糖絡(luò)寧通過(guò)外泌體調(diào)控IRE1α 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究*

姚偉潔，李 瀟，馮 欣△，許利平

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院，北京 100006；2 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069

中藥復(fù)方糖絡(luò)寧（以下簡(jiǎn)稱TLN）在臨床上治療糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）取得了很好的臨床療效［1-2］，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TLN 能夠通過(guò)抑制雪旺細(xì)胞（schwann cells，SCs）中的IRE1α 表達(dá)，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而改善DPN［3］。外泌體是由不同細(xì)胞類型釋放到細(xì)胞外空間的納米囊泡，外泌體可以將功能分子轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，充當(dāng)細(xì)胞間的通訊工具［4-5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，TLN 能夠通過(guò)增加血清外泌體中的miR-322，降低SCs 中IRE1α 的表達(dá)，并通過(guò)降低IRE1 依賴性衰解（IRE1-dependent decay，RIDD）活性，抑制細(xì)胞凋亡［6］。提示外泌體在TLN 抑制IRE1α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的通訊作用。

研究發(fā)現(xiàn)，ER stress 發(fā)生時(shí)，IRE1α 能夠通過(guò)募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factor 2，TRAF2），并與凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1）形成IRE1α-TRAF2-ASK1 復(fù)合體，進(jìn)而激活c-Jun 氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。盡管TLN 能夠通過(guò)外泌體作為媒介抑制IRE1α 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，但其能否進(jìn)一步通過(guò)抑制JNK 從而抑制細(xì)胞凋亡，至今尚未有研究。因此本實(shí)驗(yàn)以SCs 作為研究對(duì)象，通過(guò)提取大鼠血清分泌的外泌體干預(yù)SCs，進(jìn)而探討TLN通過(guò)外泌體調(diào)控IRE1α 抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為糖絡(luò)寧治療DPN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品鏈脲佐菌素（Sigma-Aldrich，批號(hào)：S0130）；澳洲胎牛血清（Gibco，批號(hào)：10099-141）；TRIzol 試 劑（Invitrogen，批 號(hào)：15596-025）；TransStart Tip Green qPCR SuperMix（AQ141-02，全式金）；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（AT301-03，全式金）；高效RIPA 組織/細(xì)胞裂解液（索萊寶，批號(hào)：R0010-100）；蛋白Marker（Genstar，批號(hào)：M221）；超敏發(fā)光液（Millipore，批號(hào)：WBKLS0100）；BCA 測(cè)定試劑盒（博奧森，批號(hào)：C-0018）；小鼠單克隆p-JNK抗體，兔單克隆Bcl-2 抗體，兔單克隆Bax 抗體（Santa Cruz，批號(hào)：sc-6254，sc-7382，sc-7480）；兔單克隆Cytochrome C 抗體，兔多克隆Caspase-3抗體，小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體（Abcam，批號(hào)：ab133504，ab13847，ab8226，ab33915）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器3K15 型低溫離心機(jī)（Sigma）；Mini-PROTEAN? Tetra 電 泳 槽（Bio-Rid）；小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽（Bio-Rid）；371型二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；MLS-3020 型高壓滅菌器（SANYO），CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Bio-Rid）；AC2-4E1型生物安全柜（ESCO）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只SD雄性大鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)飼養(yǎng)室，12 h/12 h晝夜交替、溫度（23±2）℃、濕度（55±10）%，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理要求。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞雪旺細(xì)胞，選購(gòu)大鼠RSC96 細(xì)胞株，購(gòu)買于American Type Culture Collection（ATCC），培養(yǎng)基為Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）完全培養(yǎng)基，含有4 mM 谷氨酰胺，25 mM 葡萄糖，1 mM 丙酮酸鈉，1500 mg/L 碳酸氫鈉，10% FBS 及1%青鏈霉素混合液。雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組與給藥 TLN 原藥材經(jīng)過(guò)2 次煎煮后，將2 次濾液合并，繼續(xù)加熱濃縮至膏狀，于真空干燥器中干燥成粉末，臨用前加蒸餾水溶解到10.9 g 生藥/kg。造模方法參照文獻(xiàn)［8］，30 只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，分為空白組、模型組和TLN 組，每組10 只。其中模型組和TLN 組腹腔注射60 mg/kg 的鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液，空白組則腹腔注射等量PBS溶液。1周后測(cè)定大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG≥16.7 mmol/L 表明糖尿病模型建立成功。TLN 組灌胃給予10.9 g 生藥/kg/d 的糖絡(luò)寧溶液，持續(xù)給藥12 周?？瞻捉M和模型組則給予10 mL/（kg·d）劑量的飲用水。最后一次給藥1 h后將大鼠處死，腹主動(dòng)脈取血，離心半徑13.5 cm，3000 r/min 離心10 min 得到大鼠血清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 外泌體的提取與內(nèi)化作用 使用差速離心法提取大鼠血清中的外泌體。將大鼠血清依次300 g的離心力離心10 min，2000 g離心15 min，10 000 g離心30 min，收集上清液，繼續(xù)70 000 g離心70 min，沉淀即為外泌體。使用PBS 溶解外泌體，用于后續(xù)研究。RSC96 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并以4×105細(xì)胞/孔的數(shù)量接種于6 孔板中，于培養(yǎng)箱中放置過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，分別將空白組、模型組和TLN 組大鼠血清分離的外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 Western blot 法測(cè)定蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解液提取RSC96 細(xì)胞中的蛋白，通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。將等量蛋白樣本加入SDS-PAGE 凝膠中，并使用電泳分離蛋白，通過(guò)濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至0.45 μm PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF 膜2 h，隨后加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜。吸棄一抗并加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h 后，加入電化學(xué)發(fā)光試劑并置于凝膠成像系統(tǒng)中曝光形成圖像。通過(guò)Image J軟件計(jì)算蛋白樣品的灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，將β-actin 作為內(nèi)標(biāo)蛋白，結(jié)果以倍數(shù)的形式表示。一抗使用情況如下：小鼠單克隆β-actin抗體，兔單克隆TRAF6抗體，小鼠單克隆p-JNK抗體，兔單克隆Bcl-2抗體，兔單克隆Bax抗體，兔單克隆Cytochrome C抗體，兔多克隆Caspase-3抗體。

1.6.2 RT-PCR 法測(cè)定基因表達(dá) 使用TRIzol試劑提取各組RSC96細(xì)胞中的RNA，隨后通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA繼續(xù)通過(guò)SYBR預(yù)混系統(tǒng)和特異性引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，并通過(guò)計(jì)算2-△△Ct確定基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果以倍數(shù)形式表示。引物使用情況見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)SPSS 19.0 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組獨(dú)立樣本間的比較使用One-Way ANOVA，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，P＜0.05 表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAF2、p-JNK 及ASK1 蛋白表達(dá)與空白組相比，模型組TRAF2和p-JNK蛋白表達(dá)及ASK1 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組TRAF2 和p-JNK 蛋白表達(dá)及ASK1 mRNA 表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），表明TLN 能夠通過(guò)外泌體抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復(fù)合體，進(jìn)而抑制JNK 的磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組TRAF2和p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)與空白組比較，模型組Bcl-2表達(dá)顯著降低，Bax表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組Bcl-2表達(dá)顯著升高，Bax表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），表明TLN 能夠通過(guò)外泌體抑制促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 各組Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組TRAF2、p-JNK、Bcl-2、Bax蛋白及ASK1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；與模型組相比，bb表示P＜0.01

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2.3 Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA 表達(dá)與空白組比較，模型組Cyto C 和cleaved-Caspase-3 蛋白和Caspase-9 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，TLN組Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白和Caspase-9 mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01），表明TLN能夠通過(guò)外泌體抑制Caspase-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各組Cyto C和cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

表3 各組大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表達(dá)（±s）

表3 各組大鼠Cyto C、cleaved-Caspase-3蛋白及Caspase-9 mRNA表達(dá)（±s）

注：與空白組相比，aa表示P＜0.01，a表示P＜0.05；與模型組相比，bb表示P＜0.01，b表示P＜0.05

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3 討論

外泌體是大小均一、直徑約為30～100 nm、具有雙層膜結(jié)構(gòu)的球狀或杯狀囊泡，可由細(xì)胞分泌或存在于血液、尿液、唾液等體液中，其攜帶多種蛋白質(zhì)、DNA、mRNA及miRNA等物質(zhì)，通過(guò)與靶細(xì)胞結(jié)合，使靶細(xì)胞發(fā)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與了糖尿病的發(fā)生過(guò)程，通過(guò)分離糖尿病及其并發(fā)癥患者血清，并對(duì)血清中外泌體的miRNA進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)到多種miRNA的表達(dá)差異［9］。前期研究發(fā)現(xiàn)，TLN能夠增加大鼠血清外泌體中的miR-322，進(jìn)而降低SCs 中IRE1α 的表達(dá)，并通過(guò)降低RIDD 活性，抑制細(xì)胞凋亡［6］，提示外泌體在TLN 抑制IRE1α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。

JNK是MAPK家族的成員之一，JNK信號(hào)通路參與了多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生［10］。ER stress發(fā)生時(shí)，IRE1α 通過(guò)募集TRAF2，并與ASK1 形成IRE1α-TRAF2-ASK1復(fù)合體，從而激活JNK的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7，11］。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，TLN 能夠通過(guò)外泌體抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復(fù)合體，抑制JNK的磷酸化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。

JNK 還能夠通過(guò)上調(diào)促凋亡因子Bax，并抑制抗凋亡因子Bcl-2，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的蛋白，二者相互抑制，Bcl-2表達(dá)被抑制后，Bax 構(gòu)象變化并寡聚化，促進(jìn)線粒體對(duì)促凋亡因子敏感性，并破壞ER 膜形態(tài)的完整性，Ca2+外流，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，TLN 能夠通過(guò)外泌體抑制JNK 的磷酸化，從而抑制Bax 表達(dá)，并促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

JNK 同樣可以破壞ER 膜形態(tài)的完整性，導(dǎo)致Ca2+外流至線粒體，從而增加線粒體外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），MOMP 則進(jìn)一步使細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyto C）從內(nèi)膜釋放至細(xì)胞質(zhì)，上調(diào)Caspase-9 和Caspase-3 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，TLN則能夠通過(guò)外泌體抑制JNK的磷酸化，從而抑制Cyto C 表達(dá)，并進(jìn)一步抑制Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡［10］。

綜上所述，糖絡(luò)寧能夠通過(guò)外泌體為媒介，通過(guò)抑制IRE1α-TRAF2-ASK1 復(fù)合體，進(jìn)而抑制JNK的磷酸化，然后分別通過(guò)進(jìn)一步抑制促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，以及抑制Cyto C、Caspase-9 和Caspase-3 的表達(dá)，從而抑制ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。