轉(zhuǎn)基因玉米ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法及其標(biāo)準(zhǔn)化

常麗娟梁晉剛宋 君劉文娟付成平代曉航王 東魏 超熊 梅

1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 四川成都 610066;2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心, 北京 100176;3四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院遙感與數(shù)字農(nóng)業(yè)研究所, 四川成都 610066

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(https://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/55/default.asp)報(bào)道, 2019年全球29個(gè)國家總共種植了1.904億公頃的轉(zhuǎn)基因作物, 影響全球約19.5億人口的糧食供應(yīng), 對(duì)全球糧食安全、可持續(xù)性發(fā)展、減緩氣候變化做出了重大貢獻(xiàn)。全球前五的轉(zhuǎn)基因作物種植國家分別是美國、巴西、阿根廷、加拿大和印度,主要種植的轉(zhuǎn)基因作物為棉花、玉米、大豆和油菜。玉米作為第二大轉(zhuǎn)基因種植作物, 自1995年在美國獲得商業(yè)化許可后推廣應(yīng)用十分迅速。同時(shí), 玉米是我國最重要的食物及工業(yè)原料, 國內(nèi)的轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)工作取得了較大的進(jìn)步, 如抗蟲耐除草劑玉米DBN9501、抗蟲耐除草劑玉米DBN9936、抗蟲耐除草劑玉米DBN3601T、耐除草劑玉米DBN9858、抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125、抗蟲玉米浙大瑞豐8、抗蟲玉米ND207先后均獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。

轉(zhuǎn)基因玉米ND207是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品種, 該品種通過農(nóng)桿菌侵染的方法把抗鱗翅目害蟲基因mCry1Ab和mCry2Ab轉(zhuǎn)入到具有高效轉(zhuǎn)化效率的玉米自交系雜交組合HiII中, 用篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行篩選, 然后通過回交導(dǎo)入到鄭58的自交系獲得ND207, 修飾后的mCry1Ab和mCry2Ab抗蟲基因共同作用能夠有效抑制抗性種群產(chǎn)生。目前, ND207已經(jīng)獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書, 具有重要產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景, 建立ND207的檢測方法是商業(yè)化推廣的重要環(huán)節(jié)。

轉(zhuǎn)基因成分檢測方法應(yīng)用最廣的是PCR檢測法,普通PCR由于操作簡便、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各檢測機(jī)構(gòu)。根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)的不同,轉(zhuǎn)基因成分PCR檢測方法可分為篩查法[1]、基因特異性方法[2]、構(gòu)建特異性方法[3]和轉(zhuǎn)化事件特異性方法[4]。轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測方法的建立必須克隆到插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列, PCR引物一端設(shè)計(jì)在受體植物基因組上, 另一端設(shè)計(jì)在外源載體序列上。由于插入位點(diǎn)具有唯一性, 轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測可以確定轉(zhuǎn)基因植物的身份。近年來為了滿足我國轉(zhuǎn)基因市場監(jiān)管的需要, 研究人員研制了包括轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1[5], 轉(zhuǎn)基因玉米98140[6]、MON88017[7]等一系列轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測方法,形成了轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)體系[8-11]。由于ND207是新研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體,目前尚無ND207檢測方法的相關(guān)報(bào)道。本研究從分析ND207旁側(cè)序列入手, 通過引物篩選, 找到最佳的引物設(shè)計(jì)位點(diǎn), 再優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,建立ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法。通過8家轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)的循環(huán)驗(yàn)證,ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法滿足國家標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)要求, 可形成國家標(biāo)準(zhǔn)在檢測行業(yè)推廣應(yīng)用。ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法的建立, 將對(duì)該轉(zhuǎn)化體的安全評(píng)價(jià)、監(jiān)管和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐, 促進(jìn)我國玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料ND207純合體玉米品種、ND207受體玉米品種、相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因作物填充的各轉(zhuǎn)化體含量為1%的轉(zhuǎn)基因作物混合粉末。其中包括13種轉(zhuǎn)基因大豆混樣: GTS40-3-2、MON89788、A5547-127、A2704-12、356043、305423、CV127、MON87701、MON87708、MON87769、MON87705、FG72和DAS81419-2。18種轉(zhuǎn)基因玉米混樣: Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、DAS40278-9、4114、MON87427和5307。8種轉(zhuǎn)基因水稻混樣: TT51-1、KF-6、KMD-1、M12、KF-8、KF-2、G6H1和T1C-19。7種轉(zhuǎn)基因棉花混樣: MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614和COT102。10種轉(zhuǎn)基因油菜混樣: MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2、MON88302和73496。以上試驗(yàn)材料由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供。試驗(yàn)材料陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、大豆、油菜和棉花組成的混合粉末)由本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)材料ND207不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品由ND207純合體玉米品種及ND207受體玉米品種粉末按不同質(zhì)量比例(w/w)混合制備而成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米基因組DNA的提取和純化 按照植物基因組DNA純化試劑盒(TIANGEN, 天根生化科技(北京)有限公司)說明書分離、純化植物材料基因組DNA, 用超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 1000, 賽默飛世爾科技(中國)有限公司)測定基因組DNA濃度和純度。所有植物材料基因組DNA濃度稀釋至25 ng μL-1。

1.2.2 ND207旁側(cè)序列的獲取 根據(jù)研發(fā)單位提供的資料, ND207整合入玉米基因組的T-DNA全長序列為8060 bp, 全長序列包含3個(gè)外源基因及其調(diào)控元件(圖1), 研發(fā)單位提供了分別針對(duì)5′端和3′端的2組PCR檢測引物(表1)。采用研發(fā)者提供的引物分別對(duì)ND207純合體玉米品種、ND207受體玉米品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析, 獲取了ND207旁側(cè)序列。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米ND207 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primer pairs for PCR amplification of transgenic maize ND207

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米ND207外源插入序列圖譜Fig. 1 Exogenous insertion sequence map of transgenic maize ND207

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)ND2075′端和3′端旁側(cè)序列, 采用Primer5設(shè)計(jì)多條PCR引物見表2, 將正向和反向引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小見表3。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 用1×TE緩沖液稀釋至 10 μmol L-1的工作液。

表2 PCR反應(yīng)引物序列信息表Table 2 Primer sequence used for PCR

1.2.4 PCR擴(kuò)增 (1) 引物篩選: 為了獲取最佳引物組合, 對(duì)表3的引物組合進(jìn)行引物初篩, 用ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,選取電泳條帶明亮無拖尾的引物進(jìn)行特異性檢測。特異性篩選設(shè)置陽性對(duì)照(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的ND207)、陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因混合粉)、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣, PCR擴(kuò)增篩選出特異性好的引物進(jìn)行靈敏度檢測。引物靈敏度篩選樣品設(shè)置ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、5%、1%、0.5%、0.1%5個(gè)樣品及空白對(duì)照, PCR擴(kuò)增篩選出靈敏度好的引物。引物篩選PCR反應(yīng)設(shè)置2個(gè)平行, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 確定最佳引物組合。(2) PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化: 采用最佳引物組合, 以ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的DNA為模板, 設(shè)置3個(gè)平行, 對(duì)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因子引物濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化, 設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol L-16個(gè)引物濃度梯度, 退火溫度52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 5個(gè)溫度梯度正交組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳分析確定最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件, 建立ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法。(3) 方法測試: 為測試方法的靈敏度, 設(shè)置ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05% 7個(gè)樣品及空白對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 每個(gè)樣品3個(gè)平行, PCR產(chǎn)物電泳分析靈敏度測試結(jié)果。隨機(jī)抽取60份ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品, 提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。不同實(shí)驗(yàn)室不同操作人員采用不同儀器(ABI Verit, 賽默飛世爾科技(中國)有限公司; Eppendorf Nexus Gradient, 艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司)對(duì)陽性對(duì)照(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的ND207)、陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因混合粉)、檢出限樣品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的ND207)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 每個(gè)樣品10個(gè)平行, 對(duì)方法再現(xiàn)性進(jìn)行測試。(4) 方法的循環(huán)驗(yàn)證: 為驗(yàn)證抗蟲玉米ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法的特異性、檢出限、再現(xiàn)性等參數(shù), 綜合評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性、先進(jìn)性和適用性, 按照《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 轉(zhuǎn)化體特異性和基因特異性定性PCR方法標(biāo)準(zhǔn)文本驗(yàn)證方案》(農(nóng)基安標(biāo)[2012] 1號(hào))及《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測定性PCR方法制定指南》[13]的要求, 設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)文本的復(fù)核驗(yàn)證方案, 并準(zhǔn)備試驗(yàn)材料, 邀請(qǐng)8家轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)對(duì)方法進(jìn)行循環(huán)驗(yàn)證。

表3 PCR反應(yīng)引物組合信息表Table 3 Primer combinations used for PCR

1.2.5 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳 稱取3 g瓊脂糖(Multi-purpose Agarose, 上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司), 加入150 mL TAE緩沖液及15 μL核酸染料(GS-GelRed, 北京金沙生物科技有限公司), 配制2%瓊脂糖凝膠, PCR產(chǎn)物及marker (E-Gel低范圍定量DNA分子量標(biāo)準(zhǔn), 賽默飛世爾科技(中國)有限公司)上樣5 μL, 在90 v電壓下電泳70 min, 取出凝膠,放入凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc Go, 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 ND207旁側(cè)序列的獲取

獲取轉(zhuǎn)基因植物外源T-DNA插入位點(diǎn)旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn), 分別提取ND207純合體及受體玉米基因組DNA, 采用研發(fā)單位提供的引物ND2075F、ND2075R和ND2073F、ND2073R對(duì)ND207純合體玉米基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析, 獲得5′端旁側(cè)序列262 bp和3′端旁側(cè)序列316 bp, 用ND2075F、ND2073R對(duì)受體玉米DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析, 獲得插入位點(diǎn)受體玉米基因組序列423 bp。將兩端旁側(cè)序列分別與受體玉米基因組序列進(jìn)行比對(duì)(圖2), 5′端序列有153 bp和玉米基因組序列完全相同, 109 bp為載體序列; 3′端序列有240 bp 和玉米基因組序列完全相同, 76 bp為載體序列。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米ND207兩端旁側(cè)序列與玉米基因組序列比對(duì)圖Fig. 2 Sequence alignment between both 5'- and 3'-flanking sequences of transgenic maize ND207 and genome sequence in WT maize圖中黑色背景表示相比較序列的堿基相同, 藍(lán)色背景表示相比較序列的堿基不同。The identical nucleotide is shaded with black color, and the nucleotide shaded with blue color means the base differences of the compared sequence.

2.2 ND207引物初篩

以ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的DNA為模板, 采用表3的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 選擇目標(biāo)條帶長度在120～300 bp之間, 擴(kuò)增條帶明亮沒有拖尾, 無非特異性擴(kuò)增條帶, 生成引物二聚體較少的引物。由圖3可知: 3′-1、3′-2、3′-3、3′-4無擴(kuò)增信號(hào)。3′-7、3′-8、3′-10、3′-11、3′-12、3′-13、3′-14、3′-15、5′-2、5′-3、5′-4、5′-6、5′-7、5′-8、5′-9有擴(kuò)增信號(hào), 電泳目的條帶較弱,5′-9引物二聚體較明顯。5′-1、5′-5、3′-5、3′-6、3′-9、3′-16有擴(kuò)增信號(hào), 電泳出現(xiàn)目的條帶, 無其他非特異條帶, 目的條帶大小與預(yù)期相符, 且條帶清晰、明亮, 可進(jìn)行下一步篩選。

圖3 ND207引物篩選Fig. 3 Screening of the primers for ND207

2.3 引物特異性篩選

為了篩選出只對(duì)ND207特異擴(kuò)增的引物, 提取陽性對(duì)照(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的ND207)、陰性對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因混合粉)、轉(zhuǎn)基因玉米混樣、轉(zhuǎn)基因水稻混樣、轉(zhuǎn)基因油菜混樣、轉(zhuǎn)基因大豆混樣、轉(zhuǎn)基因棉花混樣的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 對(duì)引物5′-1、5′-5、3′-5、3′-6、3′-9、3′-16進(jìn)行特異性測試。由圖4可知, 3′-5、3′-6、3′-9均出現(xiàn)明亮不一的非特異條帶;5′-1、5′-5、5′-16只在陽性對(duì)照中獲得與預(yù)期目的條帶一致的擴(kuò)增條帶。因此, 5′-1、5′-5、3′-16可進(jìn)行下一步篩選。

圖4 引物特異性篩選Fig. 4 Screening for the primers specificity1: 陽性對(duì)照; 2: 陰性對(duì)照; 3: 空白對(duì)照; 4: 轉(zhuǎn)基因玉米混樣; 5: 轉(zhuǎn)基因水稻混樣; 6: 轉(zhuǎn)基因油菜混樣; 7: 轉(zhuǎn)基因大豆混樣; 8: 轉(zhuǎn)基因棉花混樣。1: the positive control; 2: the negative control; 3: the blank; 4: transgenic corn mixture samples; 5: transgenic rice mixture samples; 6: transgenic rape mixture samples; 7: transgenic soybean mixture samples; 8: transgenic cotton mixture samples.

2.4 引物靈敏度篩選

靈敏度是指PCR反應(yīng)能夠檢測到的目的基因最低含量。引物與模板的結(jié)合效率是影響PCR反應(yīng)靈敏度的因素之一, 在其他因素相同的條件下, 設(shè)置ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、5%、1%、0.5%、0.1%的樣品及空白對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物電泳分析。由圖5可知: 5′-1、5′-5、3′-16在DNA模板1%及以上擴(kuò)增條帶明亮。5′-1、5′-5、3′-16在DNA模板0.5%擴(kuò)增條帶較弱, 但清晰可辨。5′-1、5′-5在DNA模板0.1%擴(kuò)增條帶隱約可見, 難以分辨; 3′-16在DNA模板0.1%擴(kuò)增條帶清晰可見。因此, 通過引物篩選,確定采用引物3′-16建立抗蟲玉米ND207轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法, 引物名稱為: ND207-F/ND207-R, PCR產(chǎn)物大小為166 bp, 滿足農(nóng)業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015的要求[12]。

圖5 引物靈敏度篩選Fig. 5 Screening for the primers sensitivity

2.5 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用最佳引物ND207-F/ND207-R, 對(duì)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因子引物濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化, 設(shè)置0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μmol L-16個(gè)引物濃度梯度, 退火溫度52℃、54℃、56℃、58℃和60℃ 5個(gè)溫度梯度進(jìn)行正交組合。由圖6可知: 引物濃度0.4～1.0 μmol L-1、退火溫度為56～60℃范圍, PCR反應(yīng)都能獲得較好的擴(kuò)增。綜合考慮與體系中其他標(biāo)準(zhǔn)方法的配合使用, 優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系見表4; 優(yōu)化的反應(yīng)程序?yàn)? 94℃變性5 min; 94℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共進(jìn)行35次循環(huán); 72℃延伸5 min。

圖6 PCR反應(yīng)的退火溫度和引物濃度測試Fig. 6 Test of PCR reaction temperature and primer concentration

表4 PCR反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

2.6 方法靈敏度測試

為了進(jìn)一步測試優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下方法的靈敏度, 設(shè)置7個(gè)濃度的樣品及空白對(duì)照,分別為ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%。由圖7可知: 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%及以上的樣品擴(kuò)增條帶典型, 且可以清晰辨識(shí), 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的樣品擴(kuò)增條帶亮度顯著下降, 不能清晰辨認(rèn), 空白對(duì)照無擴(kuò)增條帶。

圖7 方法的靈敏度測試Fig. 7 Test of method sensitivity

2.7 方法檢出限測試

根據(jù)靈敏度測試結(jié)果, 綜合考慮方法在使用時(shí)的穩(wěn)定性和適用性, 依據(jù)ENGL[14]對(duì)檢出限測試的要求, 隨機(jī)抽取60份ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的樣品進(jìn)行測試。由圖8可知, 60次反應(yīng)全部擴(kuò)出目的條帶, 由此可以確定普通PCR方法的檢出限為0.1%,以反應(yīng)體系中加入50 ng DNA模板進(jìn)行測算, 相當(dāng)于20個(gè)拷貝的ND207特異分子片段。

圖8 方法的檢出限測試Fig. 8 Test of method detection limit

2.8 方法再現(xiàn)性測試

方法的再現(xiàn)性是指在改變了測量條件的前提下,同一被測樣品的測量結(jié)果之間的一致性。不同實(shí)驗(yàn)室由2個(gè)不同操作人員, 用2臺(tái)不同品牌的PCR儀,對(duì)30份樣品進(jìn)行測試, 包括10份陽性樣品(ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)、10份陰性樣品(非轉(zhuǎn)基因混合物)、10份檢出限樣品(ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%)。由圖9可知: 外在條件改變不影響相同測試樣品的檢測結(jié)果, 陽性樣品電泳條帶明亮; 檢出限樣品電泳條帶清晰可辨; 陰性樣品無擴(kuò)增條帶。表明方法具有較好的再現(xiàn)性。

圖9 方法的再現(xiàn)性測試Fig. 9 Test of method reproducibility

2.9 方法的循環(huán)驗(yàn)證

為了充分驗(yàn)證方法的可行性, 邀請(qǐng)8家已通過“雙認(rèn)證”的轉(zhuǎn)基因生物安全檢測機(jī)構(gòu)對(duì)方法進(jìn)行循環(huán)驗(yàn)證, 8家單位分別對(duì)表5中11個(gè)樣品進(jìn)行ND207轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測, 每個(gè)樣品6個(gè)平行。8家單位實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5, 在陽性對(duì)照(ND207質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%)、1% ND207、0.1% ND207的樣品中擴(kuò)增出目的條帶(+), 其他樣品中無擴(kuò)增條帶(-)。8家單位對(duì)方法的循環(huán)驗(yàn)證結(jié)果表明: 本方法的主要技術(shù)參數(shù)(特異性、檢出限、再現(xiàn)性)全部符合農(nóng)業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015[12]、ENGL[13]和 SN/T 4561-2016[14]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求, 可作為標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測行業(yè)推廣應(yīng)用。

表5 ND207的轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法循環(huán)驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Cyclic verification for the event-specific PCR detection method for ND207

3 討論

轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)的實(shí)施開發(fā)了很多我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因品種, 目前大多品種已進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn), 面臨商業(yè)化推廣。為了將這些新的轉(zhuǎn)基因品種納入到監(jiān)管體系, 研制轉(zhuǎn)基因新品種的檢測方法尤為重要。轉(zhuǎn)基因玉米ND207是中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品種, 根據(jù)研發(fā)單位提供的資料, 研發(fā)者已經(jīng)完成T-DNA的測序及染色體定位,建立了ND207的鑒定方法, 但是研發(fā)者的鑒定方法沒有經(jīng)過方法測試, 且擴(kuò)增產(chǎn)物片段較大, 在應(yīng)用過程中可能會(huì)出現(xiàn)特異性差、靈敏度低及無法檢出深加工食品等問題。本研究克隆插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列, 避開了繁瑣的巢式PCR方法[15]、TAIL-PCR方法[16-17]、基因組步移法[18]等常用方法, 采用研發(fā)者提供的引物進(jìn)行組合, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序, 分別獲得了插入位點(diǎn)的受體玉米DNA序列及ND207兩端旁側(cè)序列, 通過序列比對(duì), 找到載體序列和受體玉米基因組序列的分界點(diǎn)。分別在載體序列和受體玉米基因組上各設(shè)計(jì)了7條引物, 組合成25對(duì)引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 選取擴(kuò)增效率好、特異性高、靈敏度好的引物進(jìn)行方法建立。在方法建立過程中,通過設(shè)置引物濃度及退火溫度梯度, 找到最優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件, 建立ND207的轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法, PCR產(chǎn)物片段大小為166 bp。對(duì)方法的靈敏度進(jìn)行測試, 確立方法的檢出限為0.1%, 約為20個(gè)拷貝的ND207特異分子片段,遠(yuǎn)低于歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因食品及飼料的標(biāo)識(shí)最低限量0.9%[19], 可滿足日常的檢測需要。

PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域的應(yīng)用產(chǎn)生了大量的國家標(biāo)準(zhǔn)方法, 轉(zhuǎn)基因成分檢測正在由定性向定量發(fā)展, 由普通PCR向?qū)崟r(shí)熒光PCR[20-21]和數(shù)字PCR[22-23]發(fā)展。目前, 檢測機(jī)構(gòu)仍然以普通PCR定性篩查為主, 如果檢出陽性, 再根據(jù)調(diào)控元件、標(biāo)記基因、目的基因信息鎖定轉(zhuǎn)化事件, 并進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)化體身份。隨著轉(zhuǎn)基因植物安全監(jiān)管政策的調(diào)整和科技進(jìn)步, 今后轉(zhuǎn)基因成分檢測將會(huì)逐步從定性檢測過渡到定量檢測, 即采用實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)化體的含量進(jìn)行定量。因此, 本研究將繼續(xù)研制ND207實(shí)時(shí)熒光PCR和數(shù)字PCR方法, 為ND207及其衍生品系的安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐, 進(jìn)一步完善我國的轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)體系。

4 結(jié)論

通過對(duì)ND207插入位點(diǎn)的序列分析, 獲取了ND207插入位點(diǎn)兩端旁側(cè)序列, 針對(duì)兩端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行篩選, 選取一對(duì)最佳引物優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件, 建立了ND207的轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測方法, PCR產(chǎn)物片段大小為166 bp。經(jīng)過測試, 該方法的檢出限為0.1%, 約為20個(gè)拷貝的ND207特異分子片段。

致謝:感謝農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心為本方法的研發(fā)提供試驗(yàn)材料, 并組織了方法的循環(huán)驗(yàn)證。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(太原), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(杭州), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(長春), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(合肥), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(哈爾濱), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物及產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(哈爾濱),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物及植物用微生物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(廣州), 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品及加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(天津)參加了本方法的循環(huán)驗(yàn)證, 特此致謝!