枸杞多糖提取分離技術(shù)的研究進(jìn)展*

李俊杰，雷 婷

(1 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；2 云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室(培育)，云南 大理 671000)

枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)是從枸杞中提取得到的一種生物活性物質(zhì)，屬于一種淡黃色的纖維狀固體，可以添加到藥物中起到免疫調(diào)節(jié)或者延緩衰老、抗氧化等作用[1-2]。枸杞多糖具有增強(qiáng)免疫[3]、降低血糖、保護(hù)神經(jīng)、抗癌等多種藥理作用[4]。本文就近15年來有關(guān)枸杞多糖的提取工藝進(jìn)行歸納總結(jié)，以期加快對枸杞多糖的高效提取，以為枸杞多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 提取方法

1.1 水提法

1.1.1 熱水提法

水提法是目前我國枸杞多糖常用的提取方法之一，其提取過程簡單，但提取物質(zhì)亦偏低，其中影響產(chǎn)率的主要因素之一便是對溫度的把控[5]。因此，有研究學(xué)者通過響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化了熱水提法的提取工藝，確定了按照料液比在(1∶20)～(1∶30)的情況下，把溫度控制在55～75 ℃，浸提1.5～2.5 h，的情況下進(jìn)行浸提，經(jīng)過洗滌、抽濾、沉淀、干燥后稱重得枸杞多糖的提取率在0.475 g/g[6]。同時，另有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在熱水提法的方法下，把溫度控制在60 ℃，按照1∶20的料液比，酸堿度為8時，提取2 h，所得枸杞多糖的提取量影響顯著[7]。

1.1.2 堿液提取法

堿液提取法是通過正交試驗對傳統(tǒng)水提法優(yōu)化而形成的提取工藝，在多糖提取方面應(yīng)用較為廣泛[8]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在每次水浴前添加氨水調(diào)節(jié)pH值至10，在料液比按照1∶10，1∶20的條件下，把溫度控制在90 ℃，浸提1.5～2.5 h，之后經(jīng)過沉淀、抽濾、干燥的過程下，枸杞多糖得率為80.71%[9]。

1.2 酶提法

1.2.1 酶提法

酶提法是目前中藥提取中常用的一種生物工程技術(shù)，在提取過程中，以混合酶的提取效果最好，得率最高。但是，酶提法的提取成本較大，在提取過程中具有一定的限制性。因此，就如何高效的使用酶提法進(jìn)行提取，有研究學(xué)者通過在pH為5，添加混合酶的料液比在1∶20的情況下，把提取溫度調(diào)控在40 ℃，提取2 h，最終最高得率為6.73%[10]。另有學(xué)者通過使用果膠酶輔助提取青海海西黑枸杞多糖，并在料液比為1∶35的情況下，通過添加0.02 g的果膠酶量，把溫度控制在30 ℃的情況下酶解1 h，其最終的提取率為26.6%[11]。同時，酶可與超聲聯(lián)合，使提取率可進(jìn)一步提升[12]。

1.2.2 超濾輔助復(fù)合酶法

超濾輔助復(fù)合酶法是利用單因素和正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶法提取枸杞多糖的工藝，通過實驗，最終確定最佳復(fù)合酶法提取條件：復(fù)合酶(纖維素酶和木瓜蛋白酶)1∶1.5(g/g)、pH 4、料液比1∶30(g/mL)，提取溫度50 ℃。此條件下，多糖提取率為7.28%±0.12%。最佳超濾工藝條件為超濾時間60 min，枸杞多糖質(zhì)量濃度3 g/L，操作壓力0.25 MPa，此條件下所得多糖的3個級分分別占粗多糖含量的52.46%、29.25%和16.50%[13]。另有學(xué)者通過實驗得出超高壓輔助復(fù)合酶提取枸杞多糖的最優(yōu)的工藝參數(shù)組合為提取壓力200 MPa、提取溫度25.0 ℃、保壓時間5.6 min和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.3%，在此條件下枸杞多糖得率為6.58%±0.11%[14]。

1.3 水煮醇沉法

水煮醇沉法是大規(guī)模提取枸杞多糖的常用方法，但是該法中的影響因素較多，對提取率的影響較大。因此，水煮醇沉法對于枸杞原料的粉碎、酸堿度、溫度等方面具有一定的要求。有研究學(xué)者以寧夏枸杞為原料進(jìn)一步優(yōu)化了枸杞多糖的提取工藝，按照料液比為1∶3，溫度控制在90 ℃，pH值在11的情況下，通過液固萃取法浸提3 h，如此反復(fù)進(jìn)行2次，進(jìn)而合并提取液，最后按照3倍提取液體積9%乙醇進(jìn)行添加，沉淀6 h，最終提取率為18.6%[15]。

1.4 微波輔助提取法

除了上述的水提法、酶提法等常見的枸杞多糖提取方法外，近年來，枸杞多糖的提取技術(shù)日益完善，現(xiàn)代許多枸杞多糖的提取技術(shù)逐漸發(fā)展出新型的提取工藝。微波輔助提取法便是其中之一[16]。其原理所在便是通過使用高頻電磁波使細(xì)胞破裂，進(jìn)而使細(xì)胞中的有效成分快速析出，這體現(xiàn)了微波輔助提取法的快速高效的優(yōu)點[17]。有研究學(xué)者在微波輔助提取法的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化法對提取枸杞多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最終經(jīng)優(yōu)化后提取的枸杞多糖的提取率為10.14%[18]。在提取工藝中，有學(xué)者通過微波-超聲協(xié)同萃取法進(jìn)行提取，其工藝參數(shù)在超聲波功率為0 W的條件下，將溫度控制在70 ℃，把微波功率調(diào)至為300 W，料液比按照1∶40的比例，提取20 min，最終枸杞多糖的提取率為9.62%[19]。

1.5 超聲提取法

1.5.1 超聲提取法

目前，超聲提取法的技術(shù)已日益完善，其最早應(yīng)用超聲進(jìn)行提取植物的活性成分的資料可追溯到1952年。隨著超聲設(shè)備的完善與發(fā)展，超聲提取法已成為植物提取中不可或缺的方法之一[20]。陳亮等[21]采用該法，通過稱取、攪拌、離心、過濾等過程后進(jìn)行提取，該過程反復(fù)進(jìn)行兩次后獲得提取液。之后經(jīng)過濃縮、除蛋白的方法，加入乙醇后冷藏沉淀過夜，進(jìn)而經(jīng)過洗滌脫脂和干燥后得到枸杞多糖。楊新生等[22]在超聲波輔助提取法的最佳工藝條件下提取枸杞多糖，即在提取溫度為70 ℃的情況下，按照料液比1∶20，提取20 min，最終枸杞多糖的得率為3.3%。

1.5.2 超聲增強(qiáng)亞臨界水提取法

有研究學(xué)者通過試驗確定提取溫度100 ℃，提取時間53.2 min，液固比26.16 mL/g，超聲功率160 W，得到最大收率LBP為5.957%。為檢驗?zāi)Ｐ头匠痰倪m用性，學(xué)者選擇最佳條件在修改后的最佳條件下進(jìn)行3次：提取溫度100 ℃，提取時間53 min，液固比 26 mL/mg，超聲電功率160 W，平均實用值5.728%[23]。通過熱水(HWE 100 ℃)、超聲波水(UWE 30～40 ℃)、亞臨界水(SWE 110 ℃)、和超聲增強(qiáng)亞臨界水萃取(USWE 110 ℃)?？侺BP產(chǎn)率(萃取80 min，然后乙醇沉淀)在 USWE 中最高(14%，w/w)，在 HWE 中最低(7.6%)。USWE的LBP還顯示出最高的蛋白質(zhì)(27.9%)和酚含量(5.3%，w/w)，以及最高的抗氧化活性。它還在激活RAW264.7巨噬細(xì)胞的吞噬作用和 NO產(chǎn)生方面顯示出最高的免疫活性。最終，USWE被證明是提取LBP的最有效方法[24]。

1.5.3 多模式超聲輔助提取法

有研究學(xué)者采用超聲輔助提取技術(shù)對枸杞粗多糖的提取進(jìn)行了檢測。通過確定最佳提取條件，并將其應(yīng)用于三種提取模式，以發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝。最終，學(xué)者通過采用傳統(tǒng)單頻UAE模式，最佳提取時間為30 min，提取溫度為60 ℃，料液比為20 g/600 mL，功率密度為300 W/L和28 kHz的超聲波頻率。第二，使用先前獲得的最佳提取條件在三種阿聯(lián)酋模式之間進(jìn)行了比較。能量聚合逆流雙頻UAE模式的粗多糖收率最高，為38.93%。其次是對坐雙頻UAE模式和能量聚合逆流單頻UAE模式，粗多糖收率分別為33.60%和26.38%。因此，雙頻超聲輔助提取法對枸杞粗多糖的提取更為有效。此外，與傳統(tǒng)熱水提取相比，雙頻超聲提取粗多糖的得率提高了73.41%[25]。

1.6 高壓脈沖電場提取法

高壓脈沖電場技術(shù)是一種新興的非熱處理技術(shù)[26]，也是最先進(jìn)的殺菌技術(shù)，可用于提取殺菌等多種方面的應(yīng)用[27]。蔡光華等[28]通過使用該法對影響枸杞多糖的主要因素進(jìn)行分析，最終結(jié)果表明：脈沖頻率為1 020 Hz，溫度控制在61.76 ℃，及料液比按照9.43∶1的情況下，枸杞多糖提取率最高，其所得產(chǎn)率為13.26%。

1.7 高速剪切技術(shù)輔助法

高速剪切技術(shù)輔助法是一種新型均質(zhì)化技術(shù)[29]，在植物、動物等多種天然產(chǎn)物的提取、分離等方面應(yīng)用廣泛[30]。杜津昊等[31-32]應(yīng)用該法對枸杞多糖進(jìn)行提取，最終枸杞多糖的提取率可達(dá)20%以上。有學(xué)者通過對高速剪切技術(shù)輔助法進(jìn)行工藝優(yōu)化，最終枸杞多糖的提取率為27.86%，產(chǎn)品純度為37.64%。

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化法

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種實驗條件尋優(yōu)的方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)方法。有學(xué)者通過單因素實驗后，正交實驗確定淀粉酶酶解提取枸杞多糖的最佳條件為：pH=5.0，溫度50 ℃，時間80 min，加酶量為0.5%，枸杞多糖提取率12.1%；響應(yīng)面分析確定淀粉酶酶解提取枸杞多糖的最佳條件為酶解時間140 min、酶濃度0.3%，枸杞多糖提取率為13.25%[33]。另有學(xué)者以液料比、超聲時間、超聲溫度和超聲功率為考察因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞多糖的超聲輔助提取工藝。確定最佳提取工藝為：液料比20∶1(mL/g)、超聲時間40 min、超聲溫度60 ℃、超聲功率180 W，在此條件下，黑果枸杞多糖的提取率為9.19%[34]。響應(yīng)面法對優(yōu)化多糖提取工藝具有重要意義。有學(xué)者經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在提取時間為 5.5 h、提取溫度為 100 ℃、提取次數(shù)為5是生產(chǎn)枸杞多糖的最佳條件。多糖的最高收率可達(dá)23.13%[35]。在響應(yīng)面優(yōu)化法的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化酶的提取工藝，最終確定在纖維素濃度為2.0%和木瓜蛋白酶濃度為1.0%。采用基于Box Behnken Design(BBD)的響應(yīng)面法(RSM)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，包括提取時間、提取溫度和 pH 值。最佳條件如下：提取時間91 min，提取溫度59.7 ℃和pH值5.0。在此條件下，實驗收率為6.81%±0.10%[36]。

2 結(jié) 語

枸杞作為一味名貴中藥材，其本身便具有解熱止咳、延緩衰老等功效。臨床可用于防治眼疾、內(nèi)科疾病等。LBP作為枸杞中的主要藥理活性成分，其藥理作用較為廣泛。其藥理作用不僅與枸杞的臨床應(yīng)用密切相關(guān)，而且也科學(xué)的體現(xiàn)了枸杞滋補(bǔ)肝腎、益精明目等傳統(tǒng)功效?，F(xiàn)階段情況下，關(guān)于多糖提取的技術(shù)日益完善，因此，在臨床應(yīng)用等方面對于枸杞多糖的要求也逐漸提高。但目前我國關(guān)于枸杞深加工的研究方面尚有欠缺，對于提取工藝等方面還有很大的研究空間。而且就當(dāng)前枸杞的應(yīng)用來看，枸杞的主要應(yīng)用仍多定位于保健方向，常做藥酒等方式的應(yīng)用。雖然可發(fā)揮一定枸杞的藥理作用，但就如何使其利益達(dá)到最大化，使枸杞中的有效成分得到充分地利用還需要我們進(jìn)行廣泛深入的研究下去。這也由此反映了目前在臨床的應(yīng)用中，關(guān)于枸杞多糖進(jìn)行應(yīng)用的相關(guān)研究也相對較少，這對于枸杞多糖與其他藥物的配伍使用或者枸杞多糖的臨床作用機(jī)理所反映的也不夠明確?？烧驗樯鲜鰡栴}中所顯現(xiàn)出來的，表明當(dāng)前我國關(guān)于枸杞多糖的研究雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種藥理作用，但是其研究機(jī)理等方面還只是處于初步階段，這對于接下來的枸杞開發(fā)與研究還具有巨大的潛力。因此，用何種思路和方法可以更好更有效的的提高枸杞多糖的提取率和純度并達(dá)到工業(yè)化最大的生產(chǎn)是我國目前可研究的一大方向，這對于接下來的藥理作用和臨床應(yīng)用具有重大的意義。