轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析揭示遮陰脅迫下甘薯的代謝響應(yīng)途徑

王雁楠陳金金卞倩倩胡琳琳張 莉尹雨萌喬守晨曹郭鄭康志河趙國(guó)瑞楊國(guó)紅楊育峰,*

1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 河南鄭州 450002;2鄭州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450001;3河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所, 河南鄭州 450002

甘薯(Ipomoea batatas(L.) Lam.)是重要的糧食、飼料、淀粉(及其制品)生產(chǎn)原料以及替代性生物能源作物, 我國(guó)甘薯種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。近年來(lái), 甘薯逐漸餐桌化, 成為人們調(diào)節(jié)飲食結(jié)構(gòu)的重要食物來(lái)源, 其種植效益也逐漸提升, 成為諸多地方鄉(xiāng)村振興的主推作物。在種植模式上, 甘薯經(jīng)常與玉米、煙葉、芝麻、果樹(shù)等進(jìn)行套種以充分利用空間和地力, 獲得更高的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。然而作為喜光作物, 甘薯在套種栽培模式中經(jīng)常處于低位被遮陰, 嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量的形成。同時(shí), 甘薯生長(zhǎng)中后期經(jīng)常面臨陰雨寡照天氣而影響其干物質(zhì)的積累。因此, 解析甘薯在遮陰脅迫下的代謝響應(yīng)途徑可為其耐蔭性品種改良提供理論依據(jù)。

一般認(rèn)為植物響應(yīng)遮陰的策略有避蔭性(shade avoidance)和耐蔭性(shade tolerance)[2]。典型的避蔭性反應(yīng)有葉片上仰、莖伸長(zhǎng)、減少分枝及葉片發(fā)育異常、早花等[3-4]。在遮陰條件下, 紅光/遠(yuǎn)紅光(R/FR)比值降低, 光敏色素變?yōu)榉羌せ顟B(tài)(Pr), 導(dǎo)致PIFs(phytochrome interacting factors, PIF4、PIF5、PIF7)的積累, 進(jìn)而激活生長(zhǎng)素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯、細(xì)胞分裂素以及乙烯合成(或運(yùn)輸)途徑中的E-box和G-box目標(biāo)基因, 從而促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)[5-6]。避蔭性反應(yīng)對(duì)于農(nóng)作物的生長(zhǎng)是不利的, 阻礙了植株生物量的擴(kuò)大和籽粒產(chǎn)量的增加[7]。耐蔭性則主要表現(xiàn)為比葉面積(specific leaf area, SLA)增加、葉綠素a/b比值降低以及增加光合系統(tǒng)II和光合系統(tǒng)I的比值,也就是增加碳源的獲取[8-9]。當(dāng)環(huán)境中的R/FR比值降低時(shí), 耐蔭性植物會(huì)通過(guò)不同植物激素的合成以及響應(yīng)來(lái)抑制自身的避蔭性反應(yīng), 同時(shí)還會(huì)觸發(fā)一些避蔭性反應(yīng)的拮抗調(diào)節(jié)因子。例如擬南芥屬于避蔭性植物, 但遮陰條件同樣會(huì)誘導(dǎo)其合成非典型性(非DNA結(jié)合性)的bHLH蛋白(如HFR1、PAR1、PAR2)來(lái)抵抗自身的避蔭性反應(yīng)[10-11]。遮陰條件在影響植物光合效率的同時(shí), 也會(huì)導(dǎo)致葉片的衰老, Brouwer等[12]的研究表明, 只有強(qiáng)遮陰條件會(huì)誘發(fā)葉片的衰老, 弱遮陰條件下擬南芥則會(huì)進(jìn)行光合作用的自適應(yīng)調(diào)節(jié)以及碳源的優(yōu)化分配。遮陰對(duì)農(nóng)作物的品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生顯著影響, 番茄葉片或果實(shí)遮陰顯著降低了果實(shí)中抗壞血酸的含量及其合成相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)而影響了番茄果實(shí)品質(zhì)[13]。黑暗遮陰后, “龍井43”茶葉中生物堿、兒茶素類及兒茶素二聚體類等物質(zhì)含量顯著上升, 氨基酸含量顯著下降, 酚氨比顯著上升[14]。

目前, 有關(guān)甘薯響應(yīng)遮陰脅迫的報(bào)道較少, 王慶美等[15-16]研究表明, 遮陰脅迫使紫心甘薯塊根總淀粉含量、淀粉積累速率、花青素含量顯著降低, 并從酶活角度探討了塊根淀粉品質(zhì)發(fā)生改變的主要原因。趙習(xí)武等[17]研究了不同遮陰處理對(duì)4種觀賞甘薯光合特性的影響, 認(rèn)為“黑美人”耐蔭性最強(qiáng)。周雅倩等[18]又利用主成分分析法對(duì)6種觀賞甘薯的耐弱光性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。蔣亞[19]對(duì)29個(gè)不同甘薯品種(系)進(jìn)行耐蔭性評(píng)價(jià), 測(cè)定分析了其中5個(gè)不同耐蔭性甘薯品種的農(nóng)藝性狀、光合特性、逆境生理等生理生化及產(chǎn)量品質(zhì)指標(biāo), 深入研究了甘薯對(duì)弱光的生理響應(yīng)?？梢钥闯? 甘薯耐蔭性相關(guān)研究主要集中在遮陰脅迫后甘薯的農(nóng)藝性狀及生理指標(biāo)變化方面,缺少對(duì)遮陰脅迫下整體代謝通路變化的研究。本研究以甘薯品種鄭紅23號(hào)為材料, 研究了遮陰處理對(duì)其生理指標(biāo)的影響, 并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析揭示了遮陰條件下甘薯的主要代謝響應(yīng)途徑, 為甘薯耐蔭性遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與遮陰處理方法

試驗(yàn)于2021年夏季在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院進(jìn)行,試驗(yàn)材料為甘薯品種鄭紅23號(hào)。剪取狀態(tài)一致的鄭紅23號(hào)大田莖尖苗8株(約20 cm, 3～4莖節(jié)), 用基質(zhì)土種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)并置于室外自然光下返苗, 待植株充分返苗且生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛時(shí)(17 d后)再進(jìn)行遮陰處理。返苗后取4株(重復(fù))采用聚乙烯遮陰網(wǎng)進(jìn)行遮陰處理(透光率約為50%), 其余4株置于自然光下生長(zhǎng)。遮陰15 d后進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定并取葉片樣品用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱, 生理指標(biāo)的測(cè)定均為4次生物學(xué)重復(fù)取平均值。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 葉綠素含量 取主莖同葉位功能葉0.2 g,切碎成細(xì)絲后裝入10 mL離心管, 加入10 mL 95%乙醇, 黑暗浸泡約48 h直至完全褪綠, 期間可搖晃試管, 此即為葉綠素浸提液。測(cè)定浸提液在665 nm(葉綠素a)及649 nm (葉綠素b)的吸光值, 空白溶液為95%乙醇。葉綠素a濃度Ca=13.95×A665-6.88×A649,葉綠素b濃度Cb=24.96×A649-7.32×A665, 色素含量(mg g-1FW)=色素的濃度(C)×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品鮮重。

1.2.2 葉片光合及葉綠素?zé)晒鈪?shù) 利用便攜式光合儀CIRAS-3測(cè)定光照和遮陰條件下鄭紅23號(hào)的光合相關(guān)參數(shù)。使用Pocket PEA植物效率分析儀(Hansatech)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù), 葉片進(jìn)行暗適應(yīng)20 min后, 避開(kāi)葉脈使葉片在飽和脈沖光3500 μmol m-2s-1中暴露1 s后, 測(cè)定葉綠素光系統(tǒng)PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSII潛在活性(Fv/Fo)和光合性能綜合指數(shù)(PIABS)。

1.2.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性 取同葉位成熟葉樣品, 使用索萊寶試劑盒(BC0175、BC0095)測(cè)定SOD和POD活性。

1.2.4 蔓長(zhǎng)、莖節(jié)數(shù)、比葉面積、根鮮重 用尺子測(cè)量光照和遮陰條件下鄭紅23號(hào)植株主莖從莖基部到頂芽的長(zhǎng)度即為蔓長(zhǎng), 同時(shí)測(cè)定主莖從莖基部到頂芽的莖節(jié)數(shù)。取各植株主莖同葉位功能葉,用打孔器(打孔半徑0.25 cm)在其上取40個(gè)圓片,80℃烘干16 h至恒重, 比葉面積(cm2g-1)=葉片面積/葉片干重。將植株從營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)小心挖出, 將根系洗凈晾干后稱量鮮重。

1.3 轉(zhuǎn)錄組、代謝組聯(lián)合分析

遮陰結(jié)束后取光照和遮陰條件下的葉片樣品液氮凍存, 每處理包括4棵植株, 每植株取3片葉混合。由北京諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及類靶向代謝組的分析。

采用Illumina Novaseq平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序,使用HISAT2將clean reads與甘薯近緣野生種Ipomoea triloba(I. triloba)的參考基因組(http://sweetpotato.uga.edu/index.shtml)進(jìn)行比對(duì)。featureCounts(1.5.0-p3)用于計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù), 然后根據(jù)基因的長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM, 用DEseq2檢測(cè)差異表達(dá)基因(DEGs), 用clusterProfiler (3.8.1)軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO富集和KEGG富集。

采用LC-MS方法對(duì)代謝組進(jìn)行檢測(cè), 代謝物的鑒定基于諾禾致源自建數(shù)據(jù)庫(kù)novoDB, 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)對(duì)試驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè), 采用SCIEX OSV1.4軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行分析并得到代謝物定性和定量結(jié)果, 使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)和LIPIDMaps數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定到的代謝物進(jìn)行注釋。使用R語(yǔ)言進(jìn)行火山圖繪制、聚類熱圖繪制、差異代謝物相關(guān)性分析、氣泡圖繪制。之后對(duì)差異代謝物與差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖, 采用SPSS19.0進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)形態(tài)及生理指標(biāo)的影響

從圖1及表1可以看出, 鄭紅23號(hào)在50%透光率的遮陰脅迫下仍然能正常生長(zhǎng), 但是其蔓長(zhǎng)相較于自然光照下顯著增加, 莖節(jié)數(shù)則變化不顯著, 說(shuō)明莖節(jié)顯著伸長(zhǎng); 遮陰脅迫下葉片變大, 比葉面積顯著增加; 此外, 自然光照下的鄭紅23號(hào)已出現(xiàn)膨大塊根, 而遮陰脅迫下植株根系仍以須根為主, 根鮮重顯著降低。從表1同時(shí)看出, 遮陰脅迫顯著提高了鄭紅23號(hào)葉片SOD酶和POD酶的活性。

表1 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)植株形態(tài)指標(biāo)及葉片酶活的影響Table 1 Effects of shade stress on plant morphological indexes and leaf enzymatic activity of Zhenghong 23

圖1 鄭紅23號(hào)自然光照與遮陰脅迫下的植株形態(tài)對(duì)比Fig. 1 Comparison of plant morphology of Zhenghong 23 under natural light and shade stress

從表2可知, 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)葉綠素a的含量沒(méi)有顯著影響, 葉綠素b以及總?cè)~綠素含量在遮陰后均顯著提高, 葉綠素a/b則顯著下降。葉綠素光系統(tǒng)PSII最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSII潛在活性(Fv/Fo)和光合性能綜合指數(shù)(PIABS)在遮陰脅迫下均顯著下降。光合參數(shù)方面(表3), 遮陰脅迫顯著降低了鄭紅23號(hào)的凈光合速率和水分利用效率, 胞間CO2濃度顯著提高, 蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度以及水汽壓虧缺在遮陰脅迫下則未發(fā)生顯著變化。說(shuō)明, 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)的植株形態(tài)及生理指標(biāo)均發(fā)生了顯著影響。

表2 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)葉綠素含量(mg g-1FW)及熒光特性的影響Table 2 Effects of shade stress on chlorophyll content (mg g-1FW) and fluorescence characteristics of Zhenghong 23

表3 遮陰脅迫對(duì)鄭紅23號(hào)光合參數(shù)的影響Table 3 Effects of shade stress on photosynthetic parameters of Zhenghong 23

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量分析

為研究鄭紅23號(hào)響應(yīng)遮陰脅迫的主要代謝途徑, 對(duì)遮陰脅迫(shade, S)和自然光照(light, L)下的葉片樣品進(jìn)行了RNA-seq。結(jié)果表明, 相同生物學(xué)重復(fù)間相關(guān)性較好,R2范圍在0.852～1.000; 遮陰和光照樣品間相關(guān)系數(shù)R2范圍在0.729～0.839 (圖2-a)。8個(gè)樣品RNA-seq文庫(kù)獲得的Clean reads同甘薯近源野生二倍體I. triloba基因組的比對(duì)率在69.64%～72.72%, 比對(duì)到單一位置的比例在67.16%～70.06%。各樣品Q30堿基百分比在92.72%～93.30%。說(shuō)明試驗(yàn)取樣合理, RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠(表4)。

表4 樣品RNA-seq質(zhì)量Table 4 RNA-seq quality of samples

圖2 RNA-seq樣品相關(guān)性熱圖(a)及代謝組各樣品間的主成分分析(b)Fig. 2 Heatmap of the Pearson correlation between RNA-seq samples (a) and principal component analysis plots of samples in metabolome (b)S: 遮陰; L: 光照。S: shade treatment; L: light treatment.

2.3 差異表達(dá)基因分析

RNA-seq結(jié)果表明, 遮陰脅迫下(S)鑒定出19,888個(gè)表達(dá)基因, 自然光照下(L)鑒定出20,050個(gè)表達(dá)基因, 其中二者共表達(dá)基因數(shù)為18,889個(gè)(圖3-a)。以|log2(Fold Change)|≥1且Padj≤0.05為標(biāo)準(zhǔn), S vs. L共篩選出2632個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),包含715個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和1917個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(圖3-b)。

圖3 遮陰脅迫和自然光照下鑒定出的表達(dá)基因數(shù)(a)和差異表達(dá)基因數(shù)(b)Fig. 3 Number of total genes (a) and DEGs (b) identified under shade stress and natural light conditionsS: 遮陰; L: 光照。S: shade treatment; L: light treatment.

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集, 共1666個(gè)基因被顯著富集于70個(gè)功能類中, 富集顯著性最高的3個(gè)功能類依次為cell periphery、calcium ion binding和protein ubiquitination, 而富集差異基因數(shù)最多的功能類則為 DNA-binding transcription factor activity (81個(gè)) (圖4-a)。KEGG通路富集分析顯示, 富集顯著性排名前3的通路依次為plantpathogen interaction、phenylpropanoid biosynthesis和pentose and glucuronate interconversions, 分別富集到57個(gè)、42個(gè)以及19個(gè)DEGs (圖4-b)。富集結(jié)果說(shuō)明遮陰脅迫對(duì)甘薯造成了復(fù)雜的分子生物學(xué)影響。

圖4 差異表達(dá)基因GO富集中顯著性排名前30的功能類(a)和KEGG富集中顯著性排名前20的通路(b)Fig. 4 Top 30 function terms significantly enriched by GO (a) and the top 20 pathways significantly enriched by KEGG (b)BP: 生物過(guò)程; CC: 細(xì)胞組成; MF: 分子功能。柱上數(shù)字代表富集到的差異基因個(gè)數(shù)?？v坐標(biāo)為顯著性水平, 數(shù)值越高越顯著。BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function. Numbers of DEGs enriched are marked above the bars. The higher the ordinate value is, the more significant the enrichment is.

2.4 差異代謝物分析

代謝組數(shù)據(jù)表明, 在S和L組樣品中共檢測(cè)出1185種代謝物, 主成分分析(PCA)結(jié)果表明, 第一主成分能解釋總方差的42.69%, 第二主成分能解釋總方差的17.63%, 兩者可將不同處理明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖2-b)。以VIP＞1.0、差異倍數(shù)FC＞1.5或FC＜0.667且P-value＜0.05為條件篩選出差異代謝物(differential metabolite, DM) 420種, S vs. L顯著上調(diào)的有113種, 顯著下調(diào)的有307種。對(duì)差異顯著性排名前20的DMs進(jìn)行相關(guān)性分析, 結(jié)果顯示不同DMs之間正(負(fù))相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值在0.673～0.999,相關(guān)性較高, 說(shuō)明差異顯著的DMs間趨同(異)變化明顯(圖5-a)。KEGG通路富集顯示, 差異代謝物主要富集于galactose metabolism、flavone and flavonol biosynthesis和alpha-linolenic acid metabolism, 分別富集到14個(gè)、8個(gè)以及3個(gè)DMs (圖5-b)。

圖5 Top20差異代謝物相關(guān)性圖(a)及差異代謝物KEGG富集氣泡圖(b)Fig. 5 Correlation chart of the Top20 DMs (a) and the bubble chart of the KEGG enrichment of DMs (b)(a) 紅色代表正相關(guān), 藍(lán)色代表負(fù)相關(guān), 沒(méi)有顏色的點(diǎn)表示無(wú)顯著相關(guān)性(P＞ 0.05)。(b) 氣泡顏色與大小代表富集可信度及富集到的差異代謝物數(shù)目。-log10(P-value)越大, 富集可信度越高。S: 遮陰; L: 光照。(a): the red shape indicates the positive correlation and blue indicates the negative correlation. The dot with no color means the correlation is not significant atP＞ 0.05. (b): the color and size of the bubble represent the enrichment reliability and the number of DMs enriched, respectively. The bigger the -log10(P-value) is, the more reliable the enrichment is. S: shade treatment; L: light treatment.

2.5 轉(zhuǎn)錄組與代謝組關(guān)聯(lián)分析

為確定DMs與DEGs的相關(guān)性, 對(duì)二者基于皮爾森相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析, 相關(guān)系數(shù)小于0時(shí),為負(fù)相關(guān); 大于0時(shí), 為正相關(guān)。圖6-a展示了Top50的DMs與Top100的DEGs之間的相關(guān)性分析, 可以看出, DMs與DEGs之間更多地表現(xiàn)為正相關(guān), 且同一DM與不同DEGs的相關(guān)性方向(正/負(fù))保持一致。對(duì)DMs和DEGs分別進(jìn)行KEGG富集后獲得二者的共有富集通路(圖6-b), 可信度排名前十的代謝通路為半乳糖、α-亞麻酸、單萜、淀粉和蔗糖、鞘脂、葉酸、精氨酸、糖酵解及糖異生、苯丙素、亞油酸。其中可能與植物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的途徑主要有半乳糖、淀粉和蔗糖、鞘脂、精氨酸、糖酵解及糖異生、苯丙素。

(圖6)

苯丙素合成途徑富集到的42個(gè)DEGs共編碼5種酶: beta-Glucosidase、SAM-dependent methyltransferase、peroxidase、phenylalanine ammonia-lyase、UDP-glucosyl transferase。該途徑共檢測(cè)到7個(gè)DMs, 除spermidine外, 其余代謝物均在遮陰脅迫下含量降低(圖7-a), DEGs與DMs間的相關(guān)性均達(dá)到了顯著水平(圖7-b)。半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解及糖異生均與糖代謝相關(guān), 合并去重后3個(gè)途徑共篩選到38個(gè)DEGs和19個(gè)DMs,38個(gè)DEGs共編碼20種酶。19個(gè)差異代謝物中僅UDP-galactose和phosphoenolpyruvate在遮陰脅迫下含量提高, 其他均含量降低(圖8-a), DEGs與DMs間的相關(guān)性也均達(dá)到了顯著水平(圖8-b)。鞘脂類物質(zhì)是生物膜的主要結(jié)構(gòu)成分, 同時(shí)參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和脅迫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20-21], 本研究中遮陰脅迫下鞘脂類物質(zhì)磷酸乙醇胺(O-phosphorylethanolamine)和4-羥基鞘氨醇(4-D-hydroxysphinganine)含量分別是自然光照下的5.19倍和1.68倍。精氨酸是植物多胺、一氧化氮、脯氨酸、谷氨酸、氨基丁酸等的生物合成前體, 而多胺、一氧化氮?jiǎng)t作為信號(hào)分子廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)[22]。遮陰脅迫下精氨酸合成途徑中的鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸和精氨酸分別是自然光照下的8.63倍、4.31倍和1.43倍, 而谷氨酰胺(L-glutamine)、精氨基琥珀酸(L-argininosuccinate)以及酮戊二酸(ketoglutaric acid)的含量則有所下降。

圖7 苯丙素合成途徑DMs的含量熱圖(a)以及DMs與DEGs之間的相關(guān)性熱圖(b)Fig. 7 Content heatmap of DMs enriched in the phenylpropanoid biosynthesis pathway (a) and correlation heatmap of the DMs and DEGs enriched in this pathway (b)

圖8 糖代謝相關(guān)途徑DMs的含量熱圖(a)以及DMs與DEGs之間的相關(guān)性熱圖(b)Fig. 8 Content heatmap of DMs enriched in the sugar metabolism related pathways (a) and correlation heatmap of the DMs and DEGs enriched in these pathways (b)

3 討論

3.1 遮陰對(duì)甘薯形態(tài)及生理指標(biāo)的影響

通過(guò)對(duì)甘薯品種鄭紅23號(hào)進(jìn)行遮陰脅迫處理發(fā)現(xiàn), 其蔓長(zhǎng)、比葉面積、根鮮重、SOD和POD活性、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合參數(shù)等形態(tài)和生理指標(biāo)與自然光照相比均發(fā)生了顯著變化。葉綠素a/b顯著降低、比葉面積顯著增加以及總?cè)~綠素含量的顯著增加都是植株為了獲取更多的碳源而出現(xiàn)的耐蔭性響應(yīng), 而蔓長(zhǎng)、莖節(jié)數(shù)的增加則是避蔭性反應(yīng)[2,9]。一般認(rèn)為, 葉綠素a主要吸收長(zhǎng)波光, 而葉綠素b主要吸收短波光, 較大比例的葉綠素b更有利于吸收弱光中占優(yōu)勢(shì)的藍(lán)紫光。蔣亞[19]研究表明, 遮陰處理顯著提高了5個(gè)甘薯品種的葉綠素b及總?cè)~綠素含量, 其中4個(gè)品種的葉綠素a含量顯著提高, 葉綠素a/b則均顯著降低, 這與本研究結(jié)果一致。李偉等[23]對(duì)黃瓜幼苗進(jìn)行弱光脅迫后, 葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素均極顯著提高; 凈光合效率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和水分利用效率顯著降低, 胞間CO2濃度則顯著提高; 光系統(tǒng)PSII中Fv/Fm呈增大趨勢(shì)。而付景[24]研究表明, 玉米在遮陰脅迫下吐絲期葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量以及葉綠素a/b較自然光照均呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化?？梢?jiàn), 光合系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)弱光脅迫時(shí)因物種及其發(fā)育階段而異。在正常光照或強(qiáng)光照下, 植物葉片通常發(fā)育較厚, 比葉面積值(SLA)較低, 而低SLA值也意味著在弱光條件下單位質(zhì)量的葉片具有較低的光源捕獲面積。因此, 植物在弱光下會(huì)提高SLA值從而獲取更多光能[25]。本研究中, 鄭紅23號(hào)的SLA值在遮陰脅迫下是正常光照下的2.16倍, 達(dá)到極顯著差異, 說(shuō)明遮陰觸發(fā)了其強(qiáng)烈的耐蔭性響應(yīng)以通過(guò)光合作用獲取更多碳源。然而弱光下的碳源獲取仍不能支撐其根系的膨大, 遮陰脅迫下鄭紅23號(hào)的平均根鮮重僅為1.2 g, 而光照條件下為17.9 g,根系已明顯開(kāi)始膨大(圖1), 說(shuō)明遮陰對(duì)鄭紅23號(hào)的產(chǎn)量影響較大。

3.2 苯丙素合成途徑對(duì)甘薯遮陰脅迫的響應(yīng)

苯丙素合成途徑以苯丙氨酸(莽草酸合成途徑終產(chǎn)物)為起始, 涉及到的芳香類代謝物有8000余種, 光照、葡萄糖、溫度、鹽、干旱、病菌侵染、昆蟲(chóng)取食等都能調(diào)控苯丙素合成途徑, 而其最主要的分支途徑為木質(zhì)素合成途徑和類黃酮合成途徑[26-27]。植物在受到鹽、干旱等非生物脅迫時(shí), 體內(nèi)會(huì)積累活性氧(ROS), 而ROS會(huì)對(duì)植物造成二次傷害。轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合代謝組分析表明, 苦豆子在受到鹽脅迫后會(huì)觸發(fā)苯丙素合成途徑中木質(zhì)素類和類黃酮類物質(zhì)的合成, 二者會(huì)參與到根部ROS的清除[28]。超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶, 在植物受非生物脅迫時(shí)其活性會(huì)提高從而起到清除體內(nèi)活性氧、維持氧化還原平衡的作用[29-30], 而POD也是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵調(diào)控酶。本研究轉(zhuǎn)錄代謝聯(lián)合分析表明, 苯丙素合成途徑中富集到的上調(diào)差異表達(dá)基因多數(shù)為POD酶家族基因, 同時(shí), 鄭紅23號(hào)在遮陰脅迫下的SOD活性和POD活性均顯著高于自然光照條件(表3), 說(shuō)明遮陰脅迫使鄭紅23號(hào)體內(nèi)積累了ROS并觸發(fā)了活性氧清除系統(tǒng)。亞精胺(spermidine)是植物體內(nèi)一種常見(jiàn)的多胺物質(zhì), 具有重要的生理活性, 廣泛參與植物逆境脅迫響應(yīng)(鹽、干旱、機(jī)械損傷、低溫、水淹、重金屬), 其可通過(guò)激活抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)來(lái)參與調(diào)節(jié)脅迫條件下植物體內(nèi)的活性氧穩(wěn)態(tài)[31-32]。同時(shí), 外施多胺類物質(zhì)也可提高植物對(duì)非生物逆境的抗性[33-34]。本研究中, 遮陰脅迫下亞精胺的平均含量是自然光照下的2.22倍, 說(shuō)明亞精胺可能通過(guò)提高植株的抗氧化能力來(lái)參與甘薯的遮陰脅迫響應(yīng)。

3.3 糖代謝相關(guān)途徑對(duì)甘薯遮陰脅迫的響應(yīng)

糖代謝不僅是植物的能量來(lái)源也為其提供了重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)組成元件, 許多種類的糖還能與蛋白質(zhì)等結(jié)合成復(fù)雜的化合物(如糖蛋白)而參與到細(xì)胞識(shí)別和細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬顒?dòng), 調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)不良環(huán)境[35-36]。轉(zhuǎn)錄組DEGs和代謝組DMs的KEGG共有富集途徑中排名靠前的有3個(gè)和糖代謝相關(guān), 分別為半乳糖代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、糖酵解和糖異生途徑, 3個(gè)途徑富集到的38個(gè)DEGs中有26個(gè)在遮陰脅迫后下調(diào)表達(dá), 19個(gè)DMs中有17個(gè)在遮陰脅迫后含量降低, 說(shuō)明遮陰脅迫降低了甘薯植株的糖代謝水平。其中11個(gè)下調(diào)DEGs編碼了與淀粉代謝直接相關(guān)的8種酶, 與淀粉合成相關(guān)的為 PGM (EC 5.4.2.2)、ADPG (EC 2.7.7.27)、SSS 1/3/4 (EC 2.4.1.21)以及GBSS (EC 2.4.1.242), 與淀粉降解相關(guān)的為α/β-Amylase (EC 3.2.1.1/EC 3.2.1.2), 說(shuō)明遮陰脅迫對(duì)甘薯的淀粉合成與降解均有抑制作用。此外, 蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、棉籽糖等重要的可溶性糖在遮陰脅迫下的含量均不同程度下降。遮陰脅迫下葉片糖代謝水平的下降也直接導(dǎo)致了向根部運(yùn)輸?shù)奶纪锏臏p少以及塊根膨大受阻(圖1)。而對(duì)玉米的研究也表明, 弱光脅迫下, 蔗糖-淀粉轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性降低,淀粉合成不足, 籽粒充實(shí)度較差, 導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低[37]。甘薯是喜光作物, 遮陰對(duì)其糖代謝產(chǎn)生了負(fù)面影響, 而對(duì)于某些喜陰植物如胡椒, 當(dāng)遮陰度為30%左右時(shí), 可以促進(jìn)糖積累, 為花芽發(fā)育提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)[38]。同為地下根莖類植物, 中藥材白及在強(qiáng)光環(huán)境下會(huì)受到脅迫, 影響產(chǎn)量和品質(zhì), 而50%遮陰處理則會(huì)提高白及葉片光合能力和糖物質(zhì)積累, 塊莖產(chǎn)量顯著提高, 蛋白組學(xué)顯示遮陰和光照條件下的差異蛋白主要富集于光合作用、碳代謝、糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑等[39]。這說(shuō)明遮陰脅迫對(duì)喜光植物和喜陰植物的糖代謝途徑造成了相反的結(jié)果, 而這其中的關(guān)鍵調(diào)控因素則有待進(jìn)一步研究。

3.4 鞘脂及精氨酸代謝途徑對(duì)甘薯遮陰脅迫的響應(yīng)

鞘脂構(gòu)成了植物細(xì)胞膜至少40%的脂質(zhì)成分,而植物內(nèi)膜系統(tǒng)(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡)同樣富含鞘脂[20]。植物鞘脂主要包括鞘氨醇即長(zhǎng)鏈基團(tuán)(LCBs)、神經(jīng)酰胺、葡萄糖神經(jīng)酰胺以及糖基肌醇磷酸神經(jīng)酰胺。鞘脂代謝廣泛參與到植物對(duì)生物或非生物脅迫的響應(yīng)。鞘氨醇含量的增加能夠增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性,而鞘氨醇-1-磷酸(LCB-1P)能參與調(diào)節(jié)植物氣孔的開(kāi)閉, 并參與到脫水、低溫脅迫響應(yīng)[40-43]。4-羥基鞘氨醇也即植物鞘氨醇(phytosphingosine)是植物中主要的鞘氨醇長(zhǎng)鏈基團(tuán), 干旱脅迫下, 植物鞘氨醇含量在耐旱型櫻桃砧木中顯著提高, 可作為櫻桃砧木的抗旱標(biāo)志代謝物[44]。本研究中4-羥基鞘氨醇在遮陰脅迫下的含量是正常光照下的1.68倍, 說(shuō)明遮陰脅迫誘導(dǎo)了甘薯葉片中膜脂成分的變化, 從而使植株更加適應(yīng)遮陰環(huán)境。同時(shí), 遮陰脅迫下磷酸乙醇胺的含量是自然光照的5.19倍, 而磷酸乙醇胺是植物生物膜組分磷脂酰膽堿的合成前體, 后者對(duì)維持生物膜的功能有重要作用[45]。以上結(jié)果說(shuō)明甘薯植株能通過(guò)改變生物膜脂質(zhì)成分來(lái)響應(yīng)遮陰脅迫, 從而提高其在遮陰脅迫下的生存能力。

精氨酸及其代謝產(chǎn)物鳥(niǎo)氨酸是一些逆境相關(guān)信號(hào)分子如多胺、脯氨酸、谷氨酸等的合成前體物質(zhì),因此, 精氨酸代謝通路在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[46]。精氨酸可在精氨酸酶的催化下單向水解生成鳥(niǎo)氨酸和尿素, 鳥(niǎo)氨酸進(jìn)而可生成瓜氨酸,而瓜氨酸經(jīng)過(guò)兩步催化又可生成精氨酸。同時(shí), 精氨酸酶是植物精氨酸代謝的關(guān)鍵酶之一, 其基因主要通過(guò)JA和ABA途徑參與響應(yīng)鹽、干旱、病害等(非)生物脅迫[47-49]。本研究中, 遮陰脅迫下鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸和精氨酸分別是光照條件下的8.63倍、4.31倍和1.43倍, 多氨類物質(zhì)精氨是光照條件下的1.51倍,而精氨酸酶基因的表達(dá)量則是光照條件下的1.91倍,說(shuō)明遮陰脅迫誘導(dǎo)了精氨酸酶基因的表達(dá)并將精氨酸更多地催化生成鳥(niǎo)氨酸, 而鳥(niǎo)氨酸可能會(huì)進(jìn)一步參與到多胺類抗逆因子的合成中從而使植株增強(qiáng)對(duì)遮陰脅迫的適應(yīng)能力。

4 結(jié)論

本研究以鄭紅23號(hào)為材料通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析首次解析了遮陰脅迫下甘薯的代謝響應(yīng)途徑。遮陰脅迫下鄭紅23號(hào)的植株形態(tài)、葉片光合能力、葉綠素含量、抗氧化酶活性以及塊根膨大均受到了顯著影響。轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析表明,苯丙素合成途徑、糖代謝相關(guān)途徑、鞘脂和精氨酸代謝途徑是甘薯響應(yīng)遮陰脅迫的主要代謝途徑。苯丙素途徑中的POD酶家族基因被廣泛激活, 提高了植株遮陰脅迫下的抗氧化能力。同時(shí), 遮陰脅迫降低了葉片糖代謝水平, 淀粉的合成和降解均受到抑制, 可溶性糖含量下降, 導(dǎo)致了向根部運(yùn)輸?shù)奶纪锏臏p少以及塊根膨大受阻。而鞘脂及精氨酸代謝途徑則可能通過(guò)提高生物膜的穩(wěn)定性以及增加多胺類抗逆因子的合成底物來(lái)使植株更好地適應(yīng)遮陰脅迫。以上結(jié)果為理解遮陰脅迫下甘薯的代謝響應(yīng)途徑提供了新的理論依據(jù)。