西格列汀通過降低腦內(nèi)炎性因子水平改善糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

韓麗男，周 游，陳 旭，李佳男

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（The International Diabetes Federation，IDF）2021全球糖尿病地圖（第10版）最新數(shù)據(jù)顯示，2021年全世界有5.37億糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者；到2030年，DM患者預(yù)計會達到6.43億；到2045年將上升到7.83億[1]，成為繼心血管疾病和惡性腫瘤后的第三大世界公共衛(wèi)生問題[2]。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是較常見的一種DM類型，占DM總數(shù)的95 %以上[3]。T2DM患者的典型特征為高血糖，持續(xù)的高血糖狀態(tài)會引起機體炎癥反應(yīng)，其中神經(jīng)炎癥可損壞腦功能的完整性，導(dǎo)致認知功能下降[4]。腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin，IL-6）、IL-1β等在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要作用[5]。

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）抑制劑是口服治療DM藥物，以葡萄糖依賴的方式進行血糖調(diào)節(jié)[6]。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量（80 mg/kg）STZ建立T2DM小鼠模型，探討DPP-4抑制劑磷酸西格列汀對T2DM小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZZ-611800自主活動儀（成都泰盟科技有限公司）；WMT-100Morris分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；TDL-60B低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RT-6000酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.2 試藥

磷酸西格列汀片（杭州默沙東制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；GSP、TC、TG、LDL-C、HDL-C測試盒（南京建成生物工程研究所）；INS、C-P、IL-6、TNF-α、IL-1β試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 動物

SPF級健康雄性ICR小鼠45只，體重（20±2）g（長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司），實驗動物許可證號：SCXK（吉）-2020-0002。符合國家實驗室動物倫理保護標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法律規(guī)定。實驗期間動物自由采食飲水。

2 方法

2.1 模型制備、動物分組及給藥

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按體重隨機抽取15只小鼠作為空白對照組，其余小鼠高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，禁食不禁水14 h，腹腔注射STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（80 mg/kg），空白組小鼠注射等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 w后尾靜脈采血測定小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），并以FBG＞11.1 mmol/L視為模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)。

將模型復(fù)制成功的小鼠分為模型組、西格列汀組。西格列汀組動物灌胃給藥16.32 mg/(kg·d)，模型組和正常對照組每天灌胃等體積純凈水，連續(xù)灌胃56 d。

2.2 體質(zhì)量及空腹血糖的測定

分別于給藥的0，2，4，6，8 w測量一次體質(zhì)量及FBG。

2.3 自主活動、水迷宮、熱Y迷宮評價小鼠的活躍程度及學(xué)習(xí)記憶能力

分別于給藥2，4，6，8 w進行自主活動，將小鼠放入自主活動儀適應(yīng)后，記錄5 min內(nèi)小鼠的活動數(shù)及站立數(shù)。給藥第8 w進行水迷宮及熱Y迷宮實驗。Morris水迷宮記錄120 s內(nèi)找到平臺的時間，即逃避潛伏期；熱Y迷宮每臂底部及交界處均鋪設(shè)電熱板，頂部裝有信號燈，開始實驗時，小鼠適應(yīng)20 s后，隨機選擇一臂亮燈不通熱，其余兩臂不亮燈通熱（60～80 ℃），小鼠從起始臂進入，受到熱刺激后到達亮燈區(qū)停留5 s即為一次訓(xùn)練，每只小鼠重復(fù)訓(xùn)練直至達標(biāo)（以連續(xù)20次訓(xùn)練中≥18次正確為達標(biāo)），最后記錄30次實驗內(nèi)的錯誤次數(shù)。綜合以上3種方法評價小鼠的活躍程度及學(xué)習(xí)記憶能力。

2.4 樣本采集

所有小鼠禁食不禁水14 h，眼底靜脈叢取血，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存。取血完畢后，剝離腦組織，-80 ℃冰箱中保存。進行HE染色的小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，先用生理鹽水、后用多聚甲醛進行心臟灌流，分離小鼠腦組織于多聚甲醛溶液中保存。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 血糖血脂相關(guān)指標(biāo)檢測 取2.4項下凍存的血清，嚴(yán)格按試劑盒說明書測定C-P、FINS、GSP、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，按相應(yīng)公式計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），即HOMAIR=FBG×FINS/22.5。

2.5.2 腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 取2.4項下凍存的腦組織，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

2.5.3 HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài) 取2.4項下保存的腦組織，乙醇梯度脫水，二甲苯脫臘，置于蘇木精-伊紅中進行染色，熒光顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 西格列汀對T2DM小鼠體質(zhì)量的影響

與空白組比較，模型組體重顯著上升（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，西格列汀組體質(zhì)量有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；給藥第4 w西格列汀組體質(zhì)量下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示西格列汀對T2DM小鼠體重有一定的改善作用。見圖1。

圖1 西格列汀對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

3.2 西格列汀對T2DM小鼠FBG的影響

與空白組比較，模型組FBG 顯著上升（P＜0.01），表明模型建立成功；與模型組比較，西格列汀組FBG顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果顯示西格列汀對T2DM小鼠有顯著的降血糖作用。見圖2。

圖2 西格列汀對糖尿病小鼠FBG的影響

3.3 西格列汀對T2DM小鼠行為學(xué)的影響

與空白組相比，模型組自主活動活動數(shù)及站立數(shù)均低，第2，8 周與空白組差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明糖尿病使小鼠行為活躍程度下降；西格列汀組與模型組相比，自主活動活動數(shù)及站立數(shù)均有所升高，第8周與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明西格列汀能改善T2DM小鼠精神萎靡的狀態(tài)。見表1、表2。

表1 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動活動數(shù)的影響（±s）

表1 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動活動數(shù)的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組

組別 n 小鼠自主活動活動數(shù)2 w 4 w 6 w 8 w空白組 12 10.25±4.18 6.67±5.23 4.27±3.10 6.25±1.91模型組 10 4.00±1.94** 4.10±2.26 4.10±2.39 2.90±1.37**西格列汀組10 8.50±0.50 5.70±3.58 6.80±4.04 6.00±3.22#

表2 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動站立數(shù)的影響（±s）

表2 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動站立數(shù)的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；##P＜0.01 vs 模型組

組別 n 小鼠自主活動站立數(shù)2 w 4 w 6 w 8 w空白組 12 82.75±10.14 63.50±28.61 41.36±12.53 44.25±17.93模型組 10 56.44±19.00** 44.10±16.47 29.00±11.30* 21.50±9.80**西格列汀組10 74.75±15.40 46.70±32.47 44.80±25.77 45.20±20.70##

通過Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組的逃避潛伏期有延長趨勢，第1次、第7次及第11次測試與空白組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明T2DM小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)減退；西格列汀組與模型組相比，逃避潛伏期有縮短趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。與空白組比較，模型組測試期軌跡圖較復(fù)雜；與模型組比較，西格列汀組測試期軌跡清晰。見圖4。

圖3 西格列汀對糖尿病小鼠逃避潛伏期的影響

圖4 各組小鼠測試期定位航行軌跡圖

與空白組相比，模型組熱Y迷宮學(xué)習(xí)次數(shù)及錯誤次數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，西格列汀組學(xué)習(xí)次數(shù)及錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 西格列汀對糖尿病小鼠熱Y迷宮學(xué)習(xí)次數(shù)及錯誤次數(shù)的影響

Morris水迷宮和熱Y迷宮數(shù)據(jù)結(jié)果表明西格列汀能改善DM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

3.4 西格列汀對T2DM小鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組相比，模型組FINS、HOMA-IR、GSP水平及C-P水平顯著升高（P＜0.01），表明給予高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)后的T2DM小鼠血糖維持著較高水平，胰島素水平升高，出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗特征；與模型組相比，西格列汀組FINS、HOMA-IR、GSP水平及C-P水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），結(jié)果表明西格列汀對T2DM小鼠降糖效果較好，改善胰島素抵抗效果極佳。見表4。

表4 西格列汀對糖尿病小鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）

表4 西格列汀對糖尿病小鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組，##P＜0.01 vs 模型組

組別 n FINS/mIU·L-1 HOMA-IR GSP/mmol·L-1 C-P/ng·ml-1空白組 8 49.60±5.52 15.97±2.02 1.33±0.19 14.33±0.60模型組 8 83.30±5.35**64.88±34.33** 2.55±0.38** 19.38±0.56**西格列汀組8 65.84±5.72## 32.58±23.22# 1.63±0.43##1 7.16±1.98#

3.5 西格列汀對T2DM小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

與空白組相比，模型組TG、TC、LDL-C水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），而HDL-C水平顯著降低（P＜0.05），表明T2DM小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝發(fā)生紊亂；與模型組相比，西格列汀組TG、TC水平顯著降低（P＜0.05），同樣LDL-C水平也降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），說明西格列汀對T2DM小鼠脂質(zhì)代謝紊亂有較好的調(diào)節(jié)作用。見圖5A、B、C、D。

圖5 西格列汀對糖尿病小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響

3.6 西格列汀對T2DM小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響

與空白組相比，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，西格列汀組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P＜0.01）。西格列汀可顯著降低DM小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。見表5。

表5 西格列汀對糖尿病小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響（ ±s）

表5 西格列汀對糖尿病小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響（ ±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；##P＜0.01 vs 模型組

組別 n TNF-α/pg·L-1 IL-6/pg·L-1 IL-1β/pg·L-1空白組 7 2.81±0.30 198.82±31.46 475.61±40.79模型組 7 5.37±0.21** 320.75±16.60** 611.33±64.13**西格列汀組7 3.44±1.10## 216.84±34.12##502.31±41.40##

3.7 西格列汀對T2DM小鼠海馬CA1、DG區(qū)的影響

空白組小鼠海馬CA1、齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)細胞排列緊密，胞核清晰；模型組小鼠海馬CA1、DG區(qū)細胞排列松散；西格列汀組CA1、DG區(qū)細胞排列松散現(xiàn)象減輕。見圖6。

圖6 西格列汀對糖尿病小鼠海馬CA1、DG區(qū)的影響

4 討論

T2DM已經(jīng)成為威脅人類生命健康的全球性問題，T2DM患者中60 %～70 %會伴有輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）[7]，嚴(yán)重者可發(fā)展為癡呆。目前T2DM并發(fā)MCI的機制尚未完全闡明，可能與非病理因素如高齡、文化程度低、吸煙[8]，病理因素如T2DM病程長、高血糖、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗相關(guān)。近年炎癥因子在T2DM并發(fā)MCI機制探究中受到高度重視。

本實驗室前期采用高糖高脂飼料聯(lián)合不同劑量（80，90，100 mg/kg）的1%STZ進行T2DM模型的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)80 mg/kg和100 mg/kg劑量下成模率均高于90 mg/kg，且二者成模率相近，本著節(jié)約成本原則，最終采用80 mg/kg進行腹腔注射。正常機體各項指標(biāo)會維持在一個穩(wěn)定的水平，而T2DM小鼠糖脂代謝發(fā)生紊亂，當(dāng)給予西格列汀后，與模型組相比，TG、TC、LDL-C含量下降，HDL-C提升，F(xiàn)BG、FINS、HOMA-IR、GSP、C-P均有所不同程度的改善。

西格列汀作為第一個上市的DPP-4抑制劑[9]，通過抑制DPP-4活性，減少機體胰高糖素樣肽1（glucagon like peptide-1，GLP-1）分解，從而提高GLP-1水平，刺激胰島素分泌，達到降血糖的目的。該降糖作用具有葡萄糖依賴性，因此發(fā)生低血糖的風(fēng)險較低，安全性高，與實驗室前期使用的二甲雙胍相比，胃腸道不良反應(yīng)小，降低了在水迷宮實驗中小鼠因體力差異造成的實驗結(jié)果誤差。同時西格列汀還具有保護胰腺、肝臟、腎等器官及抗炎作用，GLP-1可抑制TNF-α等引起的炎性反應(yīng)[10]。血糖升高會誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活，激發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎因子分泌增加[11]，TNF-α、IL-6、IL-1β是關(guān)鍵的炎性因子。本實驗結(jié)果表明，與空白組相比較，模型組促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加。TNF-α、IL-6表達增加會破壞血腦屏障[12-13]，TNF-α還可通過增加神經(jīng)興奮性引起海馬缺血性損傷，IL-1β可損害神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[14]，這些炎性因子相互作用，產(chǎn)生聯(lián)級反應(yīng)，發(fā)生神經(jīng)炎癥，進一步導(dǎo)致認知受損。給予西格列汀藥物后DM小鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降顯著。

本實驗聯(lián)合3種行為學(xué)方法進行學(xué)習(xí)記憶能力的測試。自主活動可反應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，可清晰直觀地反映出T2DM鼠精神萎靡、不愛活動的特點；水迷宮是探究空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實驗，在精神科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[15]，該實驗方法記錄小鼠搜尋目標(biāo)的時間和運動軌跡，有助于探究其學(xué)習(xí)、記憶、空間定向及認知能力；熱Y迷宮實驗裝置由本實驗室自主設(shè)計[16]，熱Y迷宮與傳統(tǒng)的Y迷宮相比，給予熱刺激可增加小鼠的運動趨向性，比八臂迷宮更為簡單，實用性強。自主活動、水迷宮及熱刺激聯(lián)合Y迷宮3種方法聯(lián)合使用，可提高行為學(xué)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確度。模型組部分小鼠出現(xiàn)毛色無光澤、精神萎靡、自發(fā)活動減少的現(xiàn)象，給予西格列汀藥液后小鼠毛色及精神狀態(tài)有所改善。行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)異常；給予西格列汀的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，在熱刺激聯(lián)合Y迷宮實驗中小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的提高尤為明顯，這可能與西格列汀下調(diào)炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減輕小鼠腦部炎性損傷有關(guān)。

綜上，本實驗制備的T2DM小鼠模型表現(xiàn)出肥胖、高血糖、胰島素抵抗、行為學(xué)出現(xiàn)異常，提示復(fù)制的T2DM小鼠可作為探究T2DM小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的實驗?zāi)Ｐ?。西格列汀能有效改善T2DM小鼠的糖脂代謝水平，并可能通過降低腦組織炎性因子水平提高T2DM小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。