基于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路和炎癥反應探討通絡益腎溫陽方對糖尿病腎病大鼠的干預機制▲

王 月 梅 慧

(湖北文理學院附屬醫(yī)院,襄陽市中心醫(yī)院中醫(yī)科,湖北省襄陽市 441021)

糖尿病腎病是一種以腎微血管病變?yōu)橹饕攸c,以蛋白尿、水腫為主要臨床表現(xiàn)的糖尿病常見并發(fā)癥。約有20%的糖尿病患者會并發(fā)糖尿病腎病,疾病晚期可出現(xiàn)腎衰竭[1]。糖尿病腎病發(fā)病機制復雜,目前認為,大量糖基化終末產(chǎn)物堆積于腎小球是糖尿病腎病發(fā)生的關鍵,且炎性因子及組織纖維化等因素均參與發(fā)病,控制纖維化進程可有效延緩病情進展[2]。糖尿病腎病是由多種炎癥介質和炎癥反應共同參與的慢性炎癥性疾病[3],Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路的活化可以促使腎間質發(fā)生纖維化和腎小球系膜細胞迅速擴增[4],因此,抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效改善糖尿病腎病導致的足細胞損傷。中醫(yī)認為,糖尿病腎病是各種病邪傷及腎臟所致,以脾腎陽虛型多見[5]。通絡益腎溫陽方具有益氣生津、祛濁解毒、化瘀通絡的功效,治療糖尿病腎病有獨特優(yōu)勢[6]。本研究基于Wnt/β-catenin信號通路和炎癥探討通絡益腎溫陽方通過對糖尿病腎病大鼠的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級無特定病原體級SD雄性大鼠60只,鼠齡8周,體質量(200±20) g,購自湖北省武漢市新洲區(qū)萬千佳禾實驗動物養(yǎng)殖場[實驗動物許可證號SYXK(鄂)2019-0003]。將所有大鼠置于自然光照、室溫、55%濕度的環(huán)境適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.1.2 實驗試劑:通絡益腎溫陽方由炙黃芪30 g、熟地黃30 g、山茱萸15 g、山藥15 g、澤瀉12 g、茯苓12 g、桃仁12 g、酒大黃10 g、水蛭3 g組成,藥物經(jīng)常規(guī)煎煮過濾,濃縮至每毫升含生藥1.438 g,置于4 ℃冰箱備用。試劑包括鏈脲佐菌素(Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司,批號:S1030),血清肌酐測定試劑盒(碧云天生物科技有限公司,批號:C0105),血清尿素氮測定試劑盒(Affinity公司,批號:df7502),腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 、轉化生長因子β1 (transforming growth factor β1, TGF-β1)ELISA試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,批號:262305、CSB-E04725h),TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,批號:20181109),反轉錄試劑盒(上海近岸科技有限公司,批號:E047)。

1.1.3 儀器:OneTouch Ⅱ 型血糖儀及配套試紙(Bio-Rad公司),RM 2135型輪轉型切片機(上海徠卡儀器有限公司),AU5821型全自動生化分析儀(Beckman Coulter Life Science公司),BX53型光學顯微鏡(OLYMPUS公司),BV-2型垂直電泳儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組:將60只大鼠隨機分為對照組、模型組和觀察組,每組20只。取模型組和觀察組大鼠,在禁食12 h后單次腹腔注射大劑量(55 mg/kg)鏈脲佐菌素建立糖尿病腎病模型,72 h后檢測空腹血糖及尿蛋白,空腹血糖>16.7 mmol/L且24 h尿蛋白>30 mg則判定為建模成功(40只大鼠均造模成功)。觀察組建模成功后第2天給予通絡益腎溫陽方灌胃10 mL/(kg·d),分早晚2次服完;對照組和模型組則給予0.9%生理鹽水灌胃,用法用量同觀察組。3組均干預4周。

1.2.2 血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白的檢測:干預4周后,抽取大鼠空腹尾靜脈血4 mL,分成兩份。取其中一份血液樣本,離心(3 000 r/min,5 min,離心半徑15 cm)后取上清液,采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮、肌酐水平;取另一份血液樣本,采用OneTouch Ⅱ 型血糖儀及配套試紙檢測空腹血糖水平。收集24 h尿液,充分混勻,取5 mL尿液,離心(1 500 r/min,5 min,離心半徑10 cm)后取上清液,ELISA測定24 h尿蛋白水平。

1.2.3 血清炎癥因子的檢測:干預4周后,抽取大鼠空腹尾靜脈血2 mL,離心(2 000 r/min,15 min,離心半徑18 cm)后取上清液,采用ELISA檢測血清TNF-α、TGF-β1水平。

1.2.4 體重及腎重的測量:干預4周后,用電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司,型號:A2013)稱量大鼠體重。然后采用頸椎脫臼法處死大鼠,摘取大鼠右側腎臟,去包膜,電子天平稱量右腎重量。

1.2.5 腎組織Wnt4、β-catenin的mRNA表達水平檢測:取適量腎組織進行研磨,采用TRIzol法提取總RNA,使用分光光度計檢測RNA純度及濃度,將RNA反轉錄合成cDNA后進行PCR擴增。Wnt4上游引物序列為5′-GAGAAGCGGGAGTCTGAAAGG-3′,下游引物序列為 5′-GTCACAGGTGTAACGGTAGGTAATG-3′;β-catenin上游引物序列為 5′-GGTCAGCTGCTGTCTCACAT-3′,下游引物序列為 5′-CCCATGTCTCCAAGG GCATT-3′;β-actin(內參)上游引物序列為 5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3′,下游引物序列為 5′-AGGGTCAGGATGCCTCTCTT-3′。反應體系包括cDNA 2 μL、2×Taq Plus MasterMix 10 μL、QN ROX Reference Dye 0.1 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、去離子水補足至20.0 μL。反應條件為94 ℃預變性10 min,94 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸2 min(33個循環(huán)),72 ℃修復延伸7 min。采用2-ΔΔCt法計算Wnt4、β-catenin的mRNA相對表達水平。

1.2.6 腎組織Wnt4、β-catenin的蛋白表達水平的檢測:采用RIPA裂解液裂解大鼠腎組織,提取總蛋白,4 ℃下12 000 r/min離心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。將蛋白溶液按4 ∶1比例加入蛋白上樣緩沖液后100 ℃變性5 min。通過SDS-PAGE分離等量蛋白,將蛋白轉至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST洗膜2次,5 min/次,加入Wnt4(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)一抗(均購自Proteintech公司,批號:AB91226、00018600、10011066)各1 μL,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,5 min/次,加入0.9 μL辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h,ECL法顯色,使用 Image J軟件分析條帶灰度值,目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.2.7通絡益腎溫陽方主要活性成分的篩選:通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索通絡益腎溫陽方主要中藥(山茱萸、山藥、炙黃芪、熟地黃)的活性成分,將口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出主要活性成分。

1.2.8通絡益腎溫陽方中關鍵活性成分與β-catenin的分子對接分析:選取β-catenin作為受體,山茱萸、山藥、炙黃芪、熟地黃主要活性成分中OB最大的成分(關鍵活性成分)作為配體,進行分析對接分析。從UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)下載β-catenin的晶體結構,序列號為1LUJ,分辨率為2.50?,運用YASARA分子模擬軟件去水、加氫質子化和添加缺失原子。在 Cytoscape 3.8.0(https://cytoscape.org/)中使用CytoNCA插件對山茱萸、山藥、炙黃芪、熟地黃的關鍵活性成分進行分析。最后運用PyMOL、AutoDock Vina等軟件對受體和配體進行分子對接,測定結合能。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠體重、腎重的比較 模型組和觀察組大鼠體重均輕于對照組,腎臟均重于對照組(均P<0.05);觀察組大鼠體重重于模型組,腎臟輕于模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠體重、腎重的比較(x±s,g)

2.2 3組大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平的比較 模型組和觀察組大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均高于對照組(均P<0.05);觀察組大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均低于模型組(均P<0.05),見表2。

表2 3組大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平的比較(x±s)

2.3 3組大鼠血清炎癥因子水平的比較 模型組和觀察組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平均高于對照組(均P<0.05);觀察組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平均低于模型組(均P<0.05),見表3。

表3 3組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平的比較(x±s)

2.4 3組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin的mRNA表達水平的比較 模型組和觀察組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin的mRNA表達水平均高于對照組(均P<0.05);觀察組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin的mRNA表達水平均低于模型組(均P<0.05)。見表4。

表4 3組大鼠Wnt4、β-catenin的mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.5 3組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin的蛋白表達水平的比較 模型組和觀察組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin蛋白表達水平均高于對照組(均P<0.05);觀察組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin蛋白表達水平均低于模型組(均P<0.05)。見表5和圖1。

表5 3組大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖1 3組大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白表達水平的比較

2.6 通絡益腎溫陽方活性成分的篩選結果 山茱萸的主要活性成分共20個,山藥的主要活性成分共16個,炙黃芪的主要活性成分共15個,熟地黃的主要活性成分共2個,見表6。

表6 通絡益腎溫陽方主要活性成分的篩選結果

2.7 分子對接的分析結果 選取山茱萸中的遠華蟾蜍精、山藥中的薯蕷皂苷元、炙黃芪中的異黃烷酮、熟地黃中的豆甾醇作為配體。測定上述成分作用于β-catenin的結合能,結果分別為-5.28、-6.40、-5.67、-5.33。見圖2和圖3。

圖2 通絡益腎溫陽方4個主要活性成分與β-catenin的分子對接2D圖

圖3 通絡益腎溫陽方4個主要活性成分與β-catenin的分子對接3D圖

3 討 論

持續(xù)蛋白尿、炎癥因子水平升高、糖脂代謝紊亂及腎功能下降是糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)[7-8]。蛋白尿的主要病理機制是腎皮質發(fā)生過氧化應激,致使腎小球濾過屏障足細胞受損、基底膜裸露[9-10]。糖尿病腎病的發(fā)病機制至今還未完全闡明,但近30年以來,糖尿病腎病發(fā)生機制的相關研究已取得較大進展[11]。糖尿病腎病的誘發(fā)因素較多,各個因素之間往往存在協(xié)同或者交互作用[12-13]。其中炎癥因子水平升高是糖尿病腎病的典型表現(xiàn),而Wnt/β-catenin信號通路異?；罨彩悄I臟疾病的發(fā)病機制之一[14-15]。為此本研究以二者作為主要觀察指標,探討通絡益腎溫陽方對糖尿病腎病的作用機制。

本研究結果顯示,模型組和觀察組大鼠體重輕于對照組,腎臟重于對照組,而觀察組大鼠體重均重于模型組,腎臟均輕于模型組(均P<0.05)。說明糖尿病腎病大鼠的體重下降,腎臟增大、重量增加,而通絡益腎溫陽方可以改善糖尿病腎病大鼠的體重和腎重。本研究結果顯示,模型組和觀察組大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均高于對照組,而觀察組大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均低于模型組(均P<0.05)。說明通絡益腎溫陽方能夠改善糖尿病腎病大鼠的腎功能、血糖水平,有助于緩解蛋白尿。在糖尿病腎病的發(fā)展過程中,TNF-α、TGF-β1等炎癥因子表達過高會加重腎組織損傷[14]。本研究結果顯示,模型組和觀察組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平高于對照組,而觀察組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平低于模型組(均P<0.05)。說明糖尿病腎病大鼠體內的炎癥因子水平升高,而通絡益腎溫陽方具有降低糖尿病腎病大鼠體內炎癥因子水平的作用。

糖尿病腎病纖維化的進展與Wnt和β-catenin蛋白水平升高密切相關[15]。Wnt/β-catenin信號通路異?；罨瘯е履I臟固有細胞凋亡,造成腎臟組織不可逆性損傷[16]。在高糖環(huán)境中Wnt/β-catenin信號通路被激活,導致腎損傷[17]。本研究結果顯示,模型組和觀察組大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白及mRNA表達水平均高于對照組,而觀察組Wnt4、β-catenin的蛋白及mRNA表達水平均低于模型組(均P<0.05)。由此推測通絡益腎溫陽方可以通過降低Wnt4、β-catenin的表達水平,改善由Wnt/β-catenin信號通路激活引起的腎損傷。

糖尿病腎病的原發(fā)病是糖尿病,而糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴病”范疇。消渴病是一種慢性遷延性疾患,發(fā)病初期以陰虛燥熱為基本病機。消渴遷延多年,久病發(fā)腎,久病入絡,本虛標實、腎虛絡瘀是糖尿病腎病的病機特點。本虛是指氣陰兩虛,陰損及陽,陰陽兩虛,標實則是在正虛的前提下,血瘀絡阻、水飲濕濁等毒邪蘊蓄。通絡益腎溫陽方(自擬方)是治療糖尿病腎病的方劑,該方中炙黃芪味甘性溫,補氣升陽,生津止渴,其提取物黃酮類化合物是天然抗氧化劑,能夠抑制脂質過氧化,并可以調節(jié)血糖,為君藥。山茱萸主入肝、腎經(jīng),滋養(yǎng)肝腎以充養(yǎng)先天,山藥性平味甘,功能健脾補肺、益腎固精,熟地黃性涼、味苦酸,有養(yǎng)陰潤燥生津功效,三藥協(xié)同,共為臣藥,不僅健脾益腎之力顯著,而且化瘀通絡之效顯增,是治療本虛標實證之核心。通絡益腎溫陽方以腎氣丸合抵當湯去虻蟲,加黃芪而成,全方扶正祛邪,消補兼施,具有溫陽滋陰、活血通絡、益腎泄?jié)嶂?適用于腎虧陰陽兩虛、偏于陽虛兼瘀血阻絡的糖尿病腎病患者[18]。本研究篩選出有炙黃芪的異黃烷酮、山茱萸的遠華蟾蜍精、熟地黃的豆甾醇、山藥的薯蕷皂苷元作為配體進行分子對接分析。研究顯示,炙黃芪的主要活性成分異黃烷酮在糖尿病腎病大鼠模型中具有改善腎臟高灌注、延緩腎臟病發(fā)生、防止蛋白尿的作用[19]。山茱萸中的遠華蟾蜍精對正常大鼠的血糖沒有影響,但是能降低糖尿病腎病大鼠的血糖水平和尿蛋白水平[20]。山藥中的薯蕷皂苷元能夠減緩糖尿病腎病大鼠的腎衰竭,降低其血糖及血脂水平,熟地黃中的豆甾醇具有降低糖尿病腎病大鼠的炎性因子、血糖和尿蛋白水平,以及改善腎臟纖維化和足細胞損傷的作用[21]。上述主要活性成分與靶點β-catenin的結合能為負數(shù),說明其結合過程能自發(fā)進行;結合能的絕對值較大,表明結合后的親和作用較強且構象穩(wěn)定。這進一步提示通絡益腎溫陽方可能通過這些主要活性成分作用于Wnt/β-catenin通路而發(fā)揮治療作用。

綜上所述,通絡益腎溫陽方可有效改善糖尿病腎病大鼠的腎功能,其可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路及炎癥反應,從而減輕腎損傷。