Notch信號(hào)通路調(diào)控T細(xì)胞免疫在氣道炎癥性疾病中的作用

趙競(jìng)一，王俊閣

作者單位：100010 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科

氣道炎癥性疾病是以氣道炎癥、氣道阻塞和組織重塑為特征的感染性或變態(tài)反應(yīng)性疾病，包括變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)、支氣管哮喘(bronchial asthma，BA)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等。氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，已知多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同參與其中。在氣道炎癥中有一系列的信號(hào)通路激活，如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路、核因子激活的B細(xì)胞κ-輕鏈(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信號(hào)通路、Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號(hào)通路及Notch信號(hào)通路等，各自發(fā)揮多種分子生物學(xué)功能。其中Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)系統(tǒng)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、運(yùn)動(dòng)和干細(xì)胞增殖等，決定細(xì)胞命運(yùn)和組織形態(tài)，對(duì)臟器的形態(tài)和功能產(chǎn)生影響。T淋巴細(xì)胞作為氣道炎癥中機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分，在對(duì)抗各種病原體中發(fā)揮重要的免疫作用，近年來(lái)關(guān)于Notch信號(hào)通路與T細(xì)胞之間相互作用的研究也逐漸深入，Notch信號(hào)在氣道炎性疾病中的作用機(jī)制研究及靶向藥物治療成為一大熱點(diǎn)。本文就Notch信號(hào)通路調(diào)控T細(xì)胞免疫在氣道炎癥性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Notch信號(hào)通路的組成與激活

1917年，由“遺傳學(xué)之父”Thomas Hunt Morgan首先描述，突變體果蠅存在一種基因，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺刻(notch)，故而得名Notch基因。Notch基因編碼一系列跨膜受體蛋白，后者構(gòu)建包括Notch受體、Notch配體、CSL-DNA結(jié)合蛋白以及下游靶基因在內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡甚至突變等重要環(huán)節(jié)，是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要基因[1]。

Notch受體為Ⅰ型跨膜蛋白，分為胞外域、跨膜蛋白和胞內(nèi)域三部分，在哺乳動(dòng)物中有4種類型(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)。胞外域?yàn)楫惗垠w蛋白，包含29～36個(gè)用于結(jié)合Notch配體的表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列，以及3個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列和1個(gè)異二聚化結(jié)構(gòu)域，用于阻止配體無(wú)關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)?？缒さ鞍缀幸粋€(gè)S3裂解位點(diǎn)。胞內(nèi)域由隨機(jī)結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)序列、核定位信號(hào)、反式激活結(jié)構(gòu)域及P序列組合而成[2]。Notch配體同樣為Ⅰ型跨膜蛋白，分為Delta like(DLL1、DLL3、DLL4)和Jagged(JAG1、JAG2)兩類，其N端為Notch受體結(jié)合和活化所必須的DSL(Delta/Serrate/Lag-2)基序，隨后根據(jù)配體的種類具有不同數(shù)量的表皮生長(zhǎng)因子樣重復(fù)序列[3]。

Notch信號(hào)的激活和傳導(dǎo)是一種即時(shí)通訊，通過(guò)配體-受體交互作用發(fā)揮功能。典型的傳遞途徑是，Notch配體蛋白與受體胞外域結(jié)合后，經(jīng)過(guò)弗林(furin)蛋白酶、金屬蛋白酶及γ-分泌酶于S1～S3酶切位點(diǎn)的三步酶切過(guò)程，配體蛋白被切斷并釋放具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的胞內(nèi)域，后者與重組結(jié)合蛋白Jκ(recombination signal sequence-binding protein Jκ，RBP-Jκ)結(jié)合，調(diào)控下游基因表達(dá)[4-5]。另外，Notch信號(hào)傳導(dǎo)也可以通過(guò)非RBP-Jκ途徑調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。這兩種從細(xì)胞表面受體到細(xì)胞核基因組的信號(hào)傳遞是直接的、線性的，沒(méi)有信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的過(guò)程[6]。

2 Notch信號(hào)通路對(duì)T細(xì)胞的調(diào)控作用

Notch信號(hào)參與T細(xì)胞多階段的發(fā)育和分化過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化及免疫活動(dòng)，對(duì)其發(fā)育和功能具有顯著影響。

2.1 Notch信號(hào)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化

T細(xì)胞分化依賴Notch信號(hào)途徑。在胸腺表達(dá)的Notch蛋白作用下初始T細(xì)胞發(fā)育為雙陰性1細(xì)胞(double negative 1，DN1，CD44+CD25-CD4-CD8-)，繼而增殖分化為雙陰性2細(xì)胞(double negative 2，DN2，CD44+CD25+CD4-CD8-)并表達(dá)高水平CD25[7]。隨著Notch信號(hào)的目的基因Hes1(hairy and enhancer of split 1)表達(dá)增加，DN2細(xì)胞的增殖逐漸減少并轉(zhuǎn)化為DN3細(xì)胞(double negative 3，CD44-CD25+CD4-CD8-)，同時(shí)Gata3(GATA-binding protein 3)、Tcf7(transcription factor 7)、Runx1(RUNX family transcription factor 1)等重要T細(xì)胞基因在此階段達(dá)到表達(dá)峰值。DN3細(xì)胞依據(jù)CD27表達(dá)量的高低，可分為DN3a和DN3b兩種亞型(后者高表達(dá)CD27)，其DNA位點(diǎn)β、γ及δ重排后生成多種T細(xì)胞受體鏈(T cell receptor，TCR)，在Notch信號(hào)的參與下，通過(guò)β-選擇及γδ -選擇過(guò)程分化為對(duì)應(yīng)的αβT細(xì)胞或γδT細(xì)胞[8]；同時(shí)DN3細(xì)胞向DN4細(xì)胞(double negative 4，CD44-CD25-CD4-CD8-)轉(zhuǎn)化，隨后在Notch信號(hào)誘導(dǎo)下DN4細(xì)胞向CD4+CD8+雙陽(yáng)性αβT細(xì)胞(double positive，DP)分化。其中CD4受體與MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ型配體結(jié)合，促使DP向CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化；CD8受體與MHC Ⅰ型配體結(jié)合，促使DP向CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，該步驟同樣由Notch信號(hào)介導(dǎo)[9]。Notch分子在CD4+T細(xì)胞表面廣泛分布，通過(guò)誘導(dǎo)Tbx2(T-box transcription factor 2)、Gata3、FOXP3(forkhead box protein P3)、ROR-γt(etinoic acid receptor-related orphan receptor γt)表達(dá)，使初始CD4+T細(xì)胞在外周接受抗原刺激后分化為T輔助細(xì)胞(Th)，包括Th1、Th2、Th17及T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)[10-12]，執(zhí)行不同的防御功能以滿足機(jī)體免疫反應(yīng)的需要。值得注意的是，Notch信號(hào)在人類和小鼠中的作用并非完全一致，人類Notch信號(hào)可有效促進(jìn)γδT細(xì)胞分化，而小鼠只有DN2細(xì)胞向γδT17細(xì)胞分化時(shí)由Notch-Hes1通路介導(dǎo)，其余亞型γδT細(xì)胞的分化不需要Notch信號(hào)參與[13]，這種現(xiàn)象可能與人類和小鼠胸腺中Notch配體的表達(dá)種類不同有關(guān)：小鼠胸腺表達(dá)Dll4，而人類胸腺內(nèi)表達(dá)的是JAG2[14]。因此，基于小鼠模型的Notch信號(hào)研究成果向人類治療途徑轉(zhuǎn)化時(shí)應(yīng)注意兩者之間的差異性。

2.2 Notch信號(hào)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化

Notch信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)多種T細(xì)胞的活化。TCR被MHC復(fù)合體激活后，引起Notch受體釋放胞內(nèi)域[15]并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而維持T細(xì)胞激活狀態(tài)。例如，Notch1-RBP-Jκ-IL-7Rα通路可使小鼠γδT17細(xì)胞維持激活狀態(tài)，持續(xù)造成組織損傷[16]。又如，Notch信號(hào)非經(jīng)典途徑可與雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)共同作用，激活PKB信號(hào)并保護(hù)線粒體功能，減輕細(xì)胞核損傷，從而維持T細(xì)胞的生存狀態(tài)[17]。Vγ9Vδ2T細(xì)胞是人體外周血循環(huán)中主要的γδT細(xì)胞亞群，在抗炎、抗腫瘤活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，研究通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，阻滯Notch信號(hào)可顯著抑制Vγ9Vδ2T細(xì)胞激活，并下調(diào)與其殺傷功能相關(guān)的基因表達(dá)[18]。此外，樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)Notch信號(hào)上調(diào)醛脫氫酶1家族成員A2(aldehyde dehydrogenase 1 family member a2，Aldh1a2)轉(zhuǎn)錄，增加維甲酸的合成，促進(jìn)Th17細(xì)胞活化并調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞數(shù)量平衡[19]。

2.3 Notch信號(hào)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能

Notch信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的功能發(fā)揮有重要的調(diào)節(jié)作用。TCR信號(hào)可激活Notch-RBP-Jκ經(jīng)典信號(hào)通路，后者可通過(guò)NF-κB通路反饋調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖并增加干擾素γ(interferon-gamma，IFN-γ)的釋放，繼而增強(qiáng)T細(xì)胞免疫活性[20]。另外，Notch信號(hào)可通過(guò)增強(qiáng)T細(xì)胞表面白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2受體CD25的表達(dá)，使T細(xì)胞結(jié)合更多的抗原并降低T細(xì)胞的反應(yīng)閾值[21]。Notch信號(hào)可通過(guò)上調(diào)穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的殺傷力[22]；研究發(fā)現(xiàn)在甲型H1N1流感患者中，Notch受體和配體的表達(dá)明顯升高，信號(hào)通路的激活可增強(qiáng)病毒特異性CD8+T細(xì)胞的殺傷功能[23]。若抑制正常人外周血CD8+T細(xì)胞的Notch1信號(hào)通路，其IFN-γ、IL-2及顆粒酶B的釋放將受到明顯抑制[24]。若使用γ分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor，GSI)抑制γδT細(xì)胞Notch信號(hào)通路，或敲除其Notch基因，則γδT細(xì)胞釋放IFN-γ明顯減少，且對(duì)于磷酸抗原和抗CD3抗體刺激的細(xì)胞反應(yīng)性降低，細(xì)胞殺傷力減弱[15]。

3 氣道炎癥性疾病中以Notch信號(hào)調(diào)控T細(xì)胞為靶點(diǎn)的相關(guān)研究

3.1 變應(yīng)性鼻炎

Notch信號(hào)在AR患者中高表達(dá)，其通路激活程度與特異性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)的水平呈正相關(guān)[25]。Notch1信號(hào)可下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3表達(dá)，從而抑制Treg細(xì)胞分化，并上調(diào)IL-6、IL-10的表達(dá)，最終促進(jìn)變應(yīng)性鼻炎發(fā)展，因此阻斷Notch1信號(hào)通路是治療AR的潛在途徑[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)采用卵清蛋白致敏小鼠后，通過(guò)GSI阻滯小鼠Notch信號(hào)，小鼠過(guò)敏樣癥狀可明顯緩解，外周血Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5及特異性IgE抗體水平下降，鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及杯狀細(xì)胞化生明顯減輕，說(shuō)明干預(yù)Notch信號(hào)對(duì)于AR的治療具有重要價(jià)值[27-28]。AR中不同亞型Notch受體在存在功能差異，如致敏小鼠模型外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch1、Notch3、Notch4的蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，而Notch2的表達(dá)較低[29]；有研究發(fā)現(xiàn)Notch2信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)FOXP3表達(dá)，可促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，顯著抑制AR炎癥反應(yīng)[5]。中藥治療方面，研究表明單味中藥及復(fù)方制劑均可影響Notch信號(hào)通路功能，明顯抑制AR炎性因子水平，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞亞群平衡[30-31]。

3.2 支氣管哮喘

研究發(fā)現(xiàn)，BA模型小鼠Notch配體Jagged1、Dll4呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，后者使小鼠外周血Th17/Treg細(xì)胞比例升高，阻斷Notch-Dll4信號(hào)通路對(duì)BA模型小鼠Th17細(xì)胞分化起到抑制作用[32]。小鼠中Notch1和Notch2可能是促進(jìn)BA發(fā)病的主要信號(hào)通路，通過(guò)小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)分別阻斷小鼠Notch1～Notch4信號(hào)，其中Notch1和Notch2被阻斷后出現(xiàn)肺組織T細(xì)胞IL-4、IL-5表達(dá)降低，IFN-γ表達(dá)升高[33]。另外，BA模型小鼠Notch配體JAG1、JAG2的表達(dá)增加可能與氣道炎癥反應(yīng)及黏膜重塑有關(guān)[34]，通過(guò)Notch1-Hes1信號(hào)通路可促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，從而加重氣道的上皮下纖維化。Pyrin重組蛋白可通過(guò)下調(diào)Notch1-JAG1信號(hào)通路，減輕BA模型小鼠氣道炎癥及氣道重塑[35]。因此，對(duì)于以氣道重塑為核心的難治性哮喘，選擇Notch信號(hào)通路抑制劑可能是一種新的治療策略[36]。另外，Notch蛋白表達(dá)量與哮喘患者糖皮質(zhì)激素治療效果呈負(fù)相關(guān)，聯(lián)合監(jiān)測(cè)Notch1、Notch3表達(dá)水平有助于指導(dǎo)糖皮質(zhì)激素藥物的應(yīng)用[37]。

3.3 慢性阻塞性肺病

COPD模型小鼠存在T細(xì)胞亞群失衡，以Th1、Th17等促炎細(xì)胞增多為主；同時(shí)Notch1蛋白及其下游Hes1 mRNA水平升高，且與T細(xì)胞亞群失衡相關(guān)[38]，表明Notch1信號(hào)通路與COPD關(guān)系密切。GSI部分阻斷Notch1-Hes1通路可抑制Th1、Th17細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞平衡[39]。2型固有淋巴細(xì)胞可通過(guò)Notch-Gata3信號(hào)通路促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，這可能是COPD急性加重的機(jī)制之一[40]。鼻病毒通過(guò)Notch3引起COPD小鼠持續(xù)性氣道杯狀細(xì)胞增生，阻斷Notch3可下調(diào)黏蛋白基因表達(dá)，減輕鼻病毒引起的杯狀細(xì)胞增生和分泌[41]。治療方面，研究表明補(bǔ)肺益腎方通過(guò)上調(diào)微小RNA34a表達(dá)、下調(diào)Notch3及Hes1蛋白表達(dá)，可抑制COPD大鼠氣道黏液分泌，改善COPD大鼠炎癥反應(yīng)及免疫功能失衡[42-43]。和厚樸酚通過(guò)抑制COPD小鼠脾T細(xì)胞Notch信號(hào)通路的激活，糾正了COPD小鼠Th1/Th2和Th17/Treg細(xì)胞的失衡，從而使肺功能得以改善[44]。

3.4 其他氣道炎癥性疾病

Notch信號(hào)通路在伴有息肉的慢性鼻竇炎、毛細(xì)支氣管炎、支原體肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎及肺纖維化等疾病中均發(fā)揮重要作用。慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻黏膜上皮中Notch1/JAG1蛋白、IL-33表達(dá)增加，Notch1/JAG1通路激活可能抑制嗜酸性慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者Treg細(xì)胞功能，導(dǎo)致Th2型炎性反應(yīng)和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加重[45-46]。通過(guò)毛細(xì)支氣管炎模型大鼠研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射GSI能夠阻斷Notch信號(hào)通路，并抑制其氣道炎癥反應(yīng)[47]；臨床研究表明GSI可降低呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞Gata3水平[48]；黃芩苷可能通過(guò)Notch通路糾正Th17/Treg失衡來(lái)發(fā)揮對(duì)細(xì)支氣管炎的治療作用[49]，說(shuō)明阻斷Notch信號(hào)通路可能對(duì)毛細(xì)支氣管炎有潛在的治療價(jià)值。支原體肺炎患兒Th17/Treg細(xì)胞比例失衡，肺功能下降，Notch信號(hào)通路表達(dá)增高，而后者可能干預(yù)Th17/Treg細(xì)胞分化，使Th17細(xì)胞因子IL-17等水平升高，參與支原體肺炎發(fā)生和進(jìn)展[50]。中藥清肺透邪方可以減輕肺炎支原體肺炎模型小鼠肺組織炎癥，其機(jī)制可能與抑制肺組織Notch通路中Notch受體的表達(dá)有關(guān)[51]。姜黃素能夠減輕膿毒癥急性肺損傷大鼠的炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能與Notch2/Hes-1通路相關(guān)[42]。呼吸道合胞病毒感染人肺上皮細(xì)胞后，通過(guò)Notch1/Hes1信號(hào)通路促進(jìn)IL-25的釋放，并上調(diào)黏蛋白MUC5AC(mucin 5AC)表達(dá)，導(dǎo)致氣道黏液高分泌，而姜黃素衍生物對(duì)此具有抑制效應(yīng)[53]。養(yǎng)陰清肺方可顯著下調(diào)放射性肺炎大鼠Notch1及JAG1蛋白表達(dá)，可能是其防治放射性肺炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一[54]。吳茱萸次堿可能通過(guò)抑制Notch1/eIF3a(eukaryotic translation initiation factor 3a)信號(hào)通路，減緩肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，從而緩解博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[55]。

4 總結(jié)與展望

Notch信號(hào)通路是T細(xì)胞重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，廣泛參與調(diào)控T細(xì)胞的分化、活化及免疫功能。Notch信號(hào)通過(guò)糾正Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞失衡、上調(diào)細(xì)胞炎癥因子和黏蛋白表達(dá)、促進(jìn)氣道組織重塑等方式，影響變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病等多種氣道炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展，阻斷Notch信號(hào)或下調(diào)Notch蛋白表達(dá)可改善氣道炎癥狀態(tài)和免疫功能紊亂。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步研究Notch信號(hào)通路作用于T細(xì)胞的途徑和靶點(diǎn)，探究Notch信號(hào)通路對(duì)氣道炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制，制定氣道炎癥性疾病治療和預(yù)防的新策略。