柴胡皂苷A通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/NF-κB信號(hào)通路減輕小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥反應(yīng)

王瑩,王麗,徐俊濤,肖莉

玫瑰痤瘡是一種慢性炎癥性皮膚病,全球患病率超過(guò)5%[1],其臨床特征是紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張、丘疹或膿皰,辛辣食物、飲料以及生理和心理刺激都可能會(huì)引發(fā)或加重該疾病[2]。玫瑰痤瘡的治療方法多種多樣,包括抗生素、類維生素A、糖皮質(zhì)激素和基于光照的療法[3]。但應(yīng)用維A酸或壬二酸可能會(huì)引起干燥和明顯的燒灼感,長(zhǎng)期使用抗生素可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性,口服異維A酸可誘使胎兒器官發(fā)生障礙和骨質(zhì)減少。因此,需要開發(fā)具有較少副作用的新藥物來(lái)治療玫瑰痤瘡[4]。柴胡皂苷A(saikosaponin A,SSA)是從柴胡中分離出來(lái)的具有生物活性的物質(zhì),其具有抗病毒、抗癌、保肝、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等活性[5]。據(jù)報(bào)道,SSA通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)減輕特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚損傷[6],而SSA能否減輕小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥反應(yīng)尚不明確。相關(guān)研究顯示,抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路可有效減少過(guò)度炎癥及隨后的特應(yīng)性皮炎樣病變[7]。抑制NF-κB可減輕丙酸桿菌誘導(dǎo)的痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)[8]。表明ERK/NF-κB信號(hào)通路可能是治療炎癥性相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)。而SSA能否通過(guò)調(diào)控ERK/NF-κB信號(hào)通路抑制玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)尚不清楚。因此,本研究主要探究SSA對(duì)玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 84只,7周齡,體重為20～22 g的SPF雌性BALB/c小鼠獲自廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2022-0063。本研究中進(jìn)行的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合有關(guān)動(dòng)物護(hù)理和使用的機(jī)構(gòu)指南。

1.2主要試劑 柴胡皂苷A(規(guī)格:20 mg,純度98%)購(gòu)自成都曼思特生物公司;鹽酸多西環(huán)素(doxycycline hyclate,DH)購(gòu)自北京普非生物公司;重組小鼠表皮生長(zhǎng)因子(rmEGF)購(gòu)自上海淳麥生物公司;小鼠白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自上海赫果生物公司;兔源一抗血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,CD31)、ERK1/2、NF-κB p65、p-ERK1/2、p-NF-κB p65、GAPDH及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3玫瑰痤瘡小鼠模型的構(gòu)建[9]將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,剃除小鼠背部3 cm×3 cm范圍處毛發(fā),并向該處注射320 μmol/L LL-37,每次注射40 μL,每隔12 h注射1次,共注射4次。

1.4動(dòng)物分組及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為Ct組、Model組、低劑量SSA組(SSA-L組)、高劑量SSA組(SSA-H組)、DH組、rmEGF組(ERK激動(dòng)劑)、SSA-H+rmEGF組,每組12只。除Ct組外,其他組小鼠均需按照1.3所述方法構(gòu)建玫瑰痤瘡模型,Ct組小鼠背部注射4次等量的PBS。造模24 h后,進(jìn)行給藥處理,SSA-L組、SSA-H組[10]、DH組[11]小鼠分別灌胃37.5 mg/kg SSA、75 mg/kg SSA、30 mg/kg DH,且均需尾靜脈注射等體積的生理鹽水;rmEGF組[12]小鼠需尾靜脈注射15 μg/kg rmEGF,且需灌胃等量的生理鹽水;SSA-H+rmEGF組小鼠需灌胃75 mg/kg SSA且需尾靜脈注射15 μg/kg rmEGF;Ct組、Model組小鼠均需灌胃等量的生理鹽水且尾靜脈注射等量的生理鹽水。每天給藥一次,共給藥8周。

1.5標(biāo)本收集 選取每組全部大鼠進(jìn)行背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評(píng)分的測(cè)定;上述檢測(cè)結(jié)束后,處死小鼠,收集背部注射部位皮膚,分為兩部分(每部分包含6只小鼠背部注射部位皮膚),一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、免疫熒光染色,另一部分凍存于-80 ℃中用于ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.6皮膚紅斑面積及紅斑程度評(píng)分的測(cè)定 觀察各組小鼠背部注射部位皮膚皮損變化,并進(jìn)行紅斑程度評(píng)分,無(wú)紅斑記為0分,隱約可見紅斑記為1分,呈現(xiàn)出邊界模糊的淡紅斑記為2分,表現(xiàn)為邊界清晰的紅斑記為3分,紅斑顏色深且邊界清晰記為4分。利用Image J軟件測(cè)定皮膚紅斑面積。

1.7HE染色檢測(cè)小鼠背部注射部位皮膚病理?yè)p傷程度 小鼠皮膚組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,然后進(jìn)行HE染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠背部注射部位皮膚病理?yè)p傷程度。

1.8甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)小鼠背部注射部位皮膚肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況 小鼠皮膚組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,然后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察呈藍(lán)紫色的肥大細(xì)胞數(shù)變化。

1.9免疫熒光染色檢測(cè)CD31表達(dá) 將組織切片用檸檬酸處理用于抗原修復(fù),并與一抗CD31在4 ℃孵育過(guò)夜。然后將組織切片與Alexa Fluor?488標(biāo)記的二抗在室溫下放置40 min。使用熒光顯微鏡捕獲圖像并使用Image J分析軟件進(jìn)行分析。其中DAPI 用于染色細(xì)胞核,CD31用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.10ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)小鼠背部注射部位皮膚中IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá)。

1.11Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解緩沖液從小鼠背部注射部位皮膚勻漿中分離總蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜與一抗ERK1/2(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶2 000)、p-ERK1/2(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下過(guò)夜孵育,用二抗洗滌膜并在室溫下孵育2 h。洗滌后,使用ECL試劑對(duì)膜進(jìn)行顯影。通過(guò)Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評(píng)分的影響 Ct組小鼠背部注射部位皮膚正常;Model組小鼠背部注射部位皮膚表現(xiàn)出明顯的紅斑。與Ct組比較,Model組紅斑面積及紅斑程度評(píng)分升高(LSD-t=44.94、88.76,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組小鼠背部注射部位皮膚紅斑有所改善,紅斑面積及紅斑程度評(píng)分降低(LSD-t=13.68、34.20、35.17;18.78、64.01、64.58,P<0.05),rmEGF組小鼠背部注射部位皮膚紅斑嚴(yán)重,紅斑面積及紅斑程度評(píng)分升高(LSD-t=15.63、22.76,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組小鼠背部注射部位皮膚紅斑嚴(yán)重,紅斑面積及紅斑程度評(píng)分升高(LSD-t=13.68、29.02,P<0.05),見圖1和表1。

圖1 各組小鼠背部注射部位皮膚損傷情況

表1 SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評(píng)分的影響

2.2SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚病理?yè)p傷的影響 Ct組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)正常,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Model組小鼠皮膚屏障受損,表皮破潰,表層有大量炎性滲出細(xì)胞;與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組小鼠皮膚組織病理?yè)p傷減輕,rmEGF組小鼠皮損更為嚴(yán)重,深層結(jié)締組織有損傷;與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組小鼠皮膚組織病理?yè)p傷加劇,見圖2。

2.3SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚肥大細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 與Ct組(1.25±0.02)個(gè)/視野比較,Model組肥大細(xì)胞數(shù)(12.27±1.05)個(gè)/視野增多(LSD-t=28.66,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組肥大細(xì)胞數(shù)(9.13±0.72)個(gè)/視野、(3.62±0.15)個(gè)/視野、(3.57±0.14)個(gè)/視野減少(LSD-t=8.17、22.50、22.63,P<0.05),rmEGF組(16.69±1.18)個(gè)/視野增多(LSD-t=11.50,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組肥大細(xì)胞數(shù)(6.78±0.22)個(gè)/視野增多(LSD-t=8.22,P<0.05),見圖3。

圖3 甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)小鼠背部注射部位皮膚肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況 (×200)

2.4SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚中毛細(xì)血管分布的影響 與Ct組(12.22±1.05)個(gè)/視野比較,Model組CD31陽(yáng)性毛細(xì)血管數(shù)(33.36±1.57)個(gè)/視野增多,且呈現(xiàn)出明顯的擴(kuò)張狀態(tài)(LSD-t=27.39,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組CD31陽(yáng)性毛細(xì)血管數(shù)(26.67±1.21)個(gè)/視野、(15.59±1.24)個(gè)/視野、(15.63±1.18)個(gè)/視野減少(LSD-t=8.67、23.02、22.97,P<0.05),毛細(xì)血管變細(xì),rmEGF組(38.82±1.66)個(gè)/視野增多,且表現(xiàn)出擴(kuò)張狀態(tài)(LSD-t=7.07,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組CD31陽(yáng)性毛細(xì)血管數(shù)(21.15±1.34)個(gè)/視野增多,毛細(xì)血管擴(kuò)張(LSD-t=7.20,P<0.05),見圖4。

2.5SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚中炎性因子IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá)的影響 與Ct組比較,Model組IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá)升高(LSD-t=25.30、20.88、20.68,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組IL-6(LSD-t=8.17、22.36、22.49,P<0.05)、S100A9(LSD-t=7.40、17.28、17.57,P<0.05)、TNF-α(LSD-t=6.40、18.65、18.72,P<0.05)表達(dá)均降低,rmEGF組IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá)升高(LSD-t=9.03、13.53、8.62,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組IL-6、S100A9、TNF-α表達(dá)升高(LSD-t=6.26、6.20、7.73,P<0.05),見圖5。

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)小鼠背部注射部位皮膚中CD31的表達(dá) (×200)

Note: Compared with Ct group,aP<0.05; compared with Model group, bP<0.05; compared with SSA-L group, cP<0.05; compared with SSA-H group, dP<0.05.

2.6SSA對(duì)各組小鼠背部注射部位皮膚中ERK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Ct組比較,Model組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(LSD-t=21.65、28.45,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(LSD-t=5.20、17.75、18.62;10.39、24.38、23.93,P<0.05),rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(LSD-t=5.20、5.87,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(LSD-t=8.66、10.39,P<0.05),見圖6。

Note:1 indicated Ct; 2 indicated Model; 3 indicated SSA-L; 4 indicated SSA-H; 5 indicated DH; 6 indicated rmEGF; 7 indicated SSA-H+rmEGF; compared with Ct group,aP<0.05; compared with Model group, bP<0.05; compared with SSA-L group, cP<0.05; compared with SSA-H group, dP<0.05.

3 討論

玫瑰痤瘡是臨床常見的慢性炎癥性皮膚病,其影響全球約5.5%的人口,并可能導(dǎo)致毀容、影響情緒和生活質(zhì)量下降等[13]。傳統(tǒng)的玫瑰痤瘡治療方法,如抗生素、類維生素A等均不能取得滿意的療效[14]?？咕腖L37因其在玫瑰痤瘡患者皮膚和LL37誘導(dǎo)的玫瑰痤瘡表型的小鼠模型中的高表達(dá)而被認(rèn)為是玫瑰痤瘡發(fā)生的一種關(guān)鍵分子,并且已被廣泛接受的是,可以進(jìn)行皮內(nèi)注射LL37以建立玫瑰痤瘡小鼠模型[15-16]。本研究利用上述方式構(gòu)建玫瑰痤瘡小鼠模型,結(jié)果顯示,Model組小鼠背部注射部位皮膚表現(xiàn)出明顯的紅斑表型,與Ct 組比較,Model組紅斑面積及紅斑程度評(píng)分升高,提示玫瑰痤瘡小鼠模型構(gòu)建成功。S100A9作為一種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì),其在玫瑰痤瘡中上調(diào)表達(dá)[13];IL-6、TNF-α作為常見用于衡量機(jī)體炎癥水平的因子,已有研究表明,抑制IL-6、TNF-α表達(dá)可減弱玫瑰痤瘡樣表型和炎癥反應(yīng)[17]。本研究顯示,Model組小鼠皮膚組織增厚,有大量炎性細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn),表明Model組小鼠炎癥反應(yīng)加劇。盡管玫瑰痤瘡的病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚,但多種因素,如新血管生成增加與其發(fā)病機(jī)制有關(guān)[18]。本研究顯示,與Ct組比較,Model組血管生成的關(guān)鍵標(biāo)志物CD31陽(yáng)性毛細(xì)血管數(shù)增多,且呈現(xiàn)出明顯的擴(kuò)張狀態(tài),表明Model組小鼠存在毛細(xì)血管擴(kuò)張及增多現(xiàn)象。提示LL37進(jìn)入表皮后,引起了IL-6、S100A9、TNF-α等炎性因子增多,激活了肥大細(xì)胞,長(zhǎng)期的炎性刺激導(dǎo)致了毛細(xì)血管的增生與擴(kuò)張,進(jìn)而加劇了皮膚的炎癥反應(yīng)。因此,抑制炎癥反應(yīng)及血管生成可能是治療玫瑰痤瘡的有效策略之一。

SSA是柴胡最有效的成分之一,具有較強(qiáng)的抗炎作用[19]。據(jù)報(bào)道,SSA可抑制大鼠急性脊髓損傷早期組織和血清中TNF-α、IL-6水平[20];SSA可改善過(guò)敏性鼻炎小鼠鼻部炎癥[21];SSA通過(guò)抑制腫瘤血管生成來(lái)抑制結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)[22];SSA可抑制坐骨神經(jīng)損傷大鼠炎癥反應(yīng)及瘢痕形成[23]。以上研究表明SSA具有抑制炎癥反應(yīng)及血管生成的作用。而關(guān)于SSA對(duì)玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)及血管生成的影響尚未見報(bào)道。本研究顯示,SSA可抑制玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)、毛細(xì)血管增生及擴(kuò)張,且SSA劑量越高,抑制作用越明顯。鹽酸多西環(huán)素(DH)是臨床上治療玫瑰痤瘡常用藥物[24],本研究選擇此藥物為陽(yáng)性治療藥物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SSA-H組與DH組比較,對(duì)應(yīng)指標(biāo)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示SSA可能是玫瑰痤瘡的潛在治療藥物。

激活的ERK1/2通過(guò)激活NF-κB來(lái)刺激細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子進(jìn)而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)[25]。已有研究表明,抑制ERK/NF-κB通路可減輕慢性腎臟病大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[26];抑制ERK/NF-κB通路可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤形成過(guò)程中的血管生成[27];激活NF-κB可促進(jìn)玫瑰痤瘡的發(fā)生與發(fā)展[28]。以上研究證實(shí)了ERK/NF-κB通路的促炎及促血管生成作用,該通路可能成為治療玫瑰痤瘡的關(guān)鍵突破口之一,本研究結(jié)果與其一致。本研究發(fā)現(xiàn),與Ct 組比較,Model組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高;與Model組比較,rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高,提示ERK/NF-κB通路可能參與了玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)、毛細(xì)血管增生及擴(kuò)張過(guò)程。SSA可降低玫瑰痤瘡小鼠皮膚中p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白的表達(dá),且SSA劑量越高,降低作用越明顯,提示SSA可能通過(guò)抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。為了驗(yàn)證該猜想,本研究在高劑量SSA作用的基礎(chǔ)上再加上ERK激動(dòng)劑rmEGF處理Model組小鼠,結(jié)果顯示,rmEGF減弱了高劑量SSA對(duì)玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用。證實(shí)猜想是正確的,即SSA可能通過(guò)抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述,SSA可能通過(guò)抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了SSA可作為L(zhǎng)L37誘導(dǎo)的皮膚炎癥疾病的有前途的藥物。然而,本研究尚存在不足之處,SSA對(duì)玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用可能還涉及其他通路,本研究尚未涉及,這將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。