胃癌精準(zhǔn)診斷的核酸生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

李巧楠,王 婷,張焜和

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,江西省消化疾病研究所,南昌 330006)

胃癌是全球第五大常見癌癥,也是第四大癌癥相關(guān)死因,估計(jì)2020年全球新發(fā)胃癌病例超過(guò)100萬(wàn)例,死亡病例估計(jì)76.9萬(wàn)例[1],嚴(yán)重威脅人類健康。手術(shù)切除仍是胃癌最有效的治療方法,但因早期癥狀不明顯,胃癌診斷時(shí)多數(shù)為中晚期,錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī),5年生存率仍不理想。目前胃癌診斷依賴于胃鏡檢查和活檢,但其有創(chuàng)性、費(fèi)用高、資源不足和較高的技術(shù)要求,難以用于胃癌的篩查,因而胃癌的早期診斷仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此,通過(guò)精準(zhǔn)診斷,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療,可能是目前提高胃癌療效、改善預(yù)后的關(guān)鍵途徑。

胃癌精準(zhǔn)診斷需要借助相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)和應(yīng)用。然而,傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物,包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、糖類抗原125(CA125)和糖類抗原72-4(CA72-4),在胃癌的診斷中價(jià)值有限[2]。為了改變胃癌缺乏有效標(biāo)志物的現(xiàn)狀,近年來(lái)開展了大量胃癌相關(guān)核酸分子及其臨床診療意義的研究,包括微小RNA(miRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、外泌體源性RNA、Piwi蛋白互作RNA(piRNA)、循環(huán)游離DNA(cfDNA)和循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)等。結(jié)果顯示它們對(duì)胃癌的診斷、轉(zhuǎn)移、臨床分期、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)判等具有不同價(jià)值,在胃癌的精準(zhǔn)診斷方面有良好的潛在應(yīng)用價(jià)值。為此,本文就上述核酸分子標(biāo)志物在胃癌精準(zhǔn)診斷方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA

miRNA是含有18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA,能調(diào)控基因表達(dá),在細(xì)胞和組織的增殖、分化、發(fā)育和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。miRNA作為新型生物標(biāo)志物,在胃癌的診斷和治療中具有較大潛在價(jià)值。

miRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平可以發(fā)生明顯改變,并與胃癌的生物學(xué)行為有關(guān)。JEDDI等[4]發(fā)現(xiàn),miR-200a和miR-28在胃癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào),且miR-28表達(dá)越低,胃癌體積越大、組織學(xué)分級(jí)越高、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生率越高。BAO等[5]報(bào)道m(xù)iR-148a-3p在胃癌組織和血漿中均顯著下調(diào),過(guò)表達(dá)miR-148a-3p可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖表型、轉(zhuǎn)移表型和癌干細(xì)胞樣特性,從而抑制胃癌的進(jìn)展。miRNA可通過(guò)腫瘤相關(guān)分子或信號(hào)通路而影響胃癌的生物學(xué)行為,如胃癌中miR-1292-5p可以抑制原癌蛋白DEK而影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[6];miR-653-5p通過(guò)作用細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子6(SOCS6)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[7],表明miRNA可作為治療靶點(diǎn)的候選者,從而為胃癌的治療提供新的思路。

血漿和尿液中的miRNA在胃癌精準(zhǔn)診斷中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值,特別是早期胃癌。CHEN等[8]發(fā)現(xiàn),血漿中miR-421表達(dá)上調(diào)發(fā)生于胃癌前病變和胃癌早期,其診斷胃癌的AUC、敏感度、準(zhǔn)確度優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA125、CA153、CA211和CA50),而其特異度高于CEA、CA153和CA50(均P<0.05)。此外,IWASAKI等[9]檢測(cè)了胃癌和健康對(duì)照者尿液中miRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-6807-5p和miR-6856-5p在胃癌患者中表達(dá)上調(diào),術(shù)后下降到低于檢測(cè)下限,將它們與幽門螺桿菌感染狀態(tài)聯(lián)合檢測(cè),對(duì)胃癌有良好診斷價(jià)值(AUC=0.885),且可以區(qū)分Ⅰ期胃癌和健康對(duì)照者(AUC=0.748)。因此,miRNA作為診斷早期胃癌的新型生物標(biāo)志物具有較大潛力,能鑒別胃癌與其他胃良性疾病。

2 circRNA

circRNA是一類閉合的非編碼RNA,無(wú)5′端帽狀結(jié)構(gòu)和3′端polyA結(jié)構(gòu)[10]。因閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)而不易被RNA酶降解,circRNA在人體細(xì)胞中具有高穩(wěn)定性、廣泛性、高保存性[11],有望成為癌癥的新型生物標(biāo)志物。

2013年,HANSEN等[12]首次發(fā)現(xiàn)circRNA可作為miRNA的海綿而參與基因表達(dá)和調(diào)控,并影響轉(zhuǎn)錄后過(guò)程。此后不少研究證實(shí)circRNA主要作為miRNA的海綿而發(fā)揮作用。DENG等[13]發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3充當(dāng)miR-654-3p的海綿,通過(guò)激活p21信號(hào)通路抑制胃癌的生長(zhǎng)。LIU等[14]也發(fā)現(xiàn)circ-MAT2BGC在胃癌細(xì)胞中顯著升高,并作為miR-515-5p的海綿增加HIF-1α表達(dá),參與circ-MAT2B/miR-515-5p/HIF-1α的正調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CAO等[15]證實(shí)hsa_circ_0008259(circLMO7)作為miR-30a-3p海綿影響WNT2/β-Catenin通路,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外,circRNA還能通過(guò)抑制蛋白活性發(fā)揮抑癌作用。ZHANG等[16]在小鼠腫瘤模型上發(fā)現(xiàn),hsa_circ_0061137(circDIDO1)編碼的529aa蛋白能直接與聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)相互作用而抑制其活性;另外該研究還發(fā)現(xiàn)circDIDO1與過(guò)氧化還原蛋白2(PRDX2)特異性結(jié)合,促進(jìn)RBX1介導(dǎo)的PRDX2泛素化和降解,從而導(dǎo)致其下游信號(hào)通路失活而發(fā)揮抑癌作用,進(jìn)一步說(shuō)明circDIDO1發(fā)揮抑制胃癌作用,這為胃癌診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。

circRNA不但與胃癌的生物學(xué)行為密切相關(guān),其在胃癌患者的體液和癌組織中的表達(dá)水平也發(fā)生改變,可作為潛在的胃癌標(biāo)志物。LI等[17]分析了胃癌患者與健康對(duì)照血漿中的circRNA差異表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001017和hsa_circ_0061276對(duì)胃癌有良好的診斷價(jià)值,兩者聯(lián)合的AUC為0.912,靈敏度為0.847,特異度為0.966,且它們?cè)谖赴┙M織中的低表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),血清水平低者生存時(shí)間更短,術(shù)后恢復(fù)正常者預(yù)后更好。XU等[18]也發(fā)現(xiàn)circ_0004771在胃癌組織中表達(dá)上調(diào),其血漿水平明顯高于淺表性胃炎和正常對(duì)照,診斷胃癌的總AUC為0.831,鑒別胃癌與淺表性胃炎的AUC為0.845,胃癌術(shù)后血清circ_0004771恢復(fù)正常,復(fù)發(fā)后再度升高,可見circ_0004771能良好鑒別胃癌與胃良性病變,并且有望成為一種新的血清標(biāo)志物監(jiān)測(cè)胃癌狀態(tài)。

3 lncRNA

lncRNA是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA。大多數(shù)lncRNA通常不是翻譯成蛋白質(zhì),而是作為功能性RNA分子參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑、細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育[19]。

lncRNA廣泛存在于胃癌患者的癌組織和體液中。LIU等[20]發(fā)現(xiàn),在胃癌組織、細(xì)胞系和血清中l(wèi)ncRNA HOXA11-AS表達(dá)上調(diào),其中其血清水平降低與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),診斷胃癌的AUC高達(dá)0.924。KE等[21]發(fā)現(xiàn)4種lncRNA(AK001058、INHBA-AS1、MIR4435-2HG和CEBPA-AS1)在胃癌患者的血漿中顯著升高,聯(lián)合診斷胃癌的AUC高達(dá)0.921。FENG等[22]使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)胃癌患者、息肉患者和正常對(duì)照組血清中l(wèi)ncRNA B3GALT5-AS1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),胃癌患者的B3GALT5-AS1水平明顯高于正常人,AUC為0.816,B3GALT5-AS1可作為區(qū)分胃癌患者與健康人的診斷標(biāo)志物。由此可見,lncRNA在胃癌患者組織和體液中高表達(dá),是一種有潛力的胃癌的非侵襲性診斷標(biāo)志物。

許多l(xiāng)ncRNA可作為miRNA的海綿,在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。JIANG等[23]發(fā)現(xiàn)lncRNA KLF3-AS1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),其作為miR-223的海綿抑制胃癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng),且能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,但在胃癌中的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。ZHAO等[24]發(fā)現(xiàn)IncRNA LINC00339在胃癌中過(guò)度表達(dá),可充當(dāng)miR-539的海綿調(diào)節(jié)SRY-Box 9(SOX9),在胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中起著關(guān)鍵作用。此外,LIU等[25]發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比,lncRNA RP11-874J12.4在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高,作為miR-3972的海綿而調(diào)節(jié)RP11-874J12.4/miR-3972/SSR2軸增強(qiáng)MKN-45和AGS胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗力,可作為胃癌診斷和治療的靶點(diǎn)。

4 外泌體源性RNA

外泌體是細(xì)胞分泌的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的囊泡物質(zhì),平均直徑為100 nm[26],其中含有蛋白、脂質(zhì)、非編碼RNA等物質(zhì)。外泌體于20世紀(jì)80年代被提出[27],認(rèn)為外泌體是細(xì)胞內(nèi)的“垃圾袋”,可以通過(guò)轉(zhuǎn)移其中特定物質(zhì)來(lái)進(jìn)行局部和遠(yuǎn)處的細(xì)胞間通信而參與許多生物過(guò)程。其有可能成為胃癌精準(zhǔn)診斷的標(biāo)志物,近年來(lái)已成為研究熱點(diǎn)。

外泌體來(lái)源的lncRNA對(duì)胃癌的診斷有較大的價(jià)值。早期胃癌的診斷備受關(guān)注,LIN等[28]在早期胃癌血漿中發(fā)現(xiàn)一種特異性外泌體lncRNA——lncUEGC1,鑒別早期胃癌與健康個(gè)體和慢性萎縮性胃炎的AUC分別高達(dá)0.8760和0.8406,說(shuō)明lncUEGC1有望成為早期胃癌的新型標(biāo)志物。ZHAO等[29]發(fā)現(xiàn),與正常健康人比較,外泌體lncRNA HOTTIP在胃癌血清中表達(dá)上調(diào),診斷胃癌的AUC為0.827,顯著高于CEA、CA 19-9和CA72-4;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HOTTIP的血清水平還與胃癌的浸潤(rùn)深度、TNM分期和生存期顯著相關(guān),可能具有診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的雙重價(jià)值。另有研究[30]發(fā)現(xiàn)外泌體中轉(zhuǎn)錄因子FOXM1相關(guān)的lncRNA(FRLnc1)在胃癌細(xì)胞、組織和血清中的表達(dá)均上調(diào),在血清外泌體中尤為明顯(診斷胃癌的AUC為0.863),并證實(shí)胃癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)FRLnc1促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

外泌體來(lái)源的circRNA也與胃癌相關(guān),可能是胃癌潛在的標(biāo)志物。有研究[31]發(fā)現(xiàn)胃癌組織和血清中外泌體circSHKBP1(hsa_circ_0000936)的表達(dá)增加,其水平與TNM分期和生存率呈負(fù)相關(guān),且在胃癌切除術(shù)后表達(dá)水平明顯下降;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)circSHKBP1可調(diào)節(jié)miR-582-3p/HUR/VEGF途徑,抑制HSP90降解,從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展,有可能成為胃癌治療探索的新方向。ZHENG等[32]發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,外泌體hsa_circ_0015286在胃癌組織、血漿和癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均升高,診斷胃癌的AUC分別為0.778、0.673和0.665,三者聯(lián)合檢測(cè)AUC可提高到0.843。由此推斷外泌體來(lái)源的circRNA在胃癌中可作為診斷、治療和判斷預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。

外泌體來(lái)源的miRNA在胃癌診療中的意義已有不少報(bào)道,其對(duì)胃癌的診斷價(jià)值優(yōu)于血清miRNA,并與胃癌的轉(zhuǎn)移、分期等相關(guān)。WEI等[33]發(fā)現(xiàn)胃癌血清外泌體中的miR-15b-3p高于正常對(duì)照,其診斷胃癌的AUC為0.820,優(yōu)于癌組織和血清中miR-15b-3p對(duì)胃癌的診斷價(jià)值(AUC分別為0.674和0.642),還發(fā)現(xiàn)血清中外泌體源性miR-15b-3p可以預(yù)測(cè)胃癌患者的總生存期,外泌體源性miR-15b-3p診斷胃癌具有更高的靈敏度,同時(shí)也是胃癌預(yù)后指標(biāo)。ZHENG等[34]檢測(cè)了218例血清樣本的外泌體miRNA-590-5p表達(dá)水平,其在健康對(duì)照組、早期(Ⅰ和Ⅱ)胃癌組和晚期(Ⅲ)胃癌組的表達(dá)水平使用2-ΔΔCT法計(jì)算分別為30.34±6.35、6.19±0.81和2.9±0.19,診斷胃癌的AUC為0.810,敏感度為63.7%,特異度為86.0%,并與胃癌的浸潤(rùn)深度、TNM分期和生存期密切相關(guān)。因此,外泌體來(lái)源的miRNA在胃癌的診斷和預(yù)后中有重要價(jià)值。

與血漿或血清中的RNA分子相比,外泌體中的RNA分子具有以下優(yōu)點(diǎn):外泌體的含量與供體細(xì)胞的含量密切相關(guān),使基于外泌體的RNA分子檢測(cè)具有更高的特異性;外泌體穩(wěn)定存在于各種生物液體中,其中的RNA分子可免受RNA酶的降解。因此,外泌體來(lái)源的RNA分子作生物標(biāo)志物有良好的診斷價(jià)值。

5 piRNA

piRNA是具有21～35個(gè)核苷酸的一類小非編碼RNA,與piwi家族蛋白相互作用。人類中有30000多種piRNA基因,在轉(zhuǎn)座子沉默、表觀遺傳調(diào)控和生殖系發(fā)育中發(fā)揮作用[35]。近年來(lái),有研究[36]表明piRNA在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等各種癌癥中異常表達(dá)。

VINASCO SANDOVAL等[37]在胃癌組織中發(fā)現(xiàn)698個(gè)piRNA,其中piR-48966、piR-49145、piR-31335在胃癌與癌旁組織間存在差異表達(dá)。CHENG等[38]使用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)piR-823在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于非癌組織,增加piR-823表達(dá)量,細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,說(shuō)明piR-823在胃癌中有重要價(jià)值,但這只停留在小鼠模型階段。另一項(xiàng)研究[39]發(fā)現(xiàn),胃癌患者胃液中的piR-1245水平高于健康對(duì)照,區(qū)分兩者的AUC為0.885,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)胃液中piR-1245高表達(dá)的胃癌患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期較差。因此,piRNA可能是有前途的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物,但目前為止,piRNA與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不明確,仍需要進(jìn)一步研究。

6 ctDNA和cfDNA

源于腫瘤細(xì)胞的DNA片段進(jìn)入血液循環(huán)即為ctDNA[40],與血液中的其他游離DNA共同構(gòu)成cfDNA。cfDNA可以在健康人的血清或血漿中檢測(cè)到,但大多數(shù)cfDNA來(lái)源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞。

早在2011年,有研究[41]發(fā)現(xiàn)胃癌患者血漿cfDNA水平比正常健康組高2～3倍。PARK等[42]在54例胃癌患者和59名匹配的健康對(duì)照中,發(fā)現(xiàn)胃癌組血漿cfDNA的平均水平比對(duì)照組高出2.4倍,cfDNA在胃癌患者血漿中高表達(dá),這為診斷胃癌帶來(lái)了可能性。ZHANG等[43]檢測(cè)了胃癌患者術(shù)前和術(shù)后cfDNA濃度和完整性,發(fā)現(xiàn)胃癌患者的術(shù)前cfDNA水平明顯高于術(shù)后,術(shù)后2種指標(biāo)也明顯高于健康對(duì)照組,表明血漿cfDNA濃度測(cè)定可能適用于檢測(cè)胃癌。HUANG等[44]分析了血漿cfDNA提取物中的ssDNA與dsDNA的比值,發(fā)現(xiàn)胃癌患者這一比值明顯低于健康對(duì)照組,診斷胃癌的AUC為0.923,且該比值在不可切除胃癌明顯低于可切除胃癌,表明該比值在胃癌診斷有較大的潛力,對(duì)能否行外科手術(shù)有預(yù)測(cè)價(jià)值,此外,該比值還不受溶血和反復(fù)凍融的影響,可能是一項(xiàng)穩(wěn)定性好的指標(biāo)。值得注意的是,在一項(xiàng)前瞻性研究中,CABEL等[45]使用PCR技術(shù)檢測(cè)了非轉(zhuǎn)移性胃腺癌患者圍手術(shù)期化療期間血漿ctDNA水平,發(fā)現(xiàn)術(shù)前胃癌患者中沒有一個(gè)具有可檢測(cè)的ctDNA水平(N=0/18),術(shù)后只有一個(gè)患者具有可檢測(cè)的ctDNA水平(1/13),認(rèn)為ctDNA檢測(cè)的敏感性較差,不是預(yù)測(cè)非轉(zhuǎn)移性胃癌化療和術(shù)后復(fù)發(fā)療效的有用工具,然而,這種低檢出率背后的機(jī)制仍不明確,可能需要進(jìn)一步研究和開發(fā)更敏感的檢測(cè)技術(shù)。

cfDNA和ctDNA用作腫瘤液體活檢的檢材,具有重復(fù)性好、創(chuàng)傷小等特點(diǎn)[46],有望成為胃癌精準(zhǔn)診斷的生物標(biāo)志物,但將其轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)際應(yīng)用仍面臨巨大挑戰(zhàn)。ctDNA的檢測(cè)和定量受其不穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)變化的限制,cfDNA水平在健康受試者中也升高,提示缺乏癌癥特異性,因此,有必要改進(jìn)ctDNA和cfDNA的檢測(cè)技術(shù),以獲得更有價(jià)值的檢測(cè)結(jié)果。此外,雖然cfDNA和ctDNA能帶來(lái)腫瘤相關(guān)信息,但它們與原發(fā)腫瘤之間有一定差異,并不能完全代替原發(fā)腫瘤,只能發(fā)揮補(bǔ)充作用。

7 總結(jié)與展望

CEA等傳統(tǒng)血清腫瘤標(biāo)志物,盡管在胃癌的分期和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)方面有一定價(jià)值,對(duì)胃癌的診斷價(jià)值非常有限。新型核酸標(biāo)志物,包括microRNA、circRNA、lncRNA、外泌體源性RNA、piRNA等,與胃癌的生物學(xué)行為和疾病狀態(tài)有較密切的關(guān)系,診斷價(jià)值優(yōu)于傳統(tǒng)血清生物標(biāo)志物,有可能在胃癌的精準(zhǔn)診斷中發(fā)揮重要作用,但相關(guān)研究目前尚處于初級(jí)階段,距離臨床應(yīng)用還有較大差距。就臨床角度而言,目前的研究一般為小樣本的單中心研究,需要大樣本、多中心的前瞻性研究驗(yàn)證它們的價(jià)值。從技術(shù)層面來(lái)看,涉及的檢測(cè)技術(shù)多數(shù)較為復(fù)雜而臨床實(shí)用性差,需要不斷優(yōu)化和簡(jiǎn)化以適應(yīng)臨床需要。另外,由于胃癌的異質(zhì)性,單個(gè)腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷價(jià)值不一定理想,可能需要2種或2種以上指標(biāo)聯(lián)合,才能進(jìn)行更精準(zhǔn)的診斷,這進(jìn)一步增加了研究的難度。盡管如此,由于血液腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有簡(jiǎn)便、易于重復(fù)、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn),有理由相信,隨著研究的深入和技術(shù)的改進(jìn),生物標(biāo)志物將為胃癌的精準(zhǔn)診斷提供重要支撐。