基于干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組信息的蠶豆ASPAT基因家族分析

魏正欣劉昌燕陳宏偉李 莉?qū)O龍清韓雪松焦春海,*沙愛華

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心, 湖北荊州 434025;2湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 / 糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室, 湖北武漢 430064

蠶豆(Vicia fabaL.), 屬于豆科、野豌豆屬, 又稱胡豆、羅漢豆、佛豆等, 是世界上第三大重要的冬季食用豆作物[1-2]。我國是世界第一蠶豆生產(chǎn)大國,其分布區(qū)域廣, 種質(zhì)資源極其豐富, 種植面積約占世界總種植面積近50%[3]。它具有高蛋白、低脂肪、富含淀粉的營養(yǎng)特征, 是蛋白質(zhì)、能量和纖維的良好來源, 被廣泛種植作為食物和飼料, 具有重要的營養(yǎng)價值和商業(yè)價值[4]。隨著環(huán)境條件不斷變化, 干旱已成為限制全球糧食生產(chǎn)的重要環(huán)境因素之一,干旱嚴(yán)重地限制了我國經(jīng)濟發(fā)展[5]。蠶豆各個生長階段都可能受到干旱脅迫的影響, 致使蠶豆產(chǎn)量降低[6-7]。盡管現(xiàn)今有一些關(guān)于蠶豆耐旱性研究, 如肖貴等[8]、李萍等[9]分別從栽培、蛋白組學(xué)方面研究蠶豆的耐旱機制, 但仍缺乏有效的手段提高蠶豆耐旱性。蠶豆由于其基因組巨大(～13 Gb), 且85%基因組富含重復(fù)序列, 導(dǎo)致很難通過基因組測序和圖位克隆的方法克隆相關(guān)耐旱基因, 應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種和基因工程育種。二代(NGS)和三代測序技術(shù)(single-molecule, real-time sequencing technology, SMRT)的發(fā)展, 使得通過二代結(jié)合三代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序獲得全基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參考基因組成為可能, 能夠很好的解決一些基因組較大且缺乏參考基因組的問題, 便于在這些物種中開展分子標(biāo)記和相關(guān)基因功能研究。在前期研究中, 我們利用蠶豆耐旱品種CDAS105和蠶豆干旱敏感品種鄂蠶豆1號, 應(yīng)用二代結(jié)合三代技術(shù)獲得了一個包含17,927個單一非冗余基因的轉(zhuǎn)錄參考基因組, 通過比較2個品種干旱脅迫和正常生長條件下的基因轉(zhuǎn)錄水平, 鑒定出大量的差異表達基因, 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transferase, ASPAT)便是其中的一類基因(DDBJ/ENA/GenBank, 登錄號為GISP00000000)。

ASPAT又名谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶, 屬于轉(zhuǎn)氨酶I類[10], 催化天冬氨酸(aspartate, ASP)的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸生成草酰乙酸和谷氨酸及其逆反應(yīng)的進行, 是合成天冬氨酸家族氨基酸的關(guān)鍵酶, 與糖酵解、氧化磷酸化等代謝途徑密切相關(guān), 是植物體代謝網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵一環(huán)[11-12]。在植物中, ASPAT以多種形式存在, 一種是真核型天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT), 另一種是原核型天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(PAT)。PAT不僅有ASPAT活性, 還有預(yù)苯酸轉(zhuǎn)氨酶活性, 主要定位于細胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體中[13]。ASPAT在植物代謝中起重要作用, 一方面是氨基酸代謝的核心酶, 在蛋白質(zhì)合成中生成ASP, 另一方面通過蘋果酸-天冬氨酸穿梭參與亞細胞結(jié)構(gòu)之間還原當(dāng)量的轉(zhuǎn)移[14]。

ASPAT不僅參與植物代謝, 還參與植物非生物脅迫響應(yīng)通路。在擬南芥中共鑒定出5個ASPAT基因家族成員, 由5種真核型AAT和1種原核型PAT組成[15], 細胞質(zhì)中的AtASPAT2在光照下參與合成天冬氨酸(aspartate, Asp),AtASPAT2突變導(dǎo)致植株生長遲緩[16];AtASPAT1和AtASPAT3在大多組織中具有較高表達[17], 且AtASPAT3在干旱、寒冷和高鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平增高[18]。在楊樹中, 鑒定出10個ASPAT成員, 該基因家族包含多個與激素、干旱、氧化等相關(guān)的順勢作用元件[19]。在水稻中, 灌漿期高溫下水稻(粳稻越光、秈稻IR72)籽粒中的AAT的活性較正常情況顯著提高[20], 且AAT的過量表達顯著提高了水稻中ASP的含量[21]。有研究認(rèn)為ASP是一種干旱脅迫特異性反應(yīng)代謝物, 干旱處理下, 鷹嘴豆耐旱品種葉片中ASP含量高于敏感品種[22-23]。在小麥科7種作物及不同器官中, 干旱脅迫下ASP含量顯著增加[24]。Ali等[25]也報道了天冬氨酸在非生物脅迫響應(yīng)中的重要作用, 在脅迫中含量增加。ASPAT是合成天冬氨酸的關(guān)鍵酶, 推測其可能參與干旱和其他非生物脅迫響應(yīng)。迄今, 在蠶豆中并未見ASPAT基因的相關(guān)報道。

本文基于已建立的蠶豆轉(zhuǎn)錄參考基因組和基因差異表達數(shù)據(jù), 從全基因組水平鑒定了蠶豆ASPAT基因家族成員, 開展了相關(guān)生物信息學(xué)分析, 明確了這些基因家族成員的理化特性和對干旱脅迫的響應(yīng), 為進一步研究蠶豆ASPAT的抗旱功能, 應(yīng)用ASPAT提高蠶豆抗旱性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蠶豆(Vicia fabaL.)種子干旱敏感品種鄂蠶豆1號是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育品種, 耐旱品種CDAS105為埃塞俄比亞引進品種。于2019年7月選取形態(tài)飽滿、大小一致的干旱敏感品種鄂蠶豆1號和耐旱品種CDAS105兩品種蠶豆種子進行發(fā)芽試驗, 并統(tǒng)計萌發(fā)率。用7.5%的甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑科技有限公司)處理, 每個處理3個重復(fù),分別取16 h和64 h帶有萌發(fā)蠶豆胚胎1/4部分的樣品, 置于液氮冷凍, 于-80℃冰箱保存。

1.2 蠶豆ASPAT基因家族成員篩選鑒定

以蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(DDBJ/ENA/GenBank, 登錄號為GISP01000000)為基礎(chǔ), 根據(jù)NR、Swiss-prot和COG數(shù)據(jù)庫中注釋為ASPAT基因,并用TBtools[26]提取相應(yīng)的蛋白序列后, 在NCBI中進行BLAST比對, 利用CDD對序列保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測, 去除非ASPAT基因編碼序列、重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本。

1.3 蠶豆ASPAT蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

將所得的8個ASPAT蛋白序列提交在線工具ExPASy-ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/), 分析蠶豆ASPAT蛋白的分子量、等電點、蛋白疏水性和不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì), 使用在線工具SOPMA預(yù)測蠶豆ASPAT蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

通過擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫(TAIR)下載獲得6個擬南芥ASPAT蛋白序列, 通過Ensembl Plants下載大豆、水稻、玉米、小麥、楊樹的蛋白序列。使用軟件MEGA-X中的ClustalW程序?qū)πQ豆、擬南芥、大豆等ASPAT蛋白進行同源序列比對, 并采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建蠶豆ASPAT蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹, 校驗參數(shù)Bootstrap重復(fù)值為1000,其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.5 VfASPAT基因家族亞細胞定位預(yù)測、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域及Motif分析

利用在線網(wǎng)站Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對8個候選家族成員的蛋白序列進行亞細胞定位預(yù)測分析; 根據(jù)基因組注釋信息, 利用TBtools軟件對ASPAT基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析; 利用 Pfam (https://pfam.xfam.org/)和TBtools對蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析; 利用MEME(https://meme-suite.org/)在線網(wǎng)站分析蠶豆ASPAT家族蛋白的Motif類型和排列順序, 預(yù)測數(shù)目設(shè)置為10, 長度為6～50, 其他參數(shù)不變, 獲得該基因家族Motif特點。

1.6 蠶豆ASPAT蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(STRING: functional protein association networks (string-db.org))構(gòu)建蠶豆ASPAT蛋白互作網(wǎng)絡(luò), 在數(shù)據(jù)庫中上傳VfASPAT的蛋白序列, 以大豆蛋白為參考進行比對, 根據(jù)已知的蛋白質(zhì)互作關(guān)系, 對VfASPAT基因家族的蛋白互作信息進行評估和預(yù)測, 并使用軟件Cytoscape[27](版本3.7.2)進行美化修飾。

1.7 VfASPAT基因表達模式分析與驗證

采用FPKM (fragments per kilobase million)法[28]計算蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序文庫中各基因的表達量, 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后, 使用TBtools軟件繪制在不同處理時間和不同品種間的ASPAT基因表達量熱圖。使用華越洋試劑盒提取蠶豆芽期胚的總RNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用微量分光光度計檢測RNA純度(OD260/280)和濃度。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物(表1), 以蠶豆VfNADHD4為內(nèi)參基因[29]。使用SYBR Green熒光定量預(yù)混試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進行實時熒光定量PCR檢測蠶豆ASPAT基因家族成員在處理16 h和64 h的2個蠶豆品種中的表達情況。反應(yīng)體系10 μL, 包含模板cDNA 1 μL、正/反引物各0.2 μL、2×Real Universal PreMix (SYBR Green) 5 μL和ddH2O 3.6 μL。擴增程序為95℃預(yù)變性15 min; 95℃變性10 s, 57℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 共40個循環(huán); 95℃ 10 min,59℃ 0.05 s, 95℃ 0.5 s。每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù), 采用2-ΔΔCt[30]方法計算VfASPAT基因的表達量。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下蠶豆發(fā)芽率統(tǒng)計分析

為統(tǒng)計蠶豆耐旱品種和敏感品種干旱脅迫下萌發(fā)的情況, 本研究對干旱敏感品種鄂蠶豆1號和耐旱品種CDAS105種子萌發(fā)過程進行記錄并統(tǒng)計自干旱脅迫處理開始至96 h的發(fā)芽率。在對照條件下,鄂蠶豆1號和CDAS105在48 h有47.6%和61.9%的種子開始發(fā)芽(表2)。然而, 在干旱脅迫下CDAS105在64 h和72 h發(fā)芽率分別為4.8%和9.5%, 而鄂蠶豆1號在64 h和72 h時未發(fā)芽。

表2 干旱脅迫處理兩蠶豆品種發(fā)芽率比較Table 2 Comparison of germination rate between two faba bean varieties under drought stress (%)

2.2 蠶豆ASPAT蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及亞細胞定位預(yù)測

從蠶豆中共鑒定到8個ASPAT基因家族成員,編碼的蛋白氨基酸數(shù)目為394 (VfASPAT5)～481(VfASPAT4)個(表3), 相對分子質(zhì)量43,469.05(VfASPAT5)～52,060.7 (VfASPAT4), 蛋白質(zhì)理論等電點(pI)介于5.59～8.42之間, 脂融指數(shù)79.48～96.91。除VfASPAT2和VfASPAT7的不穩(wěn)定指數(shù)大于 40, 為不穩(wěn)定蛋白, 其他均為穩(wěn)定蛋白。VfASPAT4和VfASPAT6疏水性分值(GARVY)大于0, 推測為疏水性蛋白, 其他為親水性蛋白。通過SOPMA預(yù)測蠶豆ASPAT蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可知(表4),8個蠶豆ASPAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角, 其中VfASPAT1～VfASPAT7均以α-螺旋占比最大39.09%～45.28%, 無規(guī)則卷曲次之為31.47%～35.34%。VfASPAT8 α-螺旋占35.29%, 無規(guī)則卷曲占36.38%。對8個ASPAT家族成員蛋白進行亞細胞定位(表3)發(fā)現(xiàn), VfASPAT1定位在線粒體, VfASPAT3在葉綠體和線粒體中均有分布, 其他蛋白僅存在于葉綠體中。推測蠶豆ASPAT蛋白主要在葉綠體和線粒體中參與反應(yīng)。

表3 蠶豆ASPAT蛋白理化性質(zhì)及亞細胞定位預(yù)測Table 3 Prediction of physicochemical properties and subcellular localization prediction of ASPAT inVicia fabaL.

表4 蠶豆ASPAT蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Table 4 Prediction of secondary structure of ASPAT protein inVicia fabaL. (%)

2.3 系統(tǒng)進化分析

采用MEGAX的鄰接法將蠶豆中鑒定的8個ASPAT家族成員與擬南芥、大豆、水稻、玉米、小麥、楊樹中的ASPAT蛋白保守域序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹并進行聚類分析(圖1)發(fā)現(xiàn), VfASPAT分別與其他物種聚中對應(yīng)的亞家族蛋白聚在同一分支上,參照擬南芥ASPAT基因家族的分類, 擬南芥和蠶豆等6個物種的ASPAT蛋白可分為Iα和Iβ 2個亞族,Iα為真核型ASPAT, 進而可分為3類Iα-A、Iα-B和Iα-C。蠶豆中VfASPAT1～VfASPAT3這3個家族成員屬于Iα。Iα-A中包括VfASPAT1, Iα-B中包括VfASPAT2, VfASPAT3屬于Iα-C。其中, VfASPAT3與AtASPAT5序列相似度高達92%, 由此推測這2個基因親緣關(guān)系更近, 在生物過程中可能行使相同的功能。VfASPAT1與大豆 Glyma06g275700,VfASPAT2與大豆Glyma06g082400, VfASPAT3與大豆Glyma14g111800、Glyma17g216000在一個進化分支上, 且同源性高達99%, 與小麥、玉米和水稻的相似性相對較低。VfASPAT4～VfASPAT8這4個家族成員屬于Iβ亞族為原核型ASPAT, 具有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和預(yù)苯酸轉(zhuǎn)氨酶2種活性。

圖1 蠶豆ASPAT蛋白家族的進化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of ASPAT protein inVicia fabaL.

2.4 VfASPAT基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)基因組注釋信息, 利用TBtools軟件對ASPAT基因的基因結(jié)構(gòu)進行可視化分析(圖2-A), 除VfASPAT7無5′端UTR區(qū), 其他ASPAT家族成員均含有UTR區(qū)和完整的CDS區(qū)。利用Pfam在線工具和TBtools軟件對ASPAT蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析(圖2-B)發(fā)現(xiàn), 該基因家族蛋白都擁有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域Aminotran-1-2。

2.5 蠶豆VfASPAT蛋白保守基序和多序列比對

通過TBtools軟件對蠶豆ASPAT蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析(圖2-C)得到10個保守的motif, 命名為motif 1～motif 10, 但ASPAT家族成員之間所含的motif的種類、數(shù)目及排序有所不同, VfASPAT1～VfASPAT8均含有motif 1、motif 3、motif 9三個保守基序, 說明這3種motif為該家族中非常重要的保守基序, VfASPAT1～VfASPAT3包含motif種類最多, 均含有8個motif且所含motif種類及排序一致, VfASPAT4、VfASPAT5和VfASPAT7均含有5個motif, 分別為motif 1、motif 3、motif 8、motif 9和motif 10, VfASPAT6含有4個motif, VfASPAT8含有motif數(shù)量最少只有3個。通過蠶豆與擬南芥多序列比對結(jié)果分析(圖3)發(fā)現(xiàn), 與擬南芥蛋白序列相似, 蠶豆也具有磷酸吡哆醛結(jié)合位點, 但AAT和PAT 2種蛋白的結(jié)合位點和數(shù)量有一定的差異, 蠶豆AAT蛋白有6個磷酸吡哆醛結(jié)合位點, PAT蛋白僅具有1個磷酸吡哆醛結(jié)合位點。

圖2 VfASPAT基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)域和保守基序分析Fig. 2VfASPATgene structure, protein domain, and conserved motifA: 基因結(jié)構(gòu); B: 蛋白結(jié)構(gòu)域; C: motif; D: motif氨基酸序列。A: gene structure; B: protein domain; C: motif; D: amino acid sequence of motif.

圖3 蠶豆和擬南芥ASPAT蛋白磷酸吡哆醛結(jié)合位點Fig. 3 Pyridoxal phosphate binding site of ASPAT protein in faba bean andArabidopsis thaliana紅色矩形框分別為AAT和PAT蛋白磷酸吡哆醛結(jié)合位點。The red rectangle box indicates the pyridoxal phosphate binding sites of AAT and PAT.

2.6 蠶豆ASPAT蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析

利用分子互作網(wǎng)絡(luò)在線工具STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測VfASPAT基因家族蛋白質(zhì)互作關(guān)系發(fā)現(xiàn), 整個蛋白互作網(wǎng)絡(luò)共有12個節(jié)點, 12個節(jié)點間共存在45組蛋白互作關(guān)系。由圖4可知, 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中每一個蛋白節(jié)點與其他蛋白節(jié)點都有一定的互作關(guān)系,其中蛋白VfASPAT1、VfASPAT2和VfASPAT3與其他4個家族成員蛋白均有相互作用關(guān)系, 另外該家族成員均與 HPPD (4-hy-droxyphenylpyruvate dioxygenase, 4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶)有相互作用。MDH (malate dehydrogenase, 蘋果酸脫氫酶)與VfASPAT1、VfASPAT2、VfASPAT3、VfASPAT4、VfASPAT5、VfASPAT7、VfASPAT8相互作用。DAPE(Diaminopimelate epimerase, 二氨基庚二酸異構(gòu)酶)和HTPA-reductase (4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate reductase, 4-羥基四氫二吡啶甲酸還原酶)只與PAT蛋白互作。

圖4 蠶豆ASPAT蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 Protein-protein network of ASPAT inVicia fabaL.

2.7 VfASPATs響應(yīng)干旱脅迫表達分析

通過分析蠶豆ASPAT基因家族成員轉(zhuǎn)錄組表達熱圖發(fā)現(xiàn), VfASPAT基因家族成員在耐旱品種CDAS105和敏感品種鄂蠶豆1號不同脅迫狀況下表達模式不同(圖 5)。在干旱處理 16 h時, 除VfASPAT3、VfASPAT4和VfASPAT6在兩品種中表達無差異外, 其他基因在CDAS105中的表達量均高于鄂蠶豆1號。在干旱處理64 h時,VfASPAT2、VfASPAT3、VfASPAT7和VfASPAT8在CDAS105中表達量高于鄂蠶豆1號, 而VfASPAT1、VfASPAT5和VfASPAT6在2個品種中的表達情況則相反, 其中VfASPAT2和VfASPAT3表達水平最高。值得注意的是,VfASPAT2在CDAS105中干旱脅迫16 h和64 h表達均顯著高于鄂蠶豆1號, 而VfASPAT3主要在干旱脅迫64 h時在CDAS105表達顯著高于鄂蠶豆1號。此外, 在鄂蠶豆1號中,VfASPAT6在正常處理16 h,VfASPAT4、VfASPAT8在正常處理64 h表達較高, 而VfASPAT1、VfASPAT5、VfASPAT7在CDAS105正常處理64 h表達較高。為進一步驗證上述結(jié)果,并確定蠶豆ASPAT基因在蠶豆干旱脅迫下的參與情況, 利用熒光定量PCR技術(shù)在2個蠶豆品種和2個處理時間中進行差異表達分析。由圖6可知, 8個家族成員基因表達有所差異,VfASPAT1在干旱處理16 h和64 h時表達量上調(diào), 后者與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果不一致,VfASPAT2、VfASPAT3、VfASPAT4、VfASPAT7和VfASPAT8在干旱處理16 h和64 h表達量均上調(diào),VfASPAT4轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在干旱16 h和64 h無差異且表達量很低,VfASPAT5在干旱16 h時上調(diào)非常明顯,64 h時表達量上調(diào)但不顯著,VfASPAT5在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中64 h表達量下調(diào), 兩者結(jié)果不一致;VfASPAT6在干旱處理16 h時表達量上調(diào), 64 h下調(diào),64 h的表達量變化與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。綜合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與熒光定量結(jié)果顯示,VfASPAT1和VfASPAT5主要在干旱脅迫16 h時發(fā)揮作用,VfASPAT3主要在處理64 h時響應(yīng)干旱脅迫,VfASPAT2、VfASPAT7和VfASPAT8在干旱處理16 h和64 h時均參與一定的生物過程,VfASPAT2和VfASPAT3差異最為顯著。

圖5 轉(zhuǎn)錄組鑒定蠶豆ASPAT表達Fig. 5 Relative expression pattern of ASPAT genes inVicia fababased on transcriptomeCK1-16/CK1-64為鄂蠶豆1號正常處理16 h/64 h; CK2-16/CK2-64為CDAS105正常處理16 h/64 h; T1-16/T1-64為鄂蠶豆1號干旱處理16 h/64 h; T2-16/T2-64為CDAS105干旱處理16 h/64 h。CK1-16 /CK1-64 represents 16 h/64 h normal treatments of Ecandou 1; CK2-16/CK2-64 represents 16 h/64 h normal treatments of CDAS105; T1-16/T1-64 represents 16 h/64 h drought stress of Ecandou 1; T2-16/T2-64 represents 16 h/64 h drought stress of CDAS105.

圖6 實時熒光定量PCR分析VfASPAT在鄂蠶豆1號和CDAS105中的表達差異Fig. 6 Relative expression level ofVfASPATbetween Ecandou 1 and CDAS105 by qRT-PCRCK-16和CK-64分別為正常處理16 h和64 h時CDAS105/鄂蠶豆1號的表達量比值; T1-16和T1-64分別為干旱處理16 h和64 h時CDAS105/鄂蠶豆1號的表達量比值。小寫字母表示差異顯著性(P＜ 0.05)。CK-16 and CK-64 indicates the expression ratio of CDAS105/Ecandou 1 at 16 h and 64 h under normal condition; T-16 and T-64 indicates the expression ratio of CDAS105/Ecandou 1 at 16 h and 64 h under drought stress. Lowercase letters indicate significant difference in the 0.05 probability level among the treatments.

3 討論

ASPAT是一個小基因家族, 廣泛存在于動物、植物和微生物中。在植物中, ASPAT是調(diào)節(jié)碳和氮代謝的關(guān)鍵酶, 在整個生命活動中發(fā)揮重要作用[31]。然而, 由于蠶豆基因組巨大, 全基因組序列還未公布,所以還未見關(guān)于蠶豆VfASPAT基因的相關(guān)研究。本研究根據(jù)蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對蠶豆VfASPAT基因家族進行分析, 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守基序、基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域等特征將其分為不同的亞族, 并對不同品種和不同干旱處理下的表達模式進行分析?；诟珊缔D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 共鑒定出8個VfASPAT基因家族成員, 3個編碼AAT蛋白, 5個編碼PAT蛋白, 并命名為VfASPAT1～VfASPAT8, 與已公布的其他植物物種如擬南芥[17]、楊樹等一樣[32], 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明蠶豆ASPAT蛋白主要可分為2個亞族, 即Iα和Iβ, Iα又進一步分為Iα-A、Iα-B和Iα-C三類, Iα-A中的VfASPAT定位于線粒體, Iα-C中VfASPAT在線粒體和葉綠體中均有分布, Iα-B和Iβ含有葉綠體VfASPATs, 說明他們在參與生物過程中具有不同的功能。Motif分析表明蠶豆ASPAT均含有motif 1、motif 3、motif 9三個保守基序, 說明這3種motif為該家族中非常重要的保守基序, 且AAT和PAT蛋白均具有磷酸吡哆醛結(jié)合位點, 磷酸吡哆醛是代謝中轉(zhuǎn)氨酶的重要輔酶, 在代謝中起重要作用, 該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[32]?；蚪Y(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示他們都具有相似的基因結(jié)構(gòu)和共同的蛋白結(jié)構(gòu)域Aminotran-1-2, 表明該家族成員的保守性。通過對VfASPAT蛋白質(zhì)互作關(guān)系分析顯示, 該家族蛋白主要與HPPD、MDH、DAPE和HTPA-reductase這些蛋白酶互作, 其中HPPD與該家族所有成員均有相互作用關(guān)系, 它是植物體中維生素E和質(zhì)體醌合成途徑的關(guān)鍵酶, 而質(zhì)體醌是葉綠體光合電子傳遞鏈中電子傳遞的媒介[33], MDH是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶, 參與植物抗逆境的反應(yīng)過程[34], 它與VfASPAT1～5、VfASPAT7～8相互作用, 推測該家族成員參與了植物體內(nèi)主要的代謝過程, 并與植物抗逆性有一定的關(guān)聯(lián)。基因表達模式可在一定程度上反應(yīng)基因功能, 通過研究蠶豆干旱脅迫過程中, 在不同品種不同處理時間下基因表達的變化, 反應(yīng)參與干旱脅迫的基因功能, 但具體功能與作用方式還需進一步研究。本文基于蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析蠶豆VfASPAT基因的表達模式并采用qRT-PCR進一步驗證發(fā)現(xiàn), 該家族8個成員基因在干旱處理條件下變化各異,VfASPAT2、VfASPAT7和VfASPAT8的表達量在干旱處理16 h和64 h時均上調(diào),VfASPAT1和VfASPAT5在干旱處理16 h時上調(diào),VfASPAT3在處理64 h時上調(diào),VfASPAT6表達量在干旱處理64 h時下調(diào), 表明蠶豆VfASPAT基因家族成員參與干旱脅迫過程, 且主要起正向調(diào)控的作用, 這與Seki等[18]、Su等[19]等的研究結(jié)果一致。在本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析部分顯示VfASPAT2與擬南芥的AtASPAT3親緣關(guān)系最近, 且VfASPAT2在干旱脅迫后表達量均上調(diào), 這與Seki等[18]研究一致, 在干旱或鹽脅迫開始后的10 h和24 h,AtASPAT3轉(zhuǎn)錄水平提高。本研究的結(jié)果中各家族成員的表達既有上調(diào)也有下調(diào), 這與楊樹雜交種(P. deltoides×P. nigra)的ASPAT基因家族在干旱脅迫下的表達既有上調(diào)也有下調(diào)[35]的結(jié)果一致; 對大豆根瘤中ASPAT基因研究表明在干旱脅迫下基因表達下調(diào)[36], 本研究與此結(jié)果有些出入, 至于基因表達的差異可能與物種、植物組織部位、脅迫處理程度以及ASPATs基因的功能分化有關(guān)。

4 結(jié)論

基于蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù), 鑒定了8個蠶豆VfASPAT基因, 根據(jù)系統(tǒng)進化分析分為2個亞族, 均含有保守結(jié)構(gòu)域, 存在于線粒體和葉綠體,根據(jù)蛋白互作分析該家族參與植物抗逆代謝過程。在干旱脅迫下, 蠶豆ASPAT基因家族成員在不同處理時間響應(yīng)有差異, 除VfASPAT4和VfASPAT6外其他基因表達量都呈上調(diào)趨勢,VfASPAT2和VfASPAT3差異最為明顯, 推測在蠶豆遭受干旱脅迫過程中,這些基因可能存在著正向調(diào)控的作用。