茶樹(shù)新梢中香葉醇櫻草糖苷含量的全基因組關(guān)聯(lián)分析

王讓劍楊 軍張力嵐高香鳳

1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所, 福建福州 355012;2國(guó)家茶樹(shù)改良中心福建分中心, 福建福州 355012

香葉醇是茶樹(shù)中含有的一種重要的揮發(fā)性單萜醇, 在茶樹(shù)與環(huán)境互作中起重要作用, 如抗菌[1]、驅(qū)蟲(chóng)[2]、吸引昆蟲(chóng)傳粉[3]、提高相鄰茶樹(shù)對(duì)冷脅迫的抗性[4]等。香葉醇具有溫和微甜的玫瑰花香, 也是茶葉中關(guān)鍵呈香成分之一, 其在茶鮮葉中主要以香葉醇櫻草糖苷形式存在[5]。茶鮮葉中的糖苷通常位于液泡中, 糖苷酶存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞間的空腔區(qū)域[6],正常細(xì)胞中二者相互隔離, 在茶樹(shù)遭受環(huán)境脅迫或茶葉付制時(shí), 茶鮮葉細(xì)胞遭受破壞, 二者發(fā)生接觸,液泡內(nèi)積累的糖苷會(huì)在糖苷酶作用下水解, 釋放出香葉醇等揮發(fā)性化合物, 從而使茶樹(shù)提升自身抵抗環(huán)境脅迫能力以及使成茶表現(xiàn)出愉悅的花香。

香葉醇等揮發(fā)性化合物與糖結(jié)合形成糖苷后,水溶性增大, 穩(wěn)定性增強(qiáng)[7]。糖苷形式有利于揮發(fā)性物質(zhì)在植物體內(nèi)儲(chǔ)存運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[8], 還能以低毒或脫毒的形式減少或避免其對(duì)植物自身造成毒害[9]。茶葉中糖苷分離提取與定性定量的報(bào)道較多, 熱水[10]、乙醇[11]、甲醇[12]浸提等方法均能分離提取茶葉糖苷, 水解[13]、衍生[14]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[15]等方法均可對(duì)茶葉糖苷定性定量。嫩葉和成熟葉中均有萜烯醇糖苷分布, 嫩葉含量高于成熟葉, 春季含量相對(duì)較高[16]。紅茶加工過(guò)程中, 揉捻后萜烯醇糖苷含量明顯降低, 發(fā)酵末期櫻草糖苷基本消失, 但葡萄糖苷變化不大, 說(shuō)明櫻草糖苷是紅茶香氣重要來(lái)源物質(zhì)[17]。研究表明, 茶樹(shù)體內(nèi)櫻草糖苷可以在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下通過(guò)葡萄糖基化和木糖基化順序合成[18]。糖苷形成還可能與糖苷酶相關(guān), 糖苷酶除了能水解糖苷鍵, 還能發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)生成鍵合態(tài)糖苷[19]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)是一種重要的遺傳解析方法, 已廣泛應(yīng)用于水稻[20]、小麥[21]、玉米[22]、大豆[23]等作物重要農(nóng)藝性狀候選基因的鑒定研究之中, 茶樹(shù)中基于該方法對(duì)新梢萌發(fā)期[24]、風(fēng)味代謝物[25]等重要性狀亦進(jìn)行了研究。雖然香葉醇櫻草糖苷等萜醇類(lèi)糖苷在茶樹(shù)中的生物合成、茶鮮葉中的分布以及茶葉付制過(guò)程中的變化已見(jiàn)報(bào)道, 但鮮見(jiàn)基于群體在全基因組水平上發(fā)掘與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)與候選基因的報(bào)道, 鮮葉中香葉醇櫻草糖苷含量的遺傳調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究以169個(gè)茶樹(shù)種質(zhì)構(gòu)成的自然群體為研究對(duì)象, 利用SLAF-seq技術(shù)(specific locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)開(kāi)發(fā)覆蓋茶樹(shù)全基因組的SNP, 然后在3個(gè)環(huán)境下對(duì)茶樹(shù)新梢香葉醇櫻草糖苷含量性狀進(jìn)行GWAS分析, 在全基因組水平上發(fā)掘與香葉醇櫻草糖苷含量性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)與候選基因, 以期為香葉醇櫻草糖苷含量的遺傳調(diào)控機(jī)制研究及茶樹(shù)分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

茶樹(shù)種質(zhì)FT516為黃觀音(♀)與鐵觀音(♂)人工雜交創(chuàng)新種質(zhì), 該種質(zhì)制烏龍茶香氣馥郁幽雅, 品質(zhì)優(yōu)異, 保存于福建省烏龍茶種質(zhì)資源圃內(nèi)(27°13′40″N,119°32′11″E)。供試材料為FT516的自然雜交后代,含169個(gè)茶樹(shù)種質(zhì)。2014年11月份收集FT516母樹(shù)上成熟的自然雜交種子, 溫室條件下沙培至發(fā)根狀態(tài)。2015年3月種植到田間, 單株種植, 株距0.5 m,行距1.5 m, 田間管理措施相對(duì)一致。2018、2019和2020連續(xù)3年分別采摘各參試種質(zhì)春季新梢無(wú)損傷無(wú)病蟲(chóng)害的單芽, 用于香葉醇櫻草糖苷含量測(cè)定、SLAF-seq, 其中香葉醇櫻草糖苷極端高含量種質(zhì)409、極端低含量種質(zhì)1605單芽用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因組DNA重測(cè)序。另取相同栽培環(huán)境下的已應(yīng)用品種悅茗香、福云6號(hào)單芽, 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因, 其中悅茗香為香葉醇櫻草糖苷高含量品種, 福云6號(hào)為香葉醇櫻草糖苷低含量品種[26]。

1.2 香葉醇櫻草糖苷含量表型性狀鑒定

按照文獻(xiàn)方法測(cè)定參試茶樹(shù)種質(zhì)新梢單芽香葉醇櫻草糖苷含量[26]。使用SAS8.0進(jìn)行表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析, 利用PROC VARCOMP程序進(jìn)行方差分量評(píng)估, 并計(jì)算香葉醇櫻草糖苷含量性狀廣義遺傳力(h2),計(jì)算公式:h2=σg2/(σg2+σe2), 其中,σg2為遺傳方差,σe2為環(huán)境方差。

1.3 群體SNP分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

利用CTAB法提取茶樹(shù)基因組DNA, 選用HaeIII酶切茶樹(shù)基因組DNA, 酶切片段長(zhǎng)度在314～364 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽, 然后對(duì)檢測(cè)合格的各樣品基因組DNA分別進(jìn)行酶切。對(duì)得到的酶切片段進(jìn)行3′端加A處理、連接Dual-index測(cè)序接頭、PCR擴(kuò)增、純化、混樣、切膠選取目的片段, 文庫(kù)質(zhì)檢合格后基于百邁客Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。利用BWA[27]將測(cè)序reads比對(duì)到參考基因組上(參考基因組地址http://tpdb.shengxin.ren/), 使用GATK[28]和samtools[29]開(kāi)發(fā)SNP, 以2種方法得到的SNP交集作為可靠SNP數(shù)據(jù)集。按照完整度大于0.8, 次要基因型頻率大于0.05標(biāo)準(zhǔn), 對(duì)SNP數(shù)據(jù)集進(jìn)行過(guò)濾,使用過(guò)濾的SNP進(jìn)行后續(xù)遺傳分析。

1.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

使用admixture軟件[30]進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,分別假設(shè)樣品的分群數(shù)(K值)為1～10, 并對(duì)聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行交叉驗(yàn)證, 根據(jù)交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)。使用EIGENSOFT軟件[31]進(jìn)行PCA主成分分析(principal components analysis, PCA)。使用plink[32]軟件計(jì)算兩兩SNP間的連鎖不平衡強(qiáng)度(R2),將SNP間距與R2進(jìn)行擬合, 繪制R2隨距離變化的LD衰減圖(linkage disequilibrium, LD)。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于Tassle軟件Glm模型進(jìn)行GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析, 使用admixture軟件的Q矩陣結(jié)果作為固定效應(yīng)[33]。顯著性閾值P設(shè)置為:P＜1.48×10-6[P=(10n)-1,n為使用標(biāo)記的總數(shù)]。根據(jù)GWAS結(jié)果獲得顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 基于群體連鎖不平衡分析LD區(qū)間和茶樹(shù)參考基因組注釋信息, 獲得與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)基因。

1.6 極端表型材料RNA-Seq與候選基因篩選

分別取極端高香葉醇櫻草糖苷含量種質(zhì)409和極端低香葉醇櫻草糖苷含量種質(zhì)1605春梢單芽, 每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 在北京百邁克生物科技有限公司有參全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 流程包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序(參考基因組http://tpdb.shengxin.ren/)。樣本之間差異表達(dá)基因GO和KEGG富集分析在百邁客云平臺(tái)完成(https://international.biocloud.net/)。另取栽培品種悅茗香、福云6號(hào)春梢單芽樣品同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 進(jìn)一步篩選驗(yàn)證候選基因。篩選差異表達(dá)基因條件為: 采用CPM (counts per million)作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)(CPM=比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)目×106/比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的reads數(shù)目)[34]。將GWAS分析得到的與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)的基因在2個(gè)極端種質(zhì)以及栽培品種悅茗香和福云6號(hào)差異表達(dá)基因中搜索, 重疊基因視為候選基因。

1.7 候選基因編碼區(qū)序列差異及上游作用元件分析

在百邁客全基因組重測(cè)序分析平臺(tái)完成409和1605基因組重測(cè)序, 流程包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序, 然后將重測(cè)序獲得的無(wú)冗余reads重新定位到參考基因組上, 進(jìn)行編碼區(qū)SNP非同義突變分析(參考基因組http://tpdb.shengxin.ren/)。將候選基因起始密碼子上游2 kb的序列作為啟動(dòng)子區(qū)域, 提交到在線工具Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), 默認(rèn)參數(shù), 進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香葉醇櫻草糖苷含量表型變異分析

對(duì)參試種質(zhì)香葉醇櫻草糖苷含量性狀進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn), 各環(huán)境下群體香葉醇櫻草糖苷含量變異系數(shù)在77.6%～81.8%之間, 說(shuō)明該表型性狀變異較豐富。正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果表明(Ryan-Joiner檢驗(yàn)), 各環(huán)境下群體香葉醇櫻草糖苷含量性狀r值在0.855～0.917之間, 接近正態(tài)分布, 說(shuō)明該性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀(表1)。方差分析結(jié)果表明, 香葉醇櫻草糖苷含量性狀在基因、環(huán)境間均呈現(xiàn)顯著差異,依據(jù)方差組分估算廣義遺傳力(h2)為62.6%, 說(shuō)明香葉醇櫻草糖苷含量性狀變異主要受遺傳影響(表2)。

表1 香葉醇櫻草糖苷含量表型變異Table 1 Phenotypic variation of geranyl β-primeveroside content

表2 香葉醇櫻草糖苷含量方差分析Table 2 Variance analysis of geranyl β-primeveroside content

2.2 群體SNP開(kāi)發(fā)

基于SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù), 共開(kāi)發(fā)群體SNP標(biāo)記10,802,426個(gè)。根據(jù)SNP變異位點(diǎn)在基因組發(fā)生區(qū)域進(jìn)一步細(xì)分類(lèi)型, 大部分檢測(cè)到的SNP變異發(fā)生在基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域、基因上下游區(qū)域, 基因編碼區(qū)的同義突變和非同義突變SNP數(shù)目較少(表3)。

表3 群體SNP標(biāo)記統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of SNP marker types in the population

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

經(jīng)質(zhì)量控制, 篩選出675,245個(gè)SNP用于后續(xù)遺傳分析, 每個(gè)標(biāo)記間的平均距離為4.47 kb (3.02 Gb/675,245)。利用admixture軟件分析, 當(dāng)K=2時(shí)(圖1-A), ΔK值最大, 參試群體被劃分為2個(gè)亞群(圖1-B), 利用 EIGENSOFT軟件進(jìn)行主成分分析(principal components analysis, PCA), 參試群體也被劃分為2個(gè)亞群(圖1-C), 2種方法劃分結(jié)果一致。利用plink軟件繪制R2隨距離變化圖發(fā)現(xiàn),R2從0.2下降到0.1時(shí), LD衰減距離約為100 kb (圖1-D)。標(biāo)記間的平均距離遠(yuǎn)小于LD衰減距離, 說(shuō)明標(biāo)記密度滿足GWAS分析要求。

圖1 遺傳結(jié)構(gòu)及連鎖不平衡分析Fig. 1 Analysis of genetic structure and linkage disequilibriumA: 遺傳結(jié)構(gòu)分析; B: 主成分分析; C: 連鎖不平衡分析。A: the genetic structure analysis; B: the principal component analysis; C: the linkage disequilibrium analysis.

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

基于TASSEL軟件GLM模型對(duì)香葉醇櫻草糖苷含量性狀進(jìn)行GWAS分析, 3個(gè)環(huán)境下共檢測(cè)到340個(gè)SNP標(biāo)記與香葉醇櫻草糖苷濃度顯著相關(guān),其中2個(gè)環(huán)境下均檢測(cè)到的SNP標(biāo)記共65個(gè), 各標(biāo)記貢獻(xiàn)率在17.1%～23.9%之間, 分布在29個(gè)Scaffold上, 均位于基因間區(qū)、基因內(nèi)含子以及基因下游區(qū)域(表4)。

表4 香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)的SNP位點(diǎn)Table 4 SNP sites related to geranyl β-primeveroside content

2.5 香葉醇櫻草糖苷含量候選基因預(yù)測(cè)

基于茶樹(shù)參考基因組信息(http://tpdb.shengxin.ren/)和LD衰減距離(100 kb), 獲得與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)65個(gè)SNP標(biāo)記上、下游100 kb范圍內(nèi)的基因共88個(gè), 涵蓋了信號(hào)蛋白、激酶、磷酸酶、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白、激素相關(guān)蛋白、抗性蛋白、萜類(lèi)代謝酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶類(lèi)等(表5)。

表5 候選基因信息Table 5 Candidate gene information

(續(xù)表5)

(續(xù)表5)

2.6 極端表型材料RNA-Seq分析

利用RNA-Seq獲得2個(gè)香葉醇櫻草糖苷極端含量種質(zhì)差異表達(dá)基因共4393個(gè), 其中顯著上調(diào)表達(dá)基因2049個(gè)(圖2-A), 顯著下調(diào)表達(dá)基因2344個(gè)(圖2-B)。GO功能分析結(jié)果表明, 差異表達(dá)基因生物過(guò)程最多的2類(lèi)均是細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、代謝過(guò)程(metabolic process), 細(xì)胞結(jié)構(gòu)最多的2類(lèi)均是膜(membrane)、膜構(gòu)件(membrane part), 分子功能最多的2類(lèi)均是結(jié)合活性(binding)、催化活性(catalytic activity) (圖3-A, B)。KEGG功能分析結(jié)果表明, 上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在油菜素甾醇、類(lèi)黃酮、核糖體蛋白、氨基酸等代謝途徑(圖4-A), 下調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在單萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)、花生四烯酸類(lèi)、玉米素類(lèi)等代謝途徑(圖4-B)。

圖2 差異表達(dá)基因Fig. 2 Differentially expressed genesA: 409 vs 1605顯著上調(diào)表達(dá); B: 409 vs 1605顯著下調(diào)表達(dá)。A: 409 vs 1605 significantly up regulated; B: 409 vs 1605 significantly down regulated.

(圖3)

圖3 差異表達(dá)基因GO功能分析Fig. 3 GO functional analysis of differentially expressed genesA: 409 vs 1605顯著上調(diào)表達(dá); B: 409 vs 1605顯著下調(diào)表達(dá)。A: 409 vs 1605 significantly up regulated; B: 409 vs 1605 significantly down regulated.

圖4 差異表達(dá)基因KEGG功能分析Fig. 4 KEGG functional analysis of differentially expressed genesA: 409 vs 1605顯著上調(diào)表達(dá); B: 409 vs 1605顯著下調(diào)表達(dá)。A: 409 vs 1605 significantly up regulated; B: 409 vs 1605 significantly down regulated.

2.7 香葉醇櫻草糖苷含量候選基因篩選

將GWAS分析得到的顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記上、下游100 kb范圍內(nèi)的相關(guān)基因在2個(gè)香葉醇櫻草糖苷極端含量種質(zhì)差異表達(dá)基因中搜索, 得到重疊基因10個(gè), 均表現(xiàn)為高含量種質(zhì)中表達(dá)量高于低含量種質(zhì)。利用栽培品種悅茗香、福云6號(hào)進(jìn)一步驗(yàn)證10個(gè)重疊基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn), 10個(gè)重疊基因在香葉醇櫻草糖苷高含量品種悅茗香中表達(dá)量亦高于香葉醇櫻草糖苷低含量品種福云6號(hào)(表6), 故將10個(gè)重疊基因初步視為候選基因。

表6 香葉醇櫻草糖苷含量候選基因預(yù)測(cè)Table 6 Prediction of candidate genes of geranyl β-primeveroside contents

2.8 候選基因編碼區(qū)序列差異及上游作用元件分析

對(duì)2個(gè)極端香葉醇櫻草糖苷極端含量種質(zhì)進(jìn)行基因組DNA重測(cè)序, 10個(gè)候選基因編碼區(qū)序列在2個(gè)極端種質(zhì)之間均存在SNP非同義突變, 造成了不同種質(zhì)之間編碼蛋白氨基酸序列的差異(表7)。利用Plant CARE在線工具對(duì)所有10個(gè)候選基因上游2 kb的區(qū)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)(表8)。在所有類(lèi)型的元件中, 與激素響應(yīng)相關(guān)的元件及與環(huán)境脅迫相關(guān)的元件是代表植物核心生理過(guò)程的調(diào)控元件。候選基因中具有與激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件的基因占8個(gè)(除TEA023801.1、TEA009864.1外), 其中與赤霉素、脫落酸和茉莉酸甲酯有關(guān)的順式作用元件含量較豐富。候選基因中具有與環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件的基因占9個(gè)(除TEA009864.1外), 其中與防御和應(yīng)激反應(yīng)性、干旱誘導(dǎo)、無(wú)氧誘導(dǎo)有關(guān)的元件含量較豐富。

表7 2個(gè)極端種質(zhì)中差異基因編碼區(qū)序列變異Table 7 Sequence variation of differential gene coding region in two extreme germplasms

(續(xù)表7)

表8 茶樹(shù)香葉醇櫻草糖苷候選基因上游與環(huán)境相關(guān)的順式作用元件的預(yù)測(cè)Table 8 Prediction of environmental relatedcis-elements in the upstream regions of candidate genes for tea geraniol primrose glycoside

(續(xù)表8)

3 討論

分析了參試茶樹(shù)種質(zhì)在3個(gè)環(huán)境下新梢中香葉醇櫻草糖苷含量的遺傳差異, 其廣義遺傳力為62.6%, 說(shuō)明香葉醇櫻草糖苷含量變異主要受遺傳控制, 其候選基因編碼區(qū)序列均存在SNP非同義突變, 預(yù)示可以通過(guò)遺傳改良手段定向調(diào)控茶樹(shù)新梢中香葉醇櫻草糖苷含量。候選基因中多數(shù)基因上游2 kb區(qū)域存在不同數(shù)量的與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和環(huán)境脅迫相關(guān)的順式作用元件, 預(yù)示激素水平和環(huán)境變化會(huì)影響茶樹(shù)香葉醇櫻草糖苷的積累。候選基因涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、代謝變化等多個(gè)過(guò)程(圖5),說(shuō)明茶樹(shù)新梢香葉醇櫻草糖苷積累的遺傳調(diào)控機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的體系, 由基因和環(huán)境共同決定, 它們之間的相互作用仍有待深入研究。

圖5 候選基因示意圖Fig. 5 Schematic diagram of candidate genes括號(hào)中的數(shù)字表示基因個(gè)數(shù)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo): TEA023908.1, TEA006075.1, TEA029081.1, TEA027247.1; 基因轉(zhuǎn)錄: TEA023801.1; 蛋白翻譯:TEA023811.1, TEA009864.1; 抗病蛋白: TEA006076.1; 糖代謝: TEA001888.1, TEA018925.1。Numbers in brackets indicate the number of genes. Signal transduction: TEA023908.1, TEA006075.1, TEA029081.1, TEA027247.1; Gene transcription: TEA023801.1; Protein translation: TEA023811.1, TEA009864.1; Resistant protein: TEA006076.1; Glucose metabolism:TEA001888.1, TEA018925.1.

富含亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶(LRR-RLK)包含1個(gè)胞外的富含亮氨酸(LRR)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶結(jié)構(gòu)域[35]。LRR-RLK定位在細(xì)胞質(zhì)膜上, 能夠感知外界環(huán)境信號(hào), 然后通過(guò)磷酸化將信號(hào)傳遞到胞內(nèi)相應(yīng)部位, 可作為信號(hào)感知元件參與植物體應(yīng)答生物和非生物脅迫過(guò)程[36]。不同的LRR-RLK中LRR數(shù)目和排布有較大的區(qū)別, LRR的多樣性使LRR-RLK能夠特異的識(shí)別不同的信號(hào)分子, 從而準(zhǔn)確傳遞不同的胞外信號(hào)[37]。水稻接種稻瘟病菌后,OsBRR1在葉片中的表達(dá)受強(qiáng)烈誘導(dǎo), 同時(shí)過(guò)量表達(dá)OsBRR1轉(zhuǎn)基因植株可以提高稻瘟病抗性[38]。水稻中的一個(gè)LRR-RLK蛋白激酶還能正調(diào)控與生物脅迫相關(guān)的MAPK及WRKY表達(dá)水平, 從而調(diào)控植物對(duì)昆蟲(chóng)取食的防御機(jī)制[39]。煙草中LRR-RLK基因參與了鹽脅迫反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程[40]。辣椒中LRR類(lèi)受體蛋白激酶基因CaLRR1的表達(dá)受病原菌侵染的誘導(dǎo)[41]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在接受到生物和非生物脅迫信號(hào)后迅速在其絲氨酸、蘇氨酸部位發(fā)生磷酸化而被激活, 并通過(guò)對(duì)下游分子的磷酸化作用, 最終將外界信號(hào)傳遞給細(xì)胞核, 調(diào)節(jié)特異基因的表達(dá)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)富含亮氨酸重復(fù)類(lèi)受體蛋白激酶基因(TEA023908.1、TEA006075.1)和2個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(TEA029081.1、TEA027247.1)與香葉醇櫻草糖苷的含量有關(guān), 推測(cè)這些蛋白激酶作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子會(huì)將環(huán)境脅迫信號(hào)傳遞到代謝網(wǎng)絡(luò)下游, 導(dǎo)致茶樹(shù)香葉醇櫻草糖苷發(fā)生代謝變化, 從而引發(fā)香葉醇在茶樹(shù)與環(huán)境互作中發(fā)揮重要作用。

茶樹(shù)體內(nèi)櫻草糖苷可在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下通過(guò)葡萄糖基化和木糖基化順序合成, 雖然鼠李糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸均可作為糖基轉(zhuǎn)移酶的活性糖供體, 但一般認(rèn)為葡萄糖是最常見(jiàn)的糖基供體[18]。β-1,3-葡聚糖酶能夠水解β-1,3-葡聚糖成為葡萄糖和小分子寡糖, 在正常情況下β-1,3-葡聚糖酶表達(dá)水平較低, 當(dāng)植物遭受生物因子以及非生物因子誘導(dǎo)后, 其表達(dá)活性會(huì)顯著增強(qiáng)[43]。研究表明, 棉花β-1,3-葡聚糖酶基因參與了棉花對(duì)黃萎病的防衛(wèi)反應(yīng)[44]。煙草β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化番茄可使番茄發(fā)病率降低36%～58%[45]。本研究鑒定到2個(gè)β-1,3-葡聚糖酶基因(TEA001888.1、TEA018925.1)與香葉醇櫻草糖苷累積相關(guān), 推測(cè)β-1,3-葡聚糖酶通過(guò)水解作用產(chǎn)生葡萄糖為香葉醇櫻草糖苷生物合成提供糖配基并參與調(diào)節(jié)香葉醇的累積和釋放, 從而抵御生物和非生物脅迫。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中為了應(yīng)對(duì)復(fù)雜的環(huán)境變化, 進(jìn)化形成了2個(gè)不同層次的防御反應(yīng), 初級(jí)免疫反應(yīng)(PTI)和次級(jí)免疫反應(yīng)(ETI), 其中ETI比PTI更為強(qiáng)烈和迅速, 可以通過(guò)局部程序性細(xì)胞死亡引起植物超敏反應(yīng), 能更為有效地遏制病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散[46]。RPM1是一種植物抗病蛋白, 可以觸發(fā)ETI使植物獲得抗病性[47]。本研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)抗病蛋白R(shí)PM1基因(TEA006076.1)與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān), 推斷香葉醇櫻草糖苷以及香葉醇在與環(huán)境互作過(guò)程中會(huì)協(xié)同產(chǎn)生抗病蛋白R(shí)PM1, 從而提高茶樹(shù)抗病性。

植物萜類(lèi)化合物的合成途徑分為甲羥戊酸(MVA)和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)2種途徑, 前者位于細(xì)胞質(zhì)中, 后者位于質(zhì)體中, 二者雖有所不同, 但共同點(diǎn)都以異戊烯基焦磷酸(IPP)為主要中間產(chǎn)物。IPP與其異構(gòu)體二甲丙烯焦磷酸(DMAPP)在異戊烯基二磷酸合酶(IPPS)催化下生成香葉基焦磷酸(GPP), 后者在萜類(lèi)合成酶(TPS)的作用下生成香葉醇[48]。本研究在Scaffold349上280 bp范圍內(nèi)鑒定到6個(gè)SNP, 分別位于3,542,803 bp、3,543,009 bp、3,543,014 bp、3,543,021 bp、3,543,061 bp、3,543,082 bp位置, 在該區(qū)段10.9 kb和85.8 kb附近區(qū)域分別存在 1個(gè)核糖體蛋白基因(TEA023811.1)和1個(gè)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄亞基基因(TEA023801.1), 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明這2個(gè)基因在香葉醇櫻草糖苷極端含量種質(zhì)中均表現(xiàn)顯著差異表達(dá),說(shuō)明他們可能與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)。有趣的是在該區(qū)段8.6 kb區(qū)域附近還存在1個(gè)異戊烯基二磷酸合酶基因(TEA023826.1), 推測(cè)核糖體蛋白基因(TEA023811.1)和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄亞基基因(TEA023801.1)參與異戊烯基二磷酸合酶基因(TEA023826.1)的轉(zhuǎn)錄和翻譯, 進(jìn)而導(dǎo)致香葉醇及其櫻草糖苷代謝和累積變化。

萜類(lèi)化合物與單糖(或寡糖)一起作為底物, 可在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成不易揮發(fā)的糖苷化合物。雖然本研究篩選的候選基因中未包括糖基轉(zhuǎn)移酶基因, 但是在Scaffold3611的1,622,376 bp位置鑒定到1個(gè)SNP, 其附近14.9 kb區(qū)域存在一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(TEA013410.1)和一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因(TEA013393.1), 他們是否參與香葉醇櫻草糖苷的生物合成, 仍有待證實(shí)。

4 結(jié)論

對(duì)茶樹(shù)新梢中香葉醇櫻草糖苷含量進(jìn)行了GWAS分析, 初步鑒定到10個(gè)與香葉醇櫻草糖苷含量相關(guān)的候選基因, 其編碼區(qū)序列在香葉醇櫻草糖苷極端含量種質(zhì)之間均存在非同義SNP突變, 并且多數(shù)基因上游2 kb區(qū)域存在不同數(shù)量的與環(huán)境脅迫和激素相關(guān)的順式作用元件, 說(shuō)明香葉醇櫻草糖苷的含量變異與遺傳及環(huán)境脅迫相關(guān)。該結(jié)果對(duì)茶樹(shù)香葉醇櫻草糖苷含量的遺傳調(diào)控機(jī)制研究及育種實(shí)踐具有較好的理論和應(yīng)用參考價(jià)值。