METTL3介導的m6A甲基化修飾經(jīng)Notch通路調(diào)控血管內(nèi)皮細胞生物學活性

唐 韻,陳 思,葉 巍,王文喆,高 穎,葛軼睿,黃振平

0 引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是一種視網(wǎng)膜慢性退行性疾病,其病變主要發(fā)生在黃斑區(qū),是55歲以上人群常見的致盲性眼病[1]。ARMD的全球患病率約為8.7%,預計2040年全球患病人數(shù)將達到2.88億[2]。其主要臨床表現(xiàn)為視物變形、視野中央暗點,嚴重者出現(xiàn)不可逆性視力喪失[3]。早期和中期ARMD表現(xiàn)為黃斑區(qū)的玻璃膜疣和色素異常,晚期ARMD表現(xiàn)為新生血管和地圖狀萎縮[4]。晚期ARMD與嚴重的中心視力喪失有關,其中未經(jīng)治療的新生血管性ARMD導致超過90%的患者失明[5]。新生血管性ARMD主要由脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)引起。早期ARMD的特征是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)沉積于Bruch膜形成玻璃膜疣,在黃斑區(qū)氧化應激環(huán)境下形成氧化磷脂[6],與動脈粥樣硬化沉積物的組成相似[7],可促進炎癥因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌,誘導CNV形成[8]。且在病理狀態(tài)下,脈絡膜血流灌注受損[9],缺血和缺氧誘導VEGF上調(diào),促進CNV形成。目前抗VEGF治療是延緩疾病進展的主要手段[10],但價格昂貴,需要頻繁治療,且不能完全治愈疾病。因此,為了降低成本且進一步提高治療效果,新的藥物仍在研究中。在多種缺氧、炎癥、代謝障礙引起的微血管病變中,N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)甲基化修飾發(fā)揮著關鍵作用[11]。m6A甲基化修飾是真核生物RNA中最普遍的表觀遺傳修飾,由甲基轉(zhuǎn)移酶復合物、去甲基化酶和結(jié)合蛋白動態(tài)調(diào)控,它影響RNA剪接、翻譯和穩(wěn)定性以及某些非編碼RNA的表觀遺傳效應[12]。m6A甲基化修飾對血管發(fā)育和血管內(nèi)皮細胞的正常功能至關重要[13]。甲基轉(zhuǎn)移酶3(methyltransferase-like 3, METTL3)是m6A甲基化最關鍵的甲基轉(zhuǎn)移酶之一[14],它的缺失或過表達會改變m6A的總甲基化水平,在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。METTL3介導的m6A修飾促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[15],在胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤進展中促進血管生成[16-17],參與糖尿病視網(wǎng)膜病變中視網(wǎng)膜血管并發(fā)癥的發(fā)生[18],但其在CNV發(fā)病過程中的機制尚不明確。因此,本文旨在探索METTL3介導的m6A甲基化修飾在CNV發(fā)病中對血管內(nèi)皮細胞生物學活性的調(diào)控作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)、猴視網(wǎng)膜-脈絡膜內(nèi)皮細胞(RF/6A)購自美國ATCC。

1.1.2 主要試劑胎牛血清購自美國ScienCell;DMEM高糖、低糖培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素溶液、胰酶購自蘇州新賽美生物科技有限公司;熒光標記的低密度脂蛋白(Dil-LDL)、熒光標記的氧化低密度脂蛋白(Dil-ox-LDL)、低密度脂蛋白(LDL)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購自廣州奕源生物科技有限公司;STM2457、DAPT(溶于DMSO)、DMSO購自美國MCE公司;m6A抗體(68055-1-Ig)、METTL3抗體(15073-1-AP)、VEGF抗體(19003-1-AP)、α-SMA抗體(67735-1-Ig)、VE-Cadherin抗體(66804-1-Ig)、GAPDH抗體(10494-1-AP)、HRP標記山羊抗兔IgG(SA00001-2)、HRP標記山羊抗鼠IgG(SA00001-1)、594標記山羊抗兔IgG(SA00013-4)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;DAPI、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific;Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預混型試劑盒、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(Rox Plus)購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;transwell小室、Matrigel膠購自美國Corning;結(jié)晶紫溶液購自美國SigmaAldrich。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組HUVEC細胞用10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,RF/6A細胞用10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基,均在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。檢測HUVEC細胞內(nèi)吞脂蛋白水平的實驗中,將細胞分為以下4組培養(yǎng)6h:對照組(Control組,正常培養(yǎng)),Dil-LDL組(12.5μg/mL Dil-LDL),12.5μg/mL Dil-ox-LDL組,25μg/mL Dil-ox-LDL組。檢測ox-LDL處理對HUVEC細胞METTL3表達水平及血管形成影響的實驗中,將細胞分為以下4組培養(yǎng)24h:對照組;LDL組;12.5μg/mL ox-LDL組;25μg/mL ox-LDL組。檢測抑制METTL3對HUVEC細胞血管形成、對Notch通路影響的實驗中,將細胞分為以下4組培養(yǎng)24h:對照組;12.5μg/mL ox-LDL組;DMSO組,細胞培養(yǎng)基中同時加入12.5μg/mL ox-LDL和0.1% DMSO處理;STM2457組,細胞培養(yǎng)基中同時加入12.5μg/mL ox-LDL和5μmol/L METTL3抑制劑STM2457處理。檢測抑制Notch通路對血管形成影響的實驗中,將HUVEC及RF/6A細胞各分為以下4組培養(yǎng)24h:對照組;12.5μg/mL ox-LDL組;DMSO組,細胞培養(yǎng)基中同時加入12.5μg/mL ox-LDL和0.1% DMSO處理;DAPT組,細胞培養(yǎng)基中同時加入12.5μg/mL ox-LDL和5μmol/L Notch通路抑制劑DAPT。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞吞脂水平無菌條件下,將Dil-LDL和Dil-ox-LDL用細胞培養(yǎng)基稀釋至目標濃度加入活細胞培養(yǎng)皿內(nèi),37℃培養(yǎng)3～6h。吸去培養(yǎng)基,并用無探針的培養(yǎng)基清洗3次,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫熒光檢測METTL3蛋白表達量細胞經(jīng)PBS洗滌、4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100通透后,1% BSA室溫下封閉30min,METTL3一抗(1∶100稀釋)4℃孵育過夜。PBS洗滌后熒光二抗標記山羊抗兔IgG(按1∶200稀釋)避光室溫孵育1h。經(jīng)PBS洗滌后,DAPI(1∶1000稀釋)室溫孵育15min。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4Dotblot檢測m6A甲基化水平使用Trizol法提取HUVEC中的總RNA。分光光度計測定RNA濃度。取2μL RNA樣品按順序滴在NC膜上,紫外燈照30min。TBST洗滌后5%脫脂牛奶封閉1h,m6A抗體(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。TBST洗滌3次,二抗HRP標記山羊抗兔IgG(按1∶10000稀釋)室溫孵育1h。TBST洗滌3次,ECL化學發(fā)光法顯影檢測,亞甲藍染色30min清洗后拍照。通過Image J軟件測量每個點的相對信號密度。

1.2.5RT-qPCR檢測mRNA水平使用Trizol法提取HUVEC中的總RNA。按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預混型試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR[SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (Rox Plus)]檢測靶基因的mRNA水平。反應條件參照試劑盒說明書。ACTB作為內(nèi)參基因,使用2-ΔΔCt公式計算靶基因的相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.2.6Westernblot檢測蛋白水平提取各組細胞中的總蛋白,采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白進行定量。SDS-PAGE凝膠分離蛋白,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1h。一抗METTL3、VEGF、α-SMA、VE-Cadherin及GAPDH(均按1∶1000稀釋)4℃孵育過夜,TBST洗滌3次,二抗HRP標記山羊抗兔IgG及HRP標記山羊抗鼠IgG(均按1∶10000稀釋)室溫孵育1h。ECL化學發(fā)光法顯影檢測,Image J分析條帶灰度值。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞遷移能力將無血清培養(yǎng)基中的HUVEC細胞(5×104個)植入每個24孔板中transwell小室的上室,并將培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)24h后用4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫溶液染色,顯微鏡成像。在5個隨機視野檢測遷移細胞的平均數(shù)量。

1.2.8 體外成管實驗檢測細胞血管形成能力96孔板每孔加入50μL Matrigel膠,凝固后每孔加入1×104個HUVEC細胞。5% CO2、37℃孵箱內(nèi)孵育6h,顯微鏡下觀察管狀結(jié)構(gòu),拍照記錄并通過總管長評估細胞成管能力。使用Image-Pro Plus軟件測量管的總長度。每組細胞接種3個復孔,結(jié)果取平均值。

統(tǒng)計學分析:采用GraphPad Prism 9.0軟件進行繪圖,SPSS 21軟件進行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗,采用單因素方差分析比較多組間差異,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1HUVEC細胞內(nèi)吞脂蛋白與對照組相比,Dil-LDL組、12.5μg/mL、25μg/mL Dil-ox-LDL組HUVEC細胞內(nèi)的熒光標記的脂蛋白含量顯著增加,見圖1,提示脂蛋白能夠進入HUVEC細胞。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察HUVEC內(nèi)吞脂蛋白結(jié)果 紅色熒光為吞噬的Dil-LDL、Dil-ox-LDL;DIC圖像為明場圖像;MERGE圖像為共定位。

2.2ox-LDL處理的HUVEC細胞METTL3表達水平及細胞遷移和血管形成能力升高與對照組相比,12.5μg/mL、25μg/mL ox-LDL組HUVEC總RNA整體m6A水平顯著升高(P<0.05、P<0.01),見圖2A、B;12.5μg/mL ox-LDL組METTL3 mRNA表達水平顯著上調(diào)(P<0.05),見圖2C;METTL3蛋白表達水平顯著上調(diào)(均P<0.01),見圖2D、E;免疫熒光檢測METTL3表達水平升高且定位于細胞核內(nèi),見圖2F;12.5μg/mL ox-LDL組、25μg/mL ox-LDL組細胞遷移能力和血管形成能力顯著升高(均P<0.01),見圖2G、H。與對照組相比,LDL組HUVEC總RNA整體m6A水平、METTL3表達水平、細胞遷移和血管形成能力均無顯著性差異(P>0.05)。提示ox-LDL刺激使HUVEC細胞m6A甲基化水平升高,METTL3表達水平上調(diào),促進血管形成。12.5μg/mL ox-LDL用于后續(xù)實驗。

圖2 ox-LDL處理的HUVEC細胞METTL3表達水平及細胞遷移和血管形成能力升高 A:Dot blot檢測m6A甲基化水平;B:Dot blot結(jié)果統(tǒng)計圖;C:RT-qPCR檢測METTL3 mRNA表達水平;D:Western blot檢測METTL3蛋白表達水平;E:Western blot結(jié)果統(tǒng)計圖;F:免疫熒光檢測METTL3的蛋白表達水平及細胞內(nèi)定位;綠色熒光為METTL3;藍色熒光為DAPI染細胞核;MERGE圖像為共定位;G:Transwell實驗檢測細胞遷移能力;H:體外成管實驗檢測細胞血管形成能力。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組。

2.3METTL3抑制劑使經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC細胞的VEGF、α-SMA、VE-Cadherin表達水平及細胞遷移和血管形成能力下降與DMSO組相比,STM2457組總RNA整體m6A水平顯著下降(P<0.05),見圖3A、B;METTL3的蛋白及mRNA表達水平無顯著差異(均P>0.05),VEGF、α-SMA、VE-Cadherin等與血管生成相關標志物蛋白表達水平顯著下降(均P<0.01),mRNA表達水平顯著下調(diào)(均P<0.05,P<0.05,P<0.01),見圖3C～E;細胞遷移能力和血管形成能力顯著降低(均P<0.01),見圖3F、G;ox-LDL組總RNA整體m6A水平,METTL3、VEGF、α-SMA、VE-Cadherin的蛋白及mRNA表達水平,細胞遷移能力和血管形成能力均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比,ox-LDL組METTL3蛋白及mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。這提示STM2457能有效抑制經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC細胞的m6A水平和血管生成能力,但不影響METTL3的表達,且溶劑DMSO對實驗結(jié)果無顯著影響。

圖3 抑制METTL3使經(jīng) ox-LDL處理的HUVEC細胞的VEGF、α-SMA、VE-Cadherin表達水平及細胞遷移、血管形成能力下降 A:Dot blot檢測m6A甲基化水平;B:Dot blot結(jié)果統(tǒng)計圖;C:Western blot檢測VEGF、α-SMA、METTL3、VE-Cadherin蛋白表達水平;D:Western blot結(jié)果統(tǒng)計圖;E:RT-qPCR檢測VEGF、α-SMA、METTL3、VE-Cadherin mRNA表達水平;F:Transwell實驗檢測細胞遷移能力;G:體外成管實驗檢測細胞血管形成能力。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組;cP<0.05,dP<0.01 vs DMSO組。

2.4 抑制Notch通路使VEGF和NICD表達水平及細胞遷移與血管形成能力下降與DMSO組相比,STM2457組NICD蛋白表達水平顯著下降(P<0.05),見圖4A、B。VEGFmRNA表達水平顯著下調(diào)(P<0.01),見圖4C;與DMSO組相比,DAPT組VEGF及NICD蛋白表達水平顯著下降(P<0.05,P<0.01),見圖4D、E;HUVEC細胞遷移能力和血管形成能力顯著降低(均P<0.01),見圖4F、G;RF/6A細胞遷移能力和血管形成能力顯著降低(均P<0.01),見圖4H、I;ox-LDL組VEGF及NICD蛋白水平、HUVEC及RF/6A細胞遷移和血管形成能力均無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比,ox-LDL組VEGF、NICD表達量均顯著升高(均P<0.05)。這提示DAPT能有效抑制經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC細胞VEGF表達、HUVEC及RF/6A細胞血管生成能力,且溶劑DMSO對實驗結(jié)果無顯著影響。

圖4 抑制METTL3使HUVEC細胞Notch通路受抑制,抑制Notch通路使HUVEC細胞VEGF、NICD表達水平及HUVEC與RF/6A細胞遷移、血管形成能力下降 A:Western blot檢測NICD蛋白表達水平;B:Western blot結(jié)果統(tǒng)計圖;C:RT-qPCR檢測VEGF mRNA表達水平;D:Western blot檢測VEGF、NICD蛋白表達水平;E:Western blot結(jié)果統(tǒng)計圖;F:Transwell實驗檢測HUVEC細胞遷移能力;G:體外成管實驗檢測HUVEC細胞血管形成能力;H:Transwell實驗檢測RF/6A細胞遷移能力;I:體外成管實驗檢測RF/6A細胞血管形成能力。aP<0.05,bP<0.01 vs 對照組;cP<0.05,dP<0.01 vs DMSO組。

3 討論

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HUVEC細胞可內(nèi)吞LDL和ox-LDL,但僅ox-LDL刺激可使HUVEC細胞m6A甲基化水平升高,METTL3表達水平上調(diào),對血管形成有促進作用。使用METTL3抑制劑使m6A甲基化水平下降,VEGF、α-SMA、VE-Cadherin等血管形成相關標志物[19-20]表達下降,對血管形成有抑制作用。這表明METTL3的表達水平可以顯著影響血管內(nèi)皮細胞的血管生成,METTL3的升高可能促進CNV病變的發(fā)生發(fā)展。Dong等[21]研究發(fā)現(xiàn),METTL3在ox-LDL誘導的HUVEC中高表達,METTL3的敲除抑制了ox-LDL處理的HUVEC細胞增殖、遷移、血管的形成和VEGF的表達與分泌,阻礙了體內(nèi)的動脈粥樣硬化過程,并阻止了正在發(fā)育的胚胎的體內(nèi)血管生成。Chamorro-Jorganes等[22]研究表明,METTL3維持m6A RNA水平并提高內(nèi)皮細胞的血管生成能力。Yao等[23]研究顯示,增強的m6A甲基化修飾有助于病理性血管生成,METTL3沉默減少了內(nèi)皮細胞的異常增殖、遷移和血管形成,在角膜新生血管模型中發(fā)揮抗血管生成作用。Jiang等[24]研究證明,在CNV模型中METTL3沉默導致CNV面積減少。STM2457是一種具有高度特異性的METTL3催化抑制劑,它通過直接結(jié)合METTL3的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點抑制其甲基轉(zhuǎn)移酶活性,但并不破壞其結(jié)構(gòu)[25]。STM2457使m6A水平顯著下降,但對METTL3蛋白及RNA表達水平無顯著影響。因此,我們認為RNA的m6A水平與METTL3的表達量不完全相關,主要與METTL3和mRNA的結(jié)合量密切相關。

m6A高甲基化mRNA的相關通路分析中顯示,Notch信號是METTL3調(diào)控的首要信號[24]。Han等[26]研究報道,METTL3介導的m6A修飾通過調(diào)控Notch信號通路促進癌癥的進展。Lv等[27]研究顯示,內(nèi)皮特異性m6A通過Notch信號調(diào)節(jié)小鼠造血干細胞和祖細胞發(fā)育。因此,我們選擇探索在CNV形成中METTL3對Notch通路是否具有調(diào)控作用。Notch通路是一種進化保守的細胞間信號通路,在血管系統(tǒng)中主要分布于動脈血管的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中[28],在生理性和病理性血管生成中均發(fā)揮重要作用[29]。在本研究中,ox-LDL刺激HUVEC細胞METTL3升高的同時Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, NICD)蛋白表達升高,使用METTL3抑制劑使NICD蛋白表達下降,這表明METTL3可能通過調(diào)控Notch通路影響血管內(nèi)皮細胞的血管形成。DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑,通過阻止γ-分泌酶的裂解抑制NICD蛋白的形成,從而有效地阻斷Notch信號通路[30]。本研究發(fā)現(xiàn),使用DAPT抑制Notch通路使NICD表達下降,導致VEGF表達下降,對血管形成有抑制作用,這說明Notch通路在CNV病變中可能有促進血管形成的作用。Dong等[31]研究發(fā)現(xiàn),在缺氧誘導的CNV模型中,Notch家族配體中的Delta-like ligand 4(Dll4)可能參與HIF-1α-VEGF通路調(diào)控CNV血管生成,Notch信號促進了CNV血管生成的過程。這與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述,在ox-LDL處理的細胞中m6A甲基化修飾水平升高,METTL3表達上調(diào),抑制METTL3對mRNA的m6A甲基化修飾能夠減少ox-LDL誘導的血管生成,METTL3通過Notch通路在CNV病變中促進血管內(nèi)皮細胞的血管形成。本研究為闡明CNV發(fā)病的分子機制提供了新的證據(jù),METTL3介導的m6A甲基化修飾或許能作為臨床防治CNV的重要靶點。但本研究存在一定的局限性:所涉及實驗均為離體實驗,缺乏在體實驗的驗證,后續(xù)需進一步探索在體實驗中METTL3介導的m6A甲基化修飾在CNV發(fā)病中的作用。