LncRNA LUCAT1靶向調(diào)控miR-937-5p/MMP13軸對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

付堂清 李文忠 羅仕云 師路 杜鎮(zhèn)鴻

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的80%以上[1]。約60%的肺癌患者在確診時(shí)已處于晚期,無(wú)法通過根治性手術(shù)治療。由于NSCLC細(xì)胞對(duì)于化療、放療和靶向治療的耐藥性,晚期NSCLC的治療仍然極具挑戰(zhàn)[2,3]。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,LncRNA)肺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(lung cancer-associated transcript 1,LUCAT1)可以促進(jìn)部分癌癥的進(jìn)展。LUCAT1在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著升高,促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性,敲低LUCAT1可顯著抑制了裸鼠異種移植腫瘤的生長(zhǎng)[4,5]。這些研究證實(shí)LUCAT1是NSCLC的一個(gè)有潛力的治療靶點(diǎn),而LUCAT1對(duì)NSCLC進(jìn)程的促進(jìn)作用的詳細(xì)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。微小RNA(microRNA,miRNA)在癌癥生物學(xué)中也占有重要地位,其中微小RNA-937-5p(microRNA-937-5p,miR-937-5p)是近期新發(fā)現(xiàn)的一類miRNA。據(jù)報(bào)道,miR-937-5p在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高,可通過下調(diào)其靶基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[6]。據(jù)報(bào)道,基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)在包含NSCLC在內(nèi)的腫瘤發(fā)展中具有重要作用[7]。因此,本研究將探究LUCAT1在NSCLC中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制,以期為NSCLC的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并且獲得每位患者的書面知情同意書,均按照赫爾辛基宣言的原則進(jìn)行。招募2018年4月至2020年4月本院術(shù)前未接受放療、化療或靶向治療的65例NSCLC患者,其中男38例,女27例;平均年齡(52.45±6.36)歲,其中肺腺癌40例,患者診斷為患者肺鱗狀細(xì)胞癌25例。術(shù)中采集NSCLC組織及其相應(yīng)癌旁組織,所有組織標(biāo)本切除后立即在液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中待測(cè)。

1.2 主要材料 NSCLC細(xì)胞系H1299(YS743C)、H1975(YS213C)、A549(YS1995C)和H2228(YS3251C)與人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B(AC-2620H)均獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);胎牛血清(C0227)、青霉素-鏈霉素(ST488)、BrdU(≥99%,ST1056)、DAPI(C1002)、RIPA裂解液(P0013B)、ECL試劑盒(P0018FS)均獲自上海Beyotime;PRMI-1640培養(yǎng)基(A1049101)獲自美國(guó)Thermo Fisher Scientific;靶向LUCAT1的shRNA(sh-LUCAT1)和相應(yīng)陰性對(duì)照(sh-NC)、miR-937-5p抑制物(anti-miR-937-5p)、miR-937-5p模擬物(miR-937-5p mimics)和相應(yīng)陰性對(duì)照(miR-NC mimics)均購(gòu)自上海Genepharma;Lipofectamine 2000(11668500)、pcDNA3.1表達(dá)載體(V79020)、TRIzol試劑(10296010)、SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶(18090010)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(DXT-204143)獲自美國(guó)Aiagen;一抗MMP13(ab51072,60 kDa)、GAPDH(ab9485,37 kDa)、二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP,ab205718)均獲自英國(guó)Abcam;Cell Counting Kit-8(CCK-8,CK04)獲自日本Dojindo;Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910)獲自美國(guó)Promega。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:人正常肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B和NSCLC細(xì)胞系(H1299、H1975、A549和H2228)維持在含有10%胎牛血清、1%雙抗的PRMI-1640培養(yǎng)基中,在5%CO2的恒溫(37℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將靶向MMP-13 mRNA序列亞克隆到pcDNA3.1獲得MMP-13過表達(dá)質(zhì)粒(OE-MMP-13)。同時(shí),將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中(1×104個(gè)/孔)依次分為Control組(正常培養(yǎng))、sh-NC組(轉(zhuǎn)染sh-NC)、sh-LUCAT1組(轉(zhuǎn)染sh-LUCAT1)、sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組(轉(zhuǎn)染sh-LUCAT1和anti-miR-937-5p)、sh-LUCAT1+OE-MMP-13組(轉(zhuǎn)染sh-LUCAT1和OE-MMP-13)。轉(zhuǎn)染前,使用不含血清的PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。按照說明,將Lipofectamine 2000與上述寡核苷酸或質(zhì)?；旌?并添加到培養(yǎng)基中,24 h后更換為完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平:使用TRIzol試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA。采用微量分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop 2000)檢測(cè)總RNA的濃度和純度,采用Agilent-2100凝膠電泳系統(tǒng)(上海安捷倫)檢測(cè)總RNA的完整性。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。使用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒在ABI 7500 FAST實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems)上進(jìn)行qRT-PCR。GAPDH用作LUCAT1和MMP13 mRNA定量的內(nèi)部對(duì)照,U6用作miR-937-5p定量的內(nèi)部對(duì)照。根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平,引物由中國(guó)深圳華大基因公司合成。本研究中使用的詳細(xì)引物序列如下:LUCAT1:正向5’-ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT-3’,反向5’-AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT-3’;miR-937-5p正向5’-GTGAGTCAGGGTGGGGCTGG-3’,反向5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’;MMP13正向5’-CCTGGACAAGTAGTTCCAAAGG-3’,反向5’-AGGGATAAGGAAGGGTCACAT-3’;GAPDH正向5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向5’-GAAGATTGGTGATGGGATTTC-3’;U6正向5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3.3 蛋白印跡檢測(cè)蛋白水平:將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞用RIPA裂解液提取總蛋白。將蛋白與上樣緩沖液混合后變性。隨后,將每組中蛋白質(zhì)樣品通過SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉膜1 h。添加一抗(MMP-13和GAPDH,稀釋度1∶1 000),將PVDF膜在4℃下孵育過夜。使用二抗(山羊抗兔IgG,稀釋度1∶5 000)孵育1.5 h。ECL試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)顯影后使用Image J對(duì)蛋白質(zhì)條帶的灰度值進(jìn)行定量分析。GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。

1.3.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力:將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至96孔板中(2×103個(gè)/孔),培養(yǎng)48 h后向每個(gè)孔中添加10 L CCK-8溶液,1 h后使用SAFAS Xenius XL酶標(biāo)儀(上海瑞軒)檢測(cè)每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。

1.3.5 BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖:將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并接種到24孔板中(1×105個(gè)/孔),向每孔中添加BrdU試劑,培養(yǎng)12 h后,將細(xì)胞與抗BrdU抗體在室溫下孵育2 h。之后使用DAPI染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染。然后在CX41熒光顯微鏡(日本Olympus)下對(duì)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞增殖率(%)=BrdU陽(yáng)性細(xì)胞/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞×100%。

1.3.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移:無(wú)血清培養(yǎng)基將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml。吸取100 μl懸浮液加入到Transwell小室的上室中,下室中加入600 μl含有10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基。24 h后,用棉簽擦去上室剩余的細(xì)胞,遷移的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下對(duì)通過膜的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):將預(yù)測(cè)的LUCAT1或MMP13 3’-UTR與miR-937-5p之間的結(jié)合序列擴(kuò)增并克隆到pmirGLO載體中用于構(gòu)建野生型(WT)報(bào)告載體(LUCAT1 WT和MMP-13 WT)。然后對(duì)結(jié)合序列進(jìn)行突變,將突變的序列擴(kuò)增并克隆到pmirGLO載體中用于構(gòu)建突變型(MUT)報(bào)告載體(LUCAT1 MUT和MMP-13 MUT)。將上述報(bào)告載體與miR-937-5p mimics或miR-NC mimics共轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中。48 h后測(cè)定熒光素酶的活性,螢火蟲熒光素酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶的活性。

1.3.8 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):體內(nèi)實(shí)驗(yàn)經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。20只雄性BALB/c裸鼠,6～8周齡,平均體重(22.5±2.0) g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(豫)2017-0001。將裸鼠維持在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房條件下(23℃、40%濕度、12 h光照和黑暗循環(huán)、自由獲取食物和水)。適應(yīng)飼養(yǎng)后將動(dòng)物分為2組(sh-NC組和sh-LUCAT1組,每組10只)。將上述轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞(1×105個(gè)/只)注射到對(duì)應(yīng)裸鼠中,3周后,將裸鼠安樂死,測(cè)量腫瘤體積并稱重。通過qRT-PCR檢測(cè)各腫瘤組織中LUCAT1、miR-937-5p和MMP13 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平 與癌旁組織比較,NSCLC組織中LUCAT1和MMP-13 mRNA表達(dá)水平明顯增高,miR-937-5p表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與BEAS-2B細(xì)胞相比,NSCLC細(xì)胞系中LUCAT1和MMP-13 mRNA表達(dá)水平明顯增高,miR-937-5p表達(dá)明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鑒于在NSCLC細(xì)胞系中,A549細(xì)胞中LUCAT1表達(dá)最高,因此選用此細(xì)胞建立LUCAT1敲低細(xì)胞模型,進(jìn)行后續(xù)研究。見表1、2。

表1 qRT-PCR檢測(cè)組織中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA表達(dá)

表2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA表達(dá)

2.2 5組A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組A549細(xì)胞中LUCAT1和MMP-13表達(dá)水平均顯著降低,miR-937-5p表達(dá)顯著增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與sh-LUCAT1組比較,sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組A549細(xì)胞中LUCAT1表達(dá)變化未達(dá)到統(tǒng)計(jì)闕值(P>0.05),miR-937-5p表達(dá)顯著降低,MMP-13表達(dá)顯著增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);sh-LUCAT1+OE-MMP-13組A549細(xì)胞中LUCAT1和miR-937-5p表達(dá)變化未達(dá)到統(tǒng)計(jì)闕值(P>0.05),MMP-13表達(dá)顯著增高(P<0.05)。而sh-NC組與Control組相比,以上各基因表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3,圖1。

表3 5組A549細(xì)胞中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13表達(dá)情況

圖1 免疫印跡檢測(cè)A549細(xì)胞中MMP-13蛋白水平;1～5依次表示為Control組、sh-NC組、sh-LUCAT1組、sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組和sh-LUCAT1+OE-MMP-13組

2.3 5組A549細(xì)胞增殖、遷移能力 與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05)。與sh-LUCAT1組比較,sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組或sh-LUCAT1+OE-MMP-13組A549細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率和遷移細(xì)胞數(shù)量均顯著增高(P<0.05)。而sh-NC組與Control組比較,以上指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 BrdU檢測(cè)5組A549細(xì)胞增殖情況(×200)

圖3 Transwell檢測(cè)5組A549細(xì)胞遷移情況(×200)

表4 5組A549細(xì)胞增殖、遷移情況比較

2.4 LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13之間關(guān)系驗(yàn)證 使用生物信息學(xué)工具分析發(fā)現(xiàn),LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR之間存在相互作用位點(diǎn)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí),轉(zhuǎn)染miR-937-5p mimics顯著抑制了LUCAT1 WT報(bào)告載體的熒光素酶活性(P<0.05),而LUCAT1 MUT的熒光素酶活性未觀察到明顯變化(P>0.05),說明LUCAT1與miR-937-5p之間存在相互作用關(guān)系。同理證實(shí)miR-937-5p與MMP-13之間亦存在相互作用關(guān)系。見圖4,表5。

圖4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)

表5 雙熒光素酶驗(yàn)證LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR相互作用關(guān)系

2.5 敲低LUCAT1調(diào)控miR-937-5p/MMP-13軸抑制NSCLC細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng) 用異種移植腫瘤檢查L(zhǎng)UCAT1對(duì)NSCLC細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的影響。與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組裸鼠腫瘤體積及重量均顯著降低(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,敲低LUCAT1后,腫瘤組織中miR-937-5p水平升高,MMP-13 mRNA水平降低(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 2組裸鼠解剖的腫瘤圖像

表6 敲低LUCAT1通過調(diào)控miR-937-5p/MMP-13軸抑制NSCLC細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率都很高,NSCLC作為常見的肺癌類型,引起了極大的關(guān)注。鑒于目前晚期NSCLC患者預(yù)后較差,存活率低[8]。因此,深入了解NSCLC的分子機(jī)制對(duì)制定有效的治療策略具有極大幫助。越來(lái)越多的研究證實(shí)LncRNA在包含NSCLC在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。例如:PCGEM1在NSCLC細(xì)胞和組織中上調(diào),敲低其表達(dá)可顯著抑制NSCLC細(xì)胞惡性行為進(jìn)展[9]。在以往的研究中,LUCAT1在NSCLC中的作用已經(jīng)得到初步的探索。據(jù)報(bào)道,LUCAT1在NSCLC組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平升高,并且LUCAT1的敲低阻礙了NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲;此外,LUCAT1的敲低會(huì)增加A549細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[4]。

本研究表明LUCAT1的表達(dá)在NSCLC組織和細(xì)胞系中顯著增加。通過體外功能實(shí)驗(yàn)表明,敲低LUCAT1抑制了NSCLC細(xì)胞活力、增殖和遷移。此外,NSCLC體內(nèi)異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)表明,LUCAT1的敲低抑制了體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,LUCAT1是NSCLC中的一種致癌LncRNA,可能是該病有希望的治療靶點(diǎn)。

競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)是一種常見的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制,是指LncRNA與mRNA競(jìng)爭(zhēng)與miRNA結(jié)合,從而解除miRNA對(duì)mRNA的抑制作用[10]。這種由LncRNA和miRNA相互作用形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在包括NSCLC在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)展中被報(bào)道[11]。例如,EWSAT1通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-330-5p調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)而影響NSCLC進(jìn)展[12]。因此,本研究探討了LUCAT1是否作為ceRNA上調(diào)NSCLC中某些mRNA。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-937-5p可能是LUCAT1的潛在靶標(biāo)。在之前的一些研究中探索了miR-937-5p在癌癥生物學(xué)中的作用。例如:miR-937-5p在乳腺癌中發(fā)揮原癌基因作用,抑制其表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并引起S期細(xì)胞停滯[13]。在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),miR-937-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,與前人研究[6,13]并不相同。表明miR-937-5p在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用,其在不同癌癥中可能發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。隨后,通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)并證實(shí)了miR-937-5p與LUCAT1之間的相互作用,同時(shí)抑制LUCAT1可明顯上調(diào)miR-937-5p的表達(dá),表明LUCAT1可靶向負(fù)調(diào)控miR-937-5p表達(dá)。此外,轉(zhuǎn)染miR-937-5p抑制劑逆轉(zhuǎn)了敲低LUCAT1對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移的影響。這些數(shù)據(jù)表明LUCAT1通過與miR-937-5p結(jié)合參與NSCLC的發(fā)展功能。

MMP-13是首次在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的一類發(fā)揮致癌作用的基因,下調(diào)其表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞進(jìn)展[14]。例如抑制MMP-13表達(dá)可通過抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力阻止前列腺癌的轉(zhuǎn)移[15]。已有研究證實(shí),MMP-13過表達(dá)可作為肺腺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)因素之一[16],且上調(diào)MMP-13表達(dá)可增加肺腺癌的順鉑耐藥[17]。另外,MMP-13還可作為遷移、侵襲標(biāo)志性蛋白促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移性[3,18]。在本研究中,MMP-13被證實(shí)是miR-937-5p的新靶點(diǎn),同時(shí)證明LUCAT1可通過靶向miR-937-5p間接調(diào)控MMP-13的表達(dá)。同時(shí)證實(shí),過表達(dá)MMP-13可明顯抑制敲低LUCAT1對(duì)NSCLC增殖、遷移的影響。以上數(shù)據(jù)表明,由LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13形成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致NSCLC中MMP-13表達(dá)失調(diào),進(jìn)而影響NSCLC細(xì)胞增殖和遷移。

總之,以上研究表明敲低LUCAT1可以通過靶向上調(diào)miR-937-5p表達(dá)間接抑制MMP-13的表達(dá),進(jìn)而通過抑制細(xì)胞增殖和遷移在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用。