的PPV核苷酸序列，設計并合成2對特異性引物(表1)應用PCR方法以PPV全基因組核苷酸序列作為模板，Primer 1、Primer 2為游引物擴增VP2基因前段核苷酸序列，Primer 3、Primer 4為引物擴增VP2基因后段核苷酸序列，通過以Primer 1、Primer 4為引物拼接VP2前段和后段核苷酸序列，獲得VP2蛋白基因的核苷酸序列全長。PCR反應體系為25 μL體系，拼接反應程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 3 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用DNA快速回收試劑盒回收目的片段。

表1 PCR引物序列

Table 1 The primers for PCR

名稱Name序列(5'→3')Sequence(5'→3')酶切位點Restrictionsites片段長度/bpProductsizePrimer1GCGGATATCAGTGAAAATGTGGEcoRV928Primer2TAGTGTTCCTGGGTGTTGGTCTCCTTC無NoPrimer3AACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAAC無NoPrimer4GCGTCGACGTCTAGTATAATTTTCTTGGSalI873

1.2.2 原核表達載體pET-32a-VP2的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物和pET-32a分別以EcoR V和SalI雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收后于16℃下用T4連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)中。挑取單克隆菌落搖菌培養(yǎng)，菌液PCR鑒定為陽性后，提取質(zhì)粒，EcoRV和SalI雙酶切鑒定為陽性的克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，分析測序結(jié)果。

1.2.3 VP2重組蛋白的誘導表達及條件優(yōu)化、純化 將重組菌pET-32a-VP2接種至含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導培養(yǎng)5 h，收集1 mL菌液，離心后棄上清，菌體沉淀用PBS重懸，冰上超聲破碎后，分離上清與沉淀，將沉淀用30 μL PBS重懸。將上清與沉淀、未誘導重組菌、同樣誘導條件的pET-32a空載體菌加入4×SDS Loading buffer，沸水煮10 min，進行SDS-PAGE檢測目的蛋白是否表達。待出現(xiàn)與預期分子質(zhì)量大小相符的蛋白條帶后，對融合蛋白的最佳誘導表達條件進行優(yōu)化，包括最佳誘導溫度(25℃、30℃、33℃、37℃)，最佳誘導IPTG濃度(0.1、 0.3、0.5、1.0 mmol/L)，和最佳誘導時間(2、3、4、5 h)，分別按照上述條件誘導融合蛋白的表達，取誘導表達產(chǎn)物，進行SDS-PAGE分析。在最佳誘導表達條件下，大體積誘導重組菌液，收集菌體，PBS重懸沉淀，冰上超聲破碎至懸液澄清，離心后取適量PBS重懸沉淀，加入4×SDS Loading buffer，沸水煮10 min，進行SDS-PAGE切膠純化目的蛋白。

1.2.4 多克隆抗體的制備 將目的蛋白烘干后研磨成粉，溶于適量生理鹽水中。以每只家兔首免劑量2 mg，與等量的弗氏完全佐劑乳化后，兩側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉，兩側(cè)頸部皮下，背部皮下四點免疫家兔；二免劑量為每只家兔3 mg，三免劑量為每只家兔4 mg，不加佐劑，免疫方式與首免一樣。每次免疫間隔1周，最后一次免疫1周后耳緣靜脈采血，間接ELISA檢測抗血清效價，滿足試驗需求后，頸靜脈放血處死試驗動物，采集血清，收集抗體，分裝置-80℃保存。

1.2.5 間接ELISA檢測抗體效價 用VP2融合蛋白 4℃過夜包被ELISA板；次日甩掉包被液，220 μL/孔PBST洗滌3次， 110 μL/孔50 g/L脫脂奶粉于37℃封閉2 h；棄去封閉液，220 μL/孔PBST洗滌3次，拍干；分別設陽性孔(不同濃度的多抗血清，梯度稀釋為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600)，空白孔(用PBS代替多抗血清)和相同稀釋梯度的陰性對照孔(免疫前家兔血清)，其余各步驟相同，以100 μL/孔加入包被的酶標板中，37℃溫育1 h；棄掉孔內(nèi)液體，220 μL/孔PBST洗滌3次，100 μL/孔加入稀釋好的HRP標記的羊抗兔IgG二抗(20 g/L脫脂奶粉1∶5 000稀釋)，37℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，220 μL/孔PBST洗滌3次， 加入100 μL/孔TMB，室溫避光顯色10 min； 50 μL/孔2 mol/L的硫酸終止液終止反應。以空白孔調(diào)零，450 nm波長依次測量各孔的吸光度，以OD450 nm陽性孔/OD450 nm陰性孔大于2.1，則認為被檢樣品為陽性，以判為陽性的最高稀釋倍數(shù)為終點效價。

1.2.6 Western blot檢測抗體反應性與特異性

1.2.6.1 Western blot檢測抗體反應性 將感染PPV的PK-15細胞總蛋白進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以VP2多克隆抗體為一抗(稀釋度為1∶250、1∶500、1∶1 000)，以HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，雜交完成后ECL顯色液顯色，記錄結(jié)果。

1.2.6.2 Western blot檢測抗體特異性 以感染PPV、PCV-2、PRRSV、TGEV和適量培養(yǎng)基的PK-15細胞總蛋白上樣，每個加樣孔上樣蛋白量為20 μg為宜進行加樣。然后以1∶250倍稀釋的多抗血清為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，雜交完成后ECL顯色液顯色，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 VP2基因的擴增和原核表達載體pET-32a-VP2的構(gòu)建

以提取的病毒DNA為模板，利用合成的兩對特異性引物PCR擴增目的基因，獲得大小約為928 bp、873 bp的特異性核苷酸序列，與預期條帶大小一致(圖1)。通過拼接，獲得大小約為1 740 bp的特異性核苷酸序列，與預期片段大小相符(圖2)。重組原核表達載體pET-32a-VP2的菌液PCR和雙酶切鑒定均獲得大小約為1 740 bp的擴增片段(圖3)。挑取陽性克隆并送至南京金斯瑞生物公司進行測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank所公布序列(JN860197.1)同源性達99%。表明成功克隆并構(gòu)建了pET-32a-VP2基因的原核表達載體。

2.2 重組VP2蛋白的誘導表達條件的優(yōu)化與純化

SDS-PAGE鑒定，獲得分子質(zhì)量大小約為82 ku的重組目的蛋白，與預期大小一致，表明PPV VP2重組蛋白正確表達。同時，使用Image J軟件對目的蛋白進行灰度分析，在分別誘導2、3、4、5 h時，VP2重組蛋白占總蛋白含量依次為24.9%、29.5%、33.6%和26.3%，表明重組蛋白誘導表達4 h時表達量最大(圖4)。在IPTG濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L時，VP2重組蛋白占總蛋白含量依次為0%、22.4%、27.8%和30.1%，表明重組蛋白在IPTG濃度1.0 mmol/L時表達量最大(圖5)。誘導溫度分別為25℃、 30℃、33℃、37℃時，VP2重組蛋白占總蛋白含量依次為0%、28.6%、20.0%和31.4%，表明重組蛋白在誘導溫度為37℃時，表達量最大(圖6)。VP2重組蛋白誘導表達最佳條件確定后大量誘導目的蛋白，SDS-PAGE切膠純化，用作多克隆抗體制備的抗原。

M.DNA標準DL 5 000; 1.VP2基因前段的PCR產(chǎn)物; 2.VP2基因后段的PCR產(chǎn)物

M.DNA Maker DL 5 000; 1.PCR products of anterior VP2 gene segment; 2.PCR products of posterior VP2 gene segment

圖1 VP2基因前后段PCR擴增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification of anterior and posterior VP2 gene segments

M.DNA標準DL 5 000; 1.VP2基因的PCR產(chǎn)物

M.DNA Maker DL 5 000; 1.PCR products of VP2 gene

圖2 VP2基因的PCR擴增結(jié)果

Fig.2 PCR amplification of VP2 gene

M. DNA標準DL 5 000; 1.陰性對照產(chǎn)物; 2～3.pET-32a-VP2菌液PCR產(chǎn)物; 4～5.pET-32a-VP2質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

M. DNA Maker DL 5 000; 1.Negative control; 2-3.PCR products of pET-32a-VP2; 4-5.pET-32a-VP2 digested byEcoR V andSalI

圖3 pET-32a-VP2 PCR和酶切鑒定結(jié)果

Fig.3 Identification of pET-32a-VP2 by PCR and enzyme digestion

M. 蛋白分子質(zhì)量標準; 1.pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌未誘導; 2～5.pET-32a轉(zhuǎn)化菌IPTG濃度1.0 mmol/L,37℃誘導2、3、4、5 h; 6～9.pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌誘導2、3、4、5 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 2,3,4，5 h; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 2,3,4,5 h

圖4 誘導時間對PPV VP2融合蛋白誘導表達的影響

Fig.4 Effects of induction time on expression of PPV VP2 fusion proteins

M. 蛋白分子質(zhì)量標準; 1. pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌未誘導; 2～5. pET-32a轉(zhuǎn)化菌IPTG濃度0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L,37℃誘導4 h; 6～9. pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌IPTG濃度0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L，37℃誘導4 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 0.1,0.2,0.5,1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 37℃; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 0.1,0.2,0.5,1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 37℃

圖5 不同濃度IPTG對PPV VP2融合蛋白
誘導表達的影響

Fig.5 Effects of different IPTG concentrations on expression of PPV VP2 fusion proteins

2.3 間接ELISA檢測抗體效價

用間接ELISA法測定抗體效價，結(jié)果顯示，抗豬細小病毒VP2蛋白多克隆抗體血清的效價為1∶12 800，證明所制備的多克隆抗體具有較高的效價(圖7)。

2.4 Western blot檢測抗體反應性與特異性

以感染PPV病毒的PK-15細胞總蛋白為抗原，以1∶250、1∶500、1∶1 000稀釋兔抗血清為一抗，通過Western blot檢測抗體反應性。檢測結(jié)果顯示抗原與抗體在64 ku處特異性結(jié)合(圖8)。分別感染PPV、PCV-2、PRRSV、TGEV病毒的PK-15細胞總蛋白以及未接毒的PK-15細胞總蛋白為抗原，以1∶250稀釋兔抗血清為一抗，Western blot檢測抗體特異性。檢測結(jié)果顯示制備的多克隆抗體可與PPV發(fā)生特異性結(jié)合，而與對照組和其他病毒未發(fā)生特異性結(jié)合，證明多克隆抗體可以特異性識別PPV (圖9)。

M. 蛋白分子質(zhì)量標準; 1.pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌未誘導; 2～5.pET-32a轉(zhuǎn)化菌IPTG濃度1.0 mmol/L,25、30、33、37℃誘導4 h; 6～9.pET-32a-VP2轉(zhuǎn)化菌IPTG濃度1.0 mmol/L，25、30、33、37℃誘導4 h

M. Protein molecular weight Marker; 1.Non-inducted pET-32a-VP2; 2-5.Inducted pET-32a with 1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 25,30,33,37℃; 6-9.Inducted pET-32a-VP2 with 1.0 mmol/L IPTG for 4 h at 25,30,33,37℃

圖6 誘導溫度對PPV VP2融合蛋白誘導表達的影響

Fig.6 Effects of temperature on expression of PPV VP2 fusion proteins

圖7 抗PPV VP2蛋白多克隆抗體血清的效價

3 討論

PPV感染導致的母豬繁殖障礙性疾病嚴重制約著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，各品系及不同日齡的豬均可感染PPV，主要傳染源是感染豬[2-3]。PPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2是病毒粒子的主要衣殼蛋白，也是PPV的主要免疫原性抗原[5,12-13]。研究表明，VP2基因序列決定著PPV的種系進化以及病毒的血凝活性、組織嗜性及宿主范圍。此外，有試驗證明VP2暴露在外的幾個氨基酸殘基(378、383、436等)是決定病毒趨向性和毒力的關鍵位點[14-15]。

1.感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合; 2.感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶500稀釋的抗體特異性結(jié)合; 3.感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶1 000稀釋的抗體特異性結(jié)合

1. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 2. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶500 diluted antibody; 3. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶1 000 diluted antibody

圖8 抗PPV VP2蛋白多克隆抗體的Western blot分析結(jié)果

Fig.8 Analysis of polyclonal antibodies against PPV VP2 protein by Western blot

1.感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合; 2.未感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合; 3.感染PPV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋未免疫前兔血清特異性結(jié)合; 4.感染PCV-2的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合; 5.感染PRRSV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合; 6.感染TGEV的PK-15細胞總蛋白與1∶250稀釋的抗體特異性結(jié)合

1. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 2. Total proteins of PK-15 cell uninfected with PPV detected by 1∶250 diluted antibody; 3. Total proteins of PK-15 cell infected with PPV detected by 1∶250 diluted negative control serum; 4. Total proteins of PK-15 cell infected with PCV-2 detected by 1∶250 diluted antibody; 5. Total proteins of PK-15 cell infected with PRRSV detected by 1∶250 diluted antibody; 6. Total proteins of PK-15 cell infected with TGEV detected by 1∶250 diluted antibody

圖9 抗PPV VP2蛋白多克隆抗體相對于其他
常見病毒特異性檢測分析

Fig.9 Detection of the specificity of polyclonal antibodies against VP2

本研究利用原核表達質(zhì)粒pET-32a在大腸埃希菌中成功表達了PPV的結(jié)構(gòu)蛋白VP2，經(jīng)SDS-PAGE顯示表達的重組VP2蛋白分子質(zhì)量大小約為82 ku，以包涵體的形式存在。

研究表明，即使是變性的抗原，只要具有蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)即可用于免疫動物制備抗體[16]。本研究采用切膠純化目的蛋白的方法獲取VP2重組蛋白，從而提高重組蛋白的免疫純度和免疫效果。此方法簡便易行，價格低廉，應用范圍廣，適用于大部分蛋白的小量純化后免疫，且蛋白膠還可以起到佐劑的作用。將純化的VP2重組蛋白與弗氏佐劑混合免疫家兔，制備抗VP2的兔抗多克隆抗體。應用間接ELISA檢測結(jié)果表明所制備的抗體具有較高的效價，Western blot檢測結(jié)果表明抗體具有較好的反應性與特異性。

制備高效價的抗體是檢測基因表達和研究基因功能的重要前提，而多克隆抗體的制備具有簡單、快速、靈敏和具有多個與抗原簇結(jié)合的位點，使其在免疫學日常應用上有著廣泛的空間[16]。本研究所制備的多克隆抗體為建立檢測VP2蛋白的抗原捕獲ELISA和觀察PPV對宿主細胞代謝、增殖和凋亡的影響，揭示PPV對宿主細胞功能影響的機制奠定了基礎。

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Prokaryotic Expression of Porcine Parvovirus VP2 and Development of Polyclonal Antibodies Against VP2

YU Ting-ting,HUANG Yong,ZHANG Liang,ZHANG Hong-ling,WANG Zhen-yu,ZHAO Zhi-min,TONG De-wen

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

This study aimed to clone the 1740 bp VP2 gene from porcine parvovirus,construct the prokaryotic expression vector for the expression and purification of fusion proteins and prepare polyclonal antibodies against porcine parvovirus VP2.Firstly,the VP2 was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a.Then,the recombinant vector was transformed intoE.coliBL21(DE3),and the PPV VP2 fusion protein was induced by different time,IPTG concentrations,temperatures and purified by SDS-PAGE gel extraction.After three times immunization of rabbits,the antibody was prepared.The porcine parvovirus VP2 was successfully obtained and the constructed pET-32a-VP2 was highly expressed inE.coliBL21(DE3) after induction with 1.0 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h. SDS-PAGE showed that the fusion protein was about 82 ku,and the titer of antibodies was 1:12800 by ELISA.Western blot showed that the obtained antibodies could be used to detect PPV VP2 specially and effectively.The pET-32a-VP2 was successfully constructed and VP2 fusion protein was expressed.Simultaneously,the rabbit polyclonal antibodies were prepared,and it laid the foundation to establish the ELISA for detecting PPV VP2 protein.

Porcine parvovirus; VP2 protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

2015-12-08

國家自然科學基金項目(31372401)

禹婷婷(1991-)，女，湖南邵東人，碩士研究生，主要從事動物病理學研究。*通訊作者

S852.655

A

1007-5038(2016)05-0047-06