基于生物信息學(xué)分析醛縮酶B在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義▲

李定樺 連 芳 鄔國斌

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科,廣西南寧市 530021;2 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,廣西南寧市 530021)

肝細(xì)胞癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病隱匿、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。肝細(xì)胞癌極具侵襲性,在所有惡性腫瘤中其發(fā)病率和病死率分別位居第6位和第3位[1]。盡管近年來在肝細(xì)胞癌的診斷和治療方面的研究取得了較大進(jìn)展,但是肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后仍不理想,這可能是由于肝細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全清楚,個(gè)性化治療進(jìn)展困難[2]。目前肝細(xì)胞癌的早期診斷較為困難,傳統(tǒng)的血清學(xué)分子標(biāo)志物(如甲胎蛋白等)可用于診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌及評估肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后,但其靈敏度并不理想[3]。醛縮酶B是醛縮酶蛋白家族成員之一,又稱果糖-1,6-二磷酸酶B,通常在肝臟、腎臟和腸道細(xì)胞中表達(dá)[4]。醛縮酶B基因編碼醛縮酶B蛋白,該基因缺陷可導(dǎo)致遺傳性果糖不耐受[5]。醛縮酶B不僅參與糖酵解過程,而且在果糖的分解代謝途徑中也發(fā)揮重要的作用[6]。醛縮酶B的異常表達(dá)被認(rèn)為與某些疾病相關(guān),如醛縮酶B缺失會(huì)激活胰島素受體轉(zhuǎn)導(dǎo)促使肝細(xì)胞癌變[7];醛縮酶B高表達(dá)可引起DNA的堿基切除和錯(cuò)配修復(fù),從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[8];與醛縮酶B高表達(dá)的胃癌患者相比,醛縮酶B低表達(dá)的胃癌患者病理特征較差,生存時(shí)間顯著縮短[9]。此外,醛縮酶B還能與HBsAg結(jié)合,共同抑制肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡[10]。但關(guān)于醛縮酶B和肝細(xì)胞癌之間的關(guān)系和分子聯(lián)系研究仍相對較少,因此,深入探討兩者之間的分子機(jī)制等方面對于肝細(xì)胞癌的診療具有重要意義。本研究通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫、人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(Human Protein Atlas,HPA)數(shù)據(jù)庫等分析醛縮酶B在肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中的差異表達(dá)情況,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討醛縮酶B與肝細(xì)胞癌患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 醛縮酶B mRNA和蛋白在肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá) (1)從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)下載374例肝細(xì)胞癌組織和50例正常肝臟組織的RNA測序數(shù)據(jù),以及對應(yīng)的377例肝細(xì)胞癌患者的臨床資料。將RNA測序數(shù)據(jù)由FPKM格式轉(zhuǎn)換成TPM格式,并進(jìn)行對數(shù)(以2為底數(shù))轉(zhuǎn)化。采用R軟件(版本號:3.6.3)進(jìn)行非在線數(shù)據(jù)分析與可視化處理,分析醛縮酶B mRNA在肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)情況,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)采用HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)檢索肝細(xì)胞癌組織與正常肝臟組織的醛縮酶B蛋白免疫組化檢測結(jié)果圖片,分析醛縮酶B蛋白在肝細(xì)胞癌組織與正常肝臟組織中的表達(dá)情況。

1.2 生物信息學(xué)分析 利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)檢索與醛縮酶B具有直接相互作用的蛋白,并按SCORE值由大到小進(jìn)行排序,選取排名前10的蛋白,進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析及可視化處理。利用基因本體論(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)對編碼上述蛋白的基因進(jìn)行GO功能富集分析,包括生物過程、細(xì)胞組分、分子功能。利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)對編碼上述蛋白的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。以|log2FC|>2并且P值<0.05為篩選條件,利用R 3.6.3軟件進(jìn)行可視化處理按校正后P值由大到小排序。

1.3 醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 使用R軟件的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析醛縮酶B mRNA的表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征(性別、年齡、TMN分期、病理學(xué)分期、組織學(xué)分級和血清甲胎蛋白含量)的相關(guān)性。

1.4 醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性 根據(jù)醛縮酶B mRNA表達(dá)量的中位數(shù)將肝細(xì)胞癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,采用Kaplan-Meier法制作生存曲線,使用log-rank檢驗(yàn)比較兩組患者的生存期;將醛縮酶B mRNA表達(dá)量和患者臨床特征納入COX回歸模型,分析肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響因素,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 醛縮酶B mRNA診斷肝細(xì)胞癌的臨床價(jià)值 使用R軟件繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,分析醛縮酶B mRNA表達(dá)量預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的效能,曲線下面積(area under the curve,AUC)>0.5且≤0.7時(shí)具有較低準(zhǔn)確性,AUC>0.7且≤0.9時(shí)具有一定的準(zhǔn)確性,AUC>0.9時(shí)具有較高的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中醛縮酶B mRNA表達(dá)量的比較 肝細(xì)胞癌組織中醛縮酶B mRNA表達(dá)量低于正常肝臟組織(P<0.05),見圖1。

圖1 肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中醛縮酶B mRNA的表達(dá)量

2.2 肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中醛縮酶B蛋白表達(dá)情況的比較 在使用同一種抗體(HPA002198)檢測的條件下,醛縮酶B蛋白在肝細(xì)胞癌組織中表現(xiàn)為小面積淺棕色,呈弱陽性表達(dá),而在正常肝臟組織中表現(xiàn)為大面積深棕色,呈強(qiáng)陽性表達(dá),說明肝細(xì)胞癌組織中醛縮酶B蛋白表達(dá)量低于正常組織。見圖2。

圖2 肝細(xì)胞癌組織(左)和正常肝臟組織(右)中醛縮酶B蛋白的表達(dá)情況

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果 PPI分析結(jié)果顯示,醛縮酶B與二羥基丙酮激酶、果糖1,6-二磷酸酶1、果糖1,6-二磷酸酶2等10個(gè)蛋白直接相互作用,見圖3。GO功能富集分析結(jié)果顯示,編碼上述蛋白的基因功能富集在葡萄糖代謝等方面,其中,生物過程以單糖代謝過程、己糖代謝過程、果糖1,6-二磷酸代謝過程為主,細(xì)胞組分以轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物-轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)為主,分子功能以單糖結(jié)合、碳水化合物激酶活性、單磷酸腺苷結(jié)合為主;KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,這些基因所參與的信號通路主要富集在糖酵解/糖異生、碳代謝、果糖和甘露糖代謝等方面,見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 GO/KEGG富集分析氣泡圖

2.4 醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 不同TNM分期、病理學(xué)分期、組織學(xué)分級、血清甲胎蛋白含量的肝細(xì)胞癌患者之間,醛縮酶B mRNA表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),而不同性別、年齡的肝細(xì)胞癌患者之間,醛縮酶B mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖5。

圖5 醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的相關(guān)性

2.5 醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性 低表達(dá)組及高表達(dá)組的中位生存期分別為44.984個(gè)月和69.869個(gè)月,低表達(dá)組肝細(xì)胞癌患者的中位生存期短于高表達(dá)組(χ2=2.525,P=0.008),見圖6。COX回歸分析結(jié)果顯示,醛縮酶B mRNA表達(dá)量是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表1、表2。

圖6 生存曲線

表1 變量賦值表

表2 肝細(xì)胞癌患者預(yù)后影響因素的COX回歸分析結(jié)果

2.6 醛縮酶B mRNA表達(dá)量預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示,醛縮酶B mRNA表達(dá)量預(yù)測肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的AUC為0.818(95%CI:0.776,0.859),特異度為88.0%,靈敏度為73.3%,具有一定的準(zhǔn)確性。見圖7。

圖7 ROC曲線

3 討 論

近年來,生物新陳代謝及代謝組學(xué)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容,越來越多的學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞和個(gè)體的新陳代謝可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生與發(fā)展[11]。糖酵解普遍存在于生物體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)[12]。研究表明,腫瘤組織中糖酵解導(dǎo)致乳酸分泌增加,進(jìn)而使局部微環(huán)境pH降低,而低pH環(huán)境會(huì)使基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9及組織蛋白酶B等表達(dá)上調(diào),從而利于腫瘤轉(zhuǎn)移[13-14]。代謝重編程被認(rèn)為是惡性腫瘤的重要標(biāo)志[15]。有研究表明,醛縮酶B可直接與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶結(jié)合并抑制其活性,調(diào)節(jié)葡萄糖代謝及代謝重編程,從而在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑制腫瘤的作用;而醛縮酶B的缺失可通過上調(diào)糖酵解、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán),產(chǎn)生一種新的代謝重編程,促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展[16-17]。

本研究結(jié)果顯示,醛縮酶B 蛋白和mRNA在肝細(xì)胞癌組織中均呈低表達(dá),且在不同TNM分期、病理學(xué)分期、組織學(xué)分級、血清甲胎蛋白含量的肝細(xì)胞癌患者中,醛縮酶B mRNA表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);生存曲線結(jié)果顯示,醛縮酶B mRNA低表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者的中位生存期短于高表達(dá)者(P<0.05),且COX回歸分析結(jié)果顯示醛縮酶B mRNA表達(dá)量是肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05),這與既往研究結(jié)果[18-19]相似。上述結(jié)果說明醛縮酶B與肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特征和預(yù)后相關(guān),提示醛縮酶B mRNA表達(dá)水平越低,腫瘤的惡性程度越高,患者預(yù)后越差。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,與醛縮酶B直接相互作用的蛋白參與的生物過程以單糖代謝過程、己糖代謝過程、果糖1,6-二磷酸代謝過程為主,細(xì)胞組分以轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物-轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)為主,分子功能以單糖結(jié)合、碳水化合物激酶活性、單磷酸腺苷結(jié)合為主,參與的信號通路主要富集在糖酵解/糖異生、碳代謝、果糖和甘露糖代謝等方面。目前有關(guān)醛縮酶B和肝細(xì)胞癌之間的作用機(jī)制研究仍然較少,上述的生物過程、信號通路等有可能是探索兩者關(guān)系的突破口,也可能成為肝細(xì)胞癌的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述,醛縮酶B蛋白及mRNA在肝細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá),醛縮酶B mRNA表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān),醛縮酶B mRNA低表達(dá)者的腫瘤惡性程度更高,預(yù)后更差,其有可能成為診斷肝細(xì)胞癌及判斷患者預(yù)后的新型分子標(biāo)志物。但本研究只進(jìn)行了描述性分析,今后仍需進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討醛縮酶B在肝細(xì)胞癌中的分子作用機(jī)制。