5株植物內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化檸檬烯和月桂烯產(chǎn)物分析

楊道茂, 王奇志, 裴真巧

(華僑大學(xué) 化工學(xué)院, 福建 廈門 361021)

萜類化合物的基本結(jié)構(gòu)是由不同個(gè)數(shù)的異戊二烯首尾相連而成.根據(jù)異戊二烯規(guī)則,由2個(gè)異戊二烯構(gòu)成的化合物稱為單萜.單萜類物質(zhì)主要存在于揮發(fā)油中,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、香料工業(yè)、昆蟲信息素及昆蟲驅(qū)避劑等方面[1].某些單萜類化合物,如檸檬烯[2]、月桂烯、哌烯等,由于結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格低廉,一直是理想的生物轉(zhuǎn)化底物模型,均可用細(xì)菌、真菌、酵母菌和植物細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化[3].在已報(bào)道的微生物催化劑中,細(xì)菌占41%,真菌占33%[4].

在用于生物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,有關(guān)假單胞屬細(xì)菌(Pseudomonassp.)的報(bào)道最多.該屬細(xì)菌能以檸檬烯[5-6]、酪醇[7-8]和月桂烯[9-10]為轉(zhuǎn)化底物.2013年,Molina等[11]總結(jié)了假單胞屬細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化萜類物質(zhì)的研究.真菌中,黑曲霉[12-13]、尖孢鐮刀菌[14-15]、指狀青霉菌[16-17]、解脂耶氏酵母[18-20]等微生物都有轉(zhuǎn)化單帖類化合物的相關(guān)報(bào)道.隨著生物轉(zhuǎn)化研究的深入,植物內(nèi)生真菌在生物催化領(lǐng)域的作用開始受到重視.植物內(nèi)生真菌因?yàn)樾枰c宿主植物一起共進(jìn)化來適應(yīng)環(huán)境的變化,從而顯示它們可能會(huì)產(chǎn)生豐富的酶以適應(yīng)宿主[21].現(xiàn)有多種植物內(nèi)生真菌應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化,如海藻(Bostrychiaradicans)來源內(nèi)生真菌Botryosphaeriasp.[22],植物內(nèi)生真菌(Phomopsissp.,Glomerellacingulata,Diaporthephaseolorum,Aspergillusfumigatus)[23],火炬松來源植物內(nèi)生真菌(Phomopsissp.)[24].因此,采用植物內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化單萜類化合物理論上是可行的[25].

本文選取單環(huán)單萜中的(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯、無環(huán)單萜的月桂烯為轉(zhuǎn)化底物,以假臭草來源5株植物內(nèi)生真菌為轉(zhuǎn)化菌株,采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,以期為工業(yè)生物催化尋找合適的微生物菌種.

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯、月桂烯,日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;無水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯,國藥試劑有限公司;(1S,2S,4R)-(+)-二戊烯-1,2-二醇(檸檬烯-1,2-二醇,CAS號(hào):38630-75-0),美國Sigma-Aldrich公司.以上試劑均為分析純.0.22 μm濾膜,天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;GF254型薄層層析硅膠板(50 mm×200 mm),山東青島海洋化工廠分廠.

ZQZY-75CN型振蕩培養(yǎng)箱,上海支楚儀器有限公司;XH-C型旋渦混合器,江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái),江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;H1650型醫(yī)用離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;Angilent 8860 GC System-5977B型氣質(zhì)聯(lián)用儀器(帶G4513A型自動(dòng)進(jìn)樣器),美國安捷倫科技有限公司;EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會(huì)社.

1.2 微生物與培養(yǎng)基

植物內(nèi)生真菌(AlternariaNeesPS01,AlternariaNeesPS06,AlternariaNeesPS07,DiaportheNitschkePS10,AlternariaNeesPL14),分離自假臭草莖干部位,由王奇志博士饋贈(zèng).

發(fā)酵及轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:蛋白胨10 g·L-1,葡萄糖40 g·L-1,pH值為4.0～6.0.

1.3 檢測方法

薄層層析(TLC)方法:展開劑采用體積比V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1;顯色劑采用體積分?jǐn)?shù)為1%的香草醛濃硫酸.

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測采用Agilent HP-5ms型色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm),載氣為氦氣,進(jìn)樣量為1 μL.升溫程序:60 ℃保持1 min,20 ℃·min-1升溫到300 ℃,保持13 min.MS離子源溫度為230 ℃,MS四極桿溫度為150 ℃,質(zhì)譜掃描范圍(m/z)為60～800.

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 液體發(fā)酵法生物轉(zhuǎn)化單萜類化合物

實(shí)驗(yàn)過程參考Rottava等[13]的做法并進(jìn)行略微調(diào)整.菌種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中活化6 d后,挑取一接種環(huán)菌絲接種于裝有100 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在30 ℃,200 r·min-1下培養(yǎng)6 d;然后,在培養(yǎng)基中加入1 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌的(+)-檸檬烯-乙醇溶液(檸檬烯與乙醇的體積比為1∶1)使檸檬烯的體積分?jǐn)?shù)為0.5%,繼續(xù)培養(yǎng)4 d完成轉(zhuǎn)化過程;轉(zhuǎn)化結(jié)束,將發(fā)酵液過濾,取3 mL濾液到15 mm×150 mm玻璃試管中,用等體積乙酸乙酯萃取;接著,將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到干燥玻璃試管中,并用無水硫酸鈉脫水;最后,取1 mL有機(jī)相進(jìn)行TLC和GC-MS檢測.

(-)-檸檬烯和月桂烯的轉(zhuǎn)化及代謝產(chǎn)物處理操作與(+)-檸檬烯的處理步驟一致.

2.2 建立檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

用色譜純乙酸乙酯溶解標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度為8.6 g·L-1的母液,采用逐步稀釋法配制成不同質(zhì)量濃度的樣品.采用GC-MS檢測方法建立檸檬烯-1,2-二醇的峰面積-質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 有機(jī)相的TLC檢測

5株植物內(nèi)生真菌分別轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯、(-)-檸檬烯和月桂烯,取其萃取相進(jìn)行TLC檢測,結(jié)果如圖1所示.

(a) (+)-檸檬烯 (b) (-)-檸檬烯 (c) 月桂烯

由圖1可知:5株植物內(nèi)生真菌對2種手性構(gòu)型的檸檬烯底物均具有良好的轉(zhuǎn)化能力,且其產(chǎn)物比較單一,這有利于后期的產(chǎn)物分離,轉(zhuǎn)化結(jié)果比較理想;特殊的是,菌株P(guān)S07轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯時(shí),與其他菌株相比,其產(chǎn)物多出了1個(gè)斑點(diǎn),而菌株P(guān)S10轉(zhuǎn)化(-)-檸檬烯時(shí),與其他菌株相比,其產(chǎn)物多出了2個(gè)淺藍(lán)色斑點(diǎn);5株真菌對月桂烯均具有轉(zhuǎn)化能力,且轉(zhuǎn)化斑點(diǎn)的比移值(Rf)相同,推測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是相同的.

從菌株測序的結(jié)果可知,菌株P(guān)S01,PS06,PS07和PL14歸屬于AlternariaNees,菌株P(guān)S10歸屬于DiaportheNitschke.結(jié)果表明,同一種屬的真菌在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一般是一致的,如菌株P(guān)L14,PS01,PS07,PS06在轉(zhuǎn)化檸檬烯、月桂烯的表現(xiàn)一樣,但菌株P(guān)S07在轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯時(shí)多出1個(gè)斑點(diǎn).因此,各菌株在完成生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),可以套用一般規(guī)律,但是不能忽視個(gè)別菌株的特殊性.

3.2 植物內(nèi)生真菌對(+)-檸檬烯的轉(zhuǎn)化行為

5株植物內(nèi)生真菌完成(+)-檸檬烯轉(zhuǎn)化后,其有機(jī)相的總離子色譜(TIC)圖,如圖2所示.圖2中:δ為絕對豐度;t為時(shí)間.

(a) 菌株P(guān)S01 (b) 菌株P(guān)S06 (c) 菌株P(guān)S07

由圖2可知:各峰信號(hào)主要為峰a(環(huán)氧檸檬烯)和峰b(檸檬烯-1,2-二醇),該結(jié)果與Bier等[24]報(bào)道的一致.從轉(zhuǎn)化機(jī)理上看,環(huán)氧檸檬烯是檸檬烯-1,2-二醇的前體,屬于已知的6條檸檬烯代謝路線之一[26],因此,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是合理的.

3.3 植物內(nèi)生真菌對(-)-檸檬烯的轉(zhuǎn)化行為

5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化(-)-檸檬烯后,其有機(jī)相的TIC圖,如圖3所示.

(a) 菌株P(guān)S01 (b) 菌株P(guān)S06 (c) 菌株P(guān)S07

由圖3可知:5株植物內(nèi)生真菌的主要產(chǎn)物均為檸檬烯-1,2-二醇,且底物(-)-檸檬烯的信號(hào)強(qiáng)度較高,只有菌株P(guān)S07的信號(hào)強(qiáng)度低,而圖2中底物(+)-檸檬烯的信號(hào)強(qiáng)度普遍都低,推測菌株可能更傾向于利用(+)-檸檬烯,原因在于該構(gòu)型的底物為柑橘精油的主要成分.對比圖2和圖3發(fā)現(xiàn),雖然底物手性不同,但是產(chǎn)物一樣,推測負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化的雙羥基加氧酶對底物無立體特異性要求.

3.4 檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

建立檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示.圖4中:S為峰面積;ρ為檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度.由圖4得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=129 971.734 13X-15 963.437 46,R2=0.993.

圖4 檸檬烯-1,2-二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖5 不同菌株生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度

根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)合圖2,3的檸檬烯-1,2-二醇峰的峰面積,計(jì)算出5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化2種構(gòu)型檸檬烯形成的檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度,結(jié)果如圖5所示.

由圖5可知:5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化2種手性檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度差異較大.以(+)-檸檬烯為例,菌株P(guān)S10的產(chǎn)量最高,為4.57 g·L-1,是菌株P(guān)S01產(chǎn)量的12.7倍.如果底物為(-)-檸檬烯,則各菌株生成檸檬烯-1,2-二醇的質(zhì)量濃度范圍為0.81～2.04 g·L-1.

3.5 植物內(nèi)生真菌對月桂烯的轉(zhuǎn)化行為

考察5株植物內(nèi)生真菌對月桂烯的轉(zhuǎn)化結(jié)果,其有機(jī)相的TIC圖,如圖6所示.

(a) 菌株P(guān)S01 (b) 菌株P(guān)S06 (c) 菌株P(guān)S07

由圖6可知:5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化月桂烯后,與檸檬烯底物相比,其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物更多樣;菌株P(guān)S01的主要產(chǎn)物為環(huán)氧羅勒烯,菌株P(guān)S06和PS07的主要產(chǎn)物為氧化芳樟醇,菌株P(guān)S10的產(chǎn)物為苯乙醇等化合物,菌株P(guān)L14則未檢索到相匹配的化合物.不同菌株轉(zhuǎn)化月桂烯后的產(chǎn)物復(fù)雜多樣,與Esmaeili等[9]的結(jié)果一致.Esmaeili等[9]采用銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)化月桂烯,在反應(yīng)1.5 d時(shí)的代謝產(chǎn)物為二氫芳樟醇和2,6-二甲基辛烷,反應(yīng)3 d后的主要產(chǎn)物為2,6-二甲基辛烷和α-松油醇.由此可以看出,轉(zhuǎn)化月桂烯的產(chǎn)物多樣可能與轉(zhuǎn)化時(shí)間有關(guān).

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用的5株植物內(nèi)生真菌均具有生物轉(zhuǎn)化3種單萜化合物的能力.5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯和(-)-檸檬烯的主要產(chǎn)物為檸檬烯-1,2-二醇,菌株P(guān)S10轉(zhuǎn)化(+)-檸檬烯生成檸檬烯-1,2-二醇的產(chǎn)量最高,為4.57 g·L-1.5株植物內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化月桂烯的產(chǎn)物多樣,包含環(huán)氧羅勒烯、氧化芳樟醇等,未找到產(chǎn)物單一的轉(zhuǎn)化菌株.

檸檬烯-1,2-二醇具有抗癌活性[27-28],不僅能抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的促炎活性[29]并作為調(diào)味劑[14],還可以用來合成Prevezol C[30],是一種很重要的檸檬烯含氧衍生物.從價(jià)值上看,以Sigma-Aldrich的報(bào)價(jià)為例,底物(+)-檸檬烯的價(jià)格為1 584.8 元·L-1, 而產(chǎn)物檸檬烯-1,2-二醇的價(jià)格為530.09 元·g-1,轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物價(jià)值得到了極大的提升.檸檬烯-1,2-二醇理論上具有4種構(gòu)型[31],用酶法轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物具有單一手性的這一特性是化學(xué)合成方法無法具備的.因此,生物轉(zhuǎn)化檸檬烯合成具有更高附加值的衍生物的思路是可行且有意義的.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:植物內(nèi)生真菌是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ木G色生物催化劑,值得擴(kuò)大底物篩選范圍并分離出更多的內(nèi)生真菌用于生物轉(zhuǎn)化研究.