谷子毛狀根誘導方法的建立與優(yōu)化

萬夷曼 肖圣慧 白依超 范佳音 王 琰 吳長艾

山東農業(yè)大學生命科學學院, 山東泰安 271000

谷子(Setaria italicaL.)是重要的禾本科糧飼作物, 具有適應性廣、營養(yǎng)豐富、節(jié)水性突出、生長周期短、基因組小、二倍體自花授粉和單穗結實多等特點, 已成為研究C4光合作用、非生物響應和生物能產生的模式作物[1], 也是未來確保全球糧食安全和營養(yǎng)健康的重要作物[2]。對谷子基因組學、農藝性狀形成和遺傳機制的研究具有重要價值[3-4]。

根癌農桿菌介導谷子遺傳轉化的最大困難是基因依賴性以及農桿菌對谷子的低敏感性[5-6]。干燥成熟的谷子種子作為外植體, 利用根癌農桿菌介導谷子遺傳轉化效率達19.2%[7]。一種谷子新品種xiaomi誘導胚性愈傷組織作為外植體, 利用根癌農桿菌介導的xiaomi遺傳轉化效率約達23.28%[3]。以冀谷11谷子幼穗為外植體, 抗性愈傷組織獲得率為16.4%[8]。但根癌農桿菌介導的谷子遺傳轉化體系耗時較長, 需要4到5個月才可獲得轉基因幼苗, 且對谷子品種要求比較嚴格[9]。因此, 建立一種普遍適用且高效快捷的谷子遺傳轉化體系對谷子基因功能研究至關重要。

發(fā)根農桿菌攜帶的Ri質粒通過感染植物損傷部位, 可誘導產生大量生長迅速和毛狀分支多的毛狀根[10]。另外, 由于具有遺傳穩(wěn)定、激素自主性、分化程度高和次生代謝產物含量高等特點[11], 毛狀根在農作物育種、醫(yī)藥合成、環(huán)境修復以及基因功能研究等方面具有廣泛應用[12-15]。發(fā)根農桿菌介導的遺傳轉化, 已在多種植物中獲得成功, 如玉米(Zea maysL.)[16]、大豆(Glycine maxL.)[17]、棉花(Gossypium hirsutumL.)[18]、菠菜(Spinacia oleraceaL.)[19]和向日葵(Helianthus annuusL.)[20]。而發(fā)根農桿菌介導的谷子發(fā)根誘導體系未見報道。

研究表明, 發(fā)根農桿菌介導植物產生毛狀根的效率受乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、菌液濃度和共培養(yǎng)時間等多種因素影響。巴戟天(Morinda officinalisHow.)毛狀根誘導時, 在侵染液中加入300 μmol L-1AS誘導毛狀根的效率最高, 誘導率達到36.7%, 而加入AS的濃度低于100 μmol L-1時, 對誘導效率影響不大[21]。鉤藤(Uncaria rhynchophylla(Miq.) Jacks)毛狀根在加入100 μmol L-1AS時誘導率達54.76%; 加入200 μmol L-1AS的鉤藤毛狀根轉化效率為0[22]?？梢? 適量的乙酰丁香酮可以提高毛狀根的誘導效率。杜梨(Pyrus betulifoliaBunge)毛狀根誘導產生需要的菌液濃度OD600值為0.3～0.4[23];虎杖(Polygonum cuspidatum)毛狀根誘導產生需要的菌液濃度OD600值為0.8[24]。因此, 毛狀根誘導過程中選擇適合的菌液濃度也是至關重要的。此外, 共培養(yǎng)時間過短, 發(fā)根農桿菌不易附著并進入植物細胞, 導致毛狀根誘導效率低; 而共培養(yǎng)時間過長可導致外植體死亡, 從而導致毛狀根誘導效率降低[25]。這些研究為發(fā)根農桿菌介導的谷子發(fā)根誘導體系的建立提供了很好的參考。

CBL (calcineurin B-like proteins)是植物中一類Ca2+感應蛋白[26], CBL及其互作蛋白CIPK (CBLinteracting protein kinase)構成CBL-CIPK信號系統,在植物應對干旱、鹽漬、低溫等逆境脅迫響應中起重要作用[27]。在谷子中,SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7受高鹽脅迫誘導表達[28]。NHX家族蛋白含有Na+/H+exchange (PF00999)蛋白結構域, 主要參與調控細胞內的離子重建和pH平衡, 在植物生長、發(fā)育和鹽脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用[29-30]。研究發(fā)現狗尾草(Setaria viridis) NHX介導Na+的吸收過程[31]。DVL編碼一類小肽, 具有功能多效性。擬南芥(Arabidopsis thaliana)DVL1過表達株系株高變矮、葉片變圓、花簇生、花梗和果莢變短等[32]。苜蓿(Medicago sativaL.) DVL還介導根瘤形成[33]。谷子DVL、SiNHX和SiCBL的生物學功能研究較少。因此, 本研究通過比較谷子外植體、品種、乙酰丁香酮、菌液濃度和共培養(yǎng)時間對發(fā)根農桿菌K599介導的毛狀根誘導效率及遺傳轉化效率的影響, 建立了一種高效的谷子毛狀根遺傳轉化體系。并利用實驗室已有載體, 通過蛋白亞細胞定位和基因功能鑒定證明了該技術體系在谷子基因功能鑒定中的可行性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

谷子品種Ci846和豫谷1號(Yugu 1)種子來自中國農業(yè)科學院種質資源保存中心, 龍珠1號種子來自章丘創(chuàng)新源農作物種植專業(yè)合作社,xiaomi種子來自山西農業(yè)大學雜糧育種團隊, 噸谷種子購于育種銷售市場; 后期由實驗室自行繁殖保存。

1.2 菌株

發(fā)根農桿菌K599菌種購于上海唯地生物技術有限公司, 后期由實驗室自行保存。

1.3 谷子芽尖外植體培養(yǎng)

挑選100粒均勻飽滿的谷子種子, 用砂紙除去麩皮。無菌條件下進行種子表面消毒: 先用10 mL 75%酒精消毒5 min, 10 mL 0.1%吐溫水沖洗2次; 后依次用10 mL 2.6%次氯酸鈉消毒3 min, 10 mL 0.1%吐溫水沖洗3次, 10 mL無菌水沖洗5次; 然后將種子用無菌濾紙吸干, 用無菌牙簽點于MS培養(yǎng)基,25℃±1℃黑暗培養(yǎng)3 d。取4～7 mm嫩黃色芽尖用于發(fā)根誘導。

1.4 谷子胚性愈傷組織培養(yǎng)

將消毒晾干的種子點于含4.0 mg L-12,4-D和1.0 mg L-16-BA的MS培養(yǎng)基上, 25℃±1℃黑暗培養(yǎng)30 d (期間每10 d更換1次新鮮培養(yǎng)基), 誘導胚性愈傷組織, 取淡黃色緊致的胚性愈傷組織用于發(fā)根誘導。

1.5 毛狀根誘導條件的選擇

1.5.1 外植體選擇 各取谷子50個芽尖和50塊愈傷組織外植體于20 mL無菌水懸浮的菌體中(OD600= 0.5) 15 min, 將外植體置于毛狀根誘導基礎培養(yǎng)基。

1.5.2 乙酰丁香酮對毛狀根誘導產生的影響 40個龍珠1號芽尖外植體分別于20 mL 1/2 MS或含有50、100、150、200 μmol L-1乙酰丁香酮的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸浮菌體(OD600= 0.5) 15 min。

外出學習使她產生“頓悟”，教學技巧、課堂管理和“教書育人”的教育信念也隨之改變。比如，她的備課方法和教案寫法有了改觀，教學技巧、組織課堂的方法和教學效果都有很大提高。她對外語教育的意義有了新認識。這個階段的職業(yè)發(fā)展特點是主動探索外語的教育功能，體現出積極性和主觀能動性。教師信念構建體現為對教育信念的反思和探索。

1.5.3 菌液濃度對毛狀根誘導的影響 40個龍珠1號芽尖外植體分別于OD600為0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0的含有100 μmol L-1AS的1/2 MS液體培養(yǎng)基中15 min。

1.5.4 暗培養(yǎng)時間對毛狀根誘導的影響 200個龍珠1號芽尖外植體于20 mL含100 μmol L-1AS的1/2 MS液體培養(yǎng)基(OD600= 0.5)中15 min, 然后將芽尖外植體分為5組(每組40個芽尖外植體)置于毛狀根誘導基礎培養(yǎng)基, 分別暗培養(yǎng)1、2、3、4和5 d。

1.6 相關培養(yǎng)基配置及培養(yǎng)條件

谷子芽尖外植體誘導培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂。谷子愈傷組織誘導培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+4.0 mg L-12,4-D+1.0 mg L-16-BA+8 g L-1瓊脂粉。毛狀根誘導基礎培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂。毛狀根誘導擴繁培養(yǎng)基: 4.42 g L-1MS+30 g L-1蔗糖+8 g L-1瓊脂+300 mg L-1特美汀。探究乙酰丁香酮對毛狀根誘導的培養(yǎng)基: 1/2 MS+15 g L-1蔗糖+0、50、100、150、200 μmol L-1乙酰丁香酮。以上培養(yǎng)基的pH均為5.8, 121℃高溫高壓滅菌20 min。

培養(yǎng)條件: 光照培養(yǎng)箱溫度25 ±1 ,℃ ℃ 光周期為光照16 h/黑暗8 h, 光照強度為125 μmol m-2s-1,培養(yǎng)時間15 d。每個處理包括40個外植體, 統計30個外植體的數據, 包括毛狀根的根長、毛狀根誘導率和平均生根數, 3次重復試驗。

1.7 谷子SiDVL1和SiDVL3表達載體構建及定位分析

設計SiDVL1(Seita.2G169800.1)和SiDVL3(Seita.3G159000.1)特異引物, 分別通過PCR技術擴增目的基因cDNA, 利用同源重組的方法將目的基因與載體pCAMBIA1305.1連接, 獲得目的基因融合GFP的表達載體。將35S::SiDVL1-GFP和35S::SiDVL3-GFP表達載體轉化EHA105感受態(tài)細胞和K599感受態(tài)細胞, 轉化方法見上海唯地生物技術公司的感受態(tài)使用說明書。

煙草瞬時轉化: 將35S::SiDVL1-GFP-EHA105和35S::SiDVL3-GFP-EHA105目標菌株活化, 用滲透液重懸菌體并調至OD600=1.0, 黑暗放置2～4 h,將含輔助質粒p19的農桿菌和目標質粒的農桿菌1∶1混勻, 用1 mL注射器(無針頭)吸取混合菌液接種煙草葉片背面, 暗培養(yǎng)3 d, 使用激光共聚焦顯微鏡LSM880進行GFP熒光鑒定。

DVL定位分析: 將SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP瞬時轉化的煙草葉片以及隨機選取的20條K599介導的毛狀根根尖, 用激光共聚焦顯微鏡LSM880進行GFP熒光鑒定, 判斷基因在煙草和谷子毛狀根的定位情況。

1.8 谷子SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7表達載體構建及功能鑒定

設 計SiNHX2(Seita.2G160200.1)、SiCBL4(Si002829m)和SiCBL7(Si002269m)的基因特異引物,通過PCR技術擴增目的基因cDNA, 利用同源重組的方法將目的基因與載體pCAMBIA1305.1連接,獲得目的基因的表達載體。將35S::SiNHX2、35S::SiCBL4、35S::SiCBL7表達載體以及空載體(pCAMBIA1305.1)轉化K599感受態(tài)細胞, 轉化方法見上海唯地生物技術公司的感受態(tài)使用說明書。

1.9 數據統計分析

利用以下公式進行數據統計, 采用GraphPad Prism 6.01軟件作圖, 利用LSD和Duncan’s方法對數據進行方差分析和多重比較。

毛狀根誘導率(%) = 產生毛狀根的外植體數/侵染的外植體總數×100%;

外植體的平均生根數(條) = 所有外植體產生的毛狀根數/產生毛狀根的外植體;

毛狀根的轉化效率(%) = PCR驗證成功的轉基因毛狀根數或有GFP熒光的毛狀根數/毛狀根總數×100。

2 結果與分析

2.1 谷子外植體選擇

根癌農桿菌介導谷子遺傳轉化時, 未成熟的花序、成熟的莖尖、未成熟胚胎或花序誘導的愈傷組織均可作為谷子外植體, 但是不同外植體的遺傳轉化效率存在很大差異[3]。本試驗用谷子芽尖和胚性愈傷組織為外植體, 利用發(fā)根農桿菌誘導谷子毛狀根。結果表明, 胚性愈傷組織作為外植體產生毛狀根需要10 d, 且生長緩慢(圖1-A), 芽尖外植體產生毛狀根需要5 d, 生長較快(圖1-B)。培養(yǎng)14 d時,谷子芽尖誘導的毛狀根顯著長于胚性愈傷組織誘導的毛狀根(圖1-C), 芽尖誘導毛狀根的效率顯著高于胚性愈傷組織誘導毛狀根的效率(圖1-D)。說明谷子芽尖比胚性愈傷組織更適合用作毛狀根誘導外植體。

圖1 不同外植體對誘導毛狀根的影響Fig. 1 Effects of different types of explants on hairy roots inductionA和B分別為發(fā)根農桿菌K599侵染谷子胚性愈傷組織和芽尖外植體誘導10 d和5 d時毛狀根發(fā)生情況; C: 培養(yǎng)14 d誘導產生毛狀根的根長; D: 培養(yǎng)14 d誘導產生毛狀根的誘導效率。3次生物學重復,n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A and B: Foxtail millet’s hairy-root development afterA. rhizogenesstrain K599 infecting embryogenic callus for 10 days and bud tips for 5 days, respectively. C: the root length of induced hairy roots cultured for 14 days. D: the induction efficiency of hairy roots cultured for 14 days. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.2 不同品種的芽尖外植體對毛狀根誘導的影響

谷子遺傳轉化具有基因依賴性以及農桿菌低敏感性等限制[5-6]。本試驗對Ci846、xiaomi、龍珠1號、豫谷1號和噸谷5個品種的谷子芽尖外植體進行毛狀根誘導, 發(fā)現5個供試品種的芽尖外植體均能誘導產生白色毛狀根, 且形態(tài)相似(圖2-A～E); 毛狀根長度均在1.5～2.0 cm之間(圖2-F); 毛狀根誘導率均在70%左右(圖2-G); 平均產生毛狀根數目約4條(圖2-H)。說明利用發(fā)根農桿菌誘導谷子毛狀根可能不受品種限制, 易于推廣應用, 可能是一種突破品種限制提高谷子遺傳轉化效率的方法。

圖2 不同谷子品種的芽尖外植體對毛狀根誘導的影響Fig. 2 Effects of bud tip explants from different millet varieties on hairy roots inductionA～E: 分別為Ci846 (A)、xiaomi(B)、噸谷(C)、龍珠1號(D)和豫谷1號(E)芽尖外植體對毛狀根誘導的影響; F: 不同品種來源的芽尖外植體誘導毛狀根的根長; G: 不同品種來源的芽尖外植體誘導毛狀根的誘導效率; H: 不同品種來源的芽尖外植體誘導毛狀根的平均生根數。3次生物學重復,n= 30。采用單因素方差分析, ns表示在0.05概率水平無顯著差異。A-E: the effects of Ci846,xiaomi, Dungu, Longzhu 1, and Yugu 1 on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots using bud tips from indicated varieties as the explants. G: the induction efficiency of hairy roots when bud tips from indicated varieties were used as the explants. H: the average induced hairy root number when bud tips from indicated varieties were used as the explants. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis; ns indicates no significant correlation at the 0.05 probability level.

2.3 乙酰丁香酮對谷子毛狀根誘導的影響

乙酰丁香酮在農桿菌介導單子葉植物遺傳轉化體系中起到提高質粒遺傳轉化效率的作用[21-22]。本研究發(fā)現0、50、100、150和200 μmol L-1的AS處理龍珠1號芽尖能夠誘導分支多、無向地性的白色毛狀根(圖3-A～E)。誘導培養(yǎng)15 d的毛狀根根長分別為0.69、0.75、0.95、0.65和0.59 cm (圖3-F); 毛狀根誘導率分別為50.15%、59.93%、80.15%、71.65%和59.54% (圖3-G), 平均生根數分別為1條、2條、3條、2條和2條(圖3-H)。說明在侵染液和共培養(yǎng)基中加入AS有利于谷子毛狀根誘導, 其中100 μmol L-1AS對谷子毛狀根的誘導效果最好。

圖3 乙酰丁香酮對谷子毛狀根誘導的影響Fig. 3 Effects of AS on foxtail millet hairy roots inductionA～E: 分別為0、50、100、150和200 μmol L-1AS對誘導毛狀根的影響; F: 0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導毛狀根的根長; G:0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導毛狀根的誘導效率; H: 0、50、100、150和200 μmol L-1AS誘導毛狀根的平均生根數。3次生物學重復,n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-E: the effect of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. G: the induction efficiency of hairy roots in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. H: the average induced root number in the presence of 0, 50, 100, 150, and 200 μmol L-1AS. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.4 菌液濃度對谷子毛狀根誘導的影響

適宜的發(fā)根農桿菌菌液濃度是影響遺傳轉化的重要因素[34]。本研究分別用OD600= 0.1、0.2、0.3、0.5、0.8和1.0的菌液侵染龍珠1號芽尖。結果表明所有濃度的菌液均能誘導白色毛狀根, 但存在差異(圖4-A～F)。6個菌液濃度誘導毛狀根根長分別為3.51、3.94、7.15、5.18、4.25和3.85 cm (圖4-G); 毛狀根誘導率分別為54.85%、55.56%、74.54%、76.25%、62.89%和60.75% (圖4-H); 平均生根數分別為2條、2條、3條、4條、2條和2條(圖4-I)。說明OD600為0.3的菌液誘導的毛狀根根長最長, OD600為0.5的菌液誘導的毛狀根效率和平均生根數最高。后續(xù)試驗用OD600為0.5的菌液濃度進行侵染。

圖4 菌液濃度對谷子毛狀根誘導的影響Fig. 4 Effect of bacterium concentration on foxtail millet hairy roots inductionA～F: OD600分別為0.1、0.2、0.3、0.5、0.8和1.0對誘導毛狀根的影響; G: 不同菌液濃度誘導產生毛狀根的根長; H: 不同菌液濃度誘導產生毛狀根的誘導效率; I: 不同菌液濃度誘導產生毛狀根的平均生根數。3次生物學重復,n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-F: the effect of bacteria solution at concentrations 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, and 1.0 OD600on hairy roots induction, respectively. G: the root length of induced hairy roots by bacteria at concentrations mentioned in (A-F), respectively. H: the induction efficiency of hairy roots by bacteria solution at concentrations mentioned in (A-F), respectively. I: the average induced rooting number by bacteria solution at concentrations mentioned in (A-F), respectively. Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.5 共培養(yǎng)時間對谷子毛狀根誘導的影響

外源基因轉移至植物受體細胞的過程, 主要是由外植體與發(fā)根農桿菌的共培養(yǎng)時間決定[25]。為探究谷子發(fā)根誘導的最佳共培養(yǎng)時間, 本研究比較了1、2、3、4和5 d共培養(yǎng)時間對龍珠1號毛狀根誘導的影響。結果表明5種共培養(yǎng)時間均能誘導谷子毛狀根產生, 但存在明顯差異(圖5-A～E)。與其他共培養(yǎng)時間相比, 共培養(yǎng)3 d時誘導產生的毛狀根最長(3.58 cm) (圖5-F), 毛狀根誘導率最高(65.35%)(圖5-G), 平均生根數最多(3條) (圖5-H)。說明K599侵染后共培養(yǎng)3 d對谷子毛狀根誘導效果最好。

圖5 共培養(yǎng)時間對谷子毛狀根誘導的影響Fig. 5 Effect of co-culture time on foxtail millet hairy roots inductionA～E: 分別為共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d對誘導毛狀根的影響; F: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導毛狀根的根長; G: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導毛狀根的效率; H: 共培養(yǎng)1、2、3、4和5 d誘導毛狀根的平均生根數。3次生物學重復,n= 30。采用單因素方差分析, 不同字母表示差異顯著(P＜ 0.05)。A-E: the effects of co-culture time of 1, 2, 3, 4, and 5 day(s) on hairy roots induction, respectively. F: the root length of induced hairy roots after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). G: the induction efficiency of hairy roots after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). H: the average hairy root number after co-culture for 1, 2, 3, 4, and 5 day(s). Three biological experiments were repeated,n= 30. One-way ANOVA Duncan’s test is used for statistical analysis. Different letters indicate significant differences atP＜ 0.05.

2.6 優(yōu)化條件下谷子毛狀根誘導效率驗證

為驗證優(yōu)化條件下谷子毛狀根的誘導效率, 本研究用含有100 μmol L-1AS、OD600為0.5的菌液侵染龍珠1號芽尖15 min, 在含有100 μmol L-1AS的MS固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)3 d, 轉移至含有300 mg L-1特美汀的MS固體培養(yǎng)基上誘導培養(yǎng)7 d。試驗重復12次, 共侵染253個芽尖。結果表明平均每個芽尖誘導毛狀根數目為3條, 毛狀根誘導效率達到80.24% (表1), 高于單獨最佳AS濃度、共培養(yǎng)時間和菌液濃度對毛狀根的誘導效率, 接近于棉花子葉誘導產生毛狀根的誘導率(82%)[18]。

表1 芽尖外植體誘導毛狀根的數據統計Table 1 Data statistics of hairy root by shoot tip explants induction

2.7 谷子毛狀根在基因功能驗證研究中的應用

為利用谷子毛狀根體系進行科學研究, 本研究構建了SiDVL-GFP谷子表達載體, 轉化發(fā)根農桿菌K599, 侵染龍珠1號芽尖并誘導毛狀根。隨機選取388條毛狀根, 提取毛狀根基因組DNA進行GFP基因的PCR檢測。以無菌苗正常根作為陰性對照, 空載體質粒為陽性對照。其中277條毛狀根檢測出目的大小的條帶(部分結果見圖6)。進一步計算發(fā)根農桿菌K599介導谷子芽尖外植體產生毛狀根的遺傳轉化效率達到71%。

圖6 部分轉基因發(fā)根的PCR驗證結果Fig. 6 Verification of transgenic hairy root by PCRM: DNA marker; 1: 基因表達載體質粒(陽性對照); 2～33: 基因表達載體轉化毛狀根的DNA; WT: 空載體轉化毛狀根DNA。M: DNA marker. 1: the gene expression vector was used as the positive control. 2-33: DNA from induced hairy root samples. WT: the empty vector from induced hairy root samples was used as the negative control.

同時, 本研究隨機選取20條SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP轉化的毛狀根根尖, 用激光共聚焦顯微鏡LSM880進行GFP熒光鑒定。結果表明帶有GFP熒光信號的毛狀根有15條(部分數據見圖7),進一步計算發(fā)根農桿菌K599介導谷子芽尖外植體產生毛狀根的遺傳轉化效率達到75%, 與PCR檢測結果基本一致。SiDVL1-GFP和SiDVL3-GFP在谷子發(fā)根中的亞細胞定位與其在煙草葉片中的定位一致(圖7)。說明該系統可用于谷子蛋白的亞細胞定位分析。

圖7 發(fā)根農桿菌介導的谷子DVL基因定位分析Fig. 7 Subcellular localization ofSiDVLgenes usingA. rhizogenes-mediated hairy root transformation

為利用該系統進行基因功能鑒定, 本研究將構建的SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7的谷子表達載體利用發(fā)根農桿菌轉化谷子芽尖, 獲得谷子轉基因植株,進行耐鹽性分析。結果表明,SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉基因谷子幼苗在正常條件下的生長與空載體質粒轉化谷子幼苗(對照)無明顯差異; 而在175 mmol L-1NaCl條件下,SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉基因谷子幼苗的存活率顯著高于對照(圖8), 說明SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7提高谷子的耐鹽性, 同時證明該體系可用于谷子基因功能鑒定。

圖8 SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉基因谷子幼苗對鹽脅迫的響應Fig. 8 Responses of foxtail millet withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots to salt stressA:SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉發(fā)根谷子幼苗在含有175 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基為對照)上生長7 d的表型; B:SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7轉基因谷子幼苗在含有175 mmol L-1NaCl的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基為對照)上生長7 d的存活率統計。3次生物學重復,n= 30。ns表示在0.05概率水平無顯著差異, ***表示在0.01概率水平顯著相關。A: the phenotypes of millet seedlings withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots when treated on MS medium with or without 175 mmol L-1NaCl for 7 days. B: the survival rates of millet seedlings withSiNHX2,SiCBL4, andSiCBL7transformed hairy-roots when treated on MS medium with or without 175 mmol L-1NaCl for 7 days. Three biological experiments were repeated,n= 30. ns indicates no significant correlation in the 0.05 probability level; *** indicates significant correlation at the 0.01 probability level.

3 討論

3.1 不同外植體影響谷子毛狀根誘導效率

在根癌農桿菌介導谷子遺傳轉化時, 未成熟的花序、成熟的莖尖、未成熟胚胎或花序誘導的愈傷組織均可作為谷子外植體, 但是這些外植體獲取的時間較長, 不同外植體遺傳轉化效率存在很大差異[3]。發(fā)根農桿菌介導植物毛狀根遺傳轉化效率較高, 如以虎杖葉片為外植體誘導產生毛狀根的轉化效率達到92%[24]; 以棉花子葉為外植體誘導產生毛狀根的誘導率達到82%[18]。本研究發(fā)現谷子胚性愈傷組織作為外植體時產生毛狀根需要10 d, 而且毛狀根生長緩慢; 而以谷子芽尖作為外植體時產生毛狀根需要5 d, 且毛狀根生長較快(圖1)。說明不同外植體對谷子毛狀根誘導效果具有較大影響。

3.2 菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時間影響谷子毛狀根誘導效率

研究表明菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時間對毛狀根的誘導也有很大影響。杜梨和虎杖毛狀根誘導產生需要的菌液濃度OD600分別為0.3～0.4[23]和0.8[24]。巴戟天[21]和鉤藤[22]毛狀根誘導適宜的乙酰丁香酮濃度分別為300 μmol L-1和100 μmol L-1。外源基因轉移至植物受體細胞的過程, 主要是由外植體與發(fā)根農桿菌的共培養(yǎng)時間決定, 而共培養(yǎng)時間過短, 發(fā)根農桿菌不易附著并進入植物細胞, 發(fā)揮作用的Ri質粒減少, 導致毛狀根誘導效率低; 而共培養(yǎng)時間過長可導致外植體死亡, 從而導致毛狀根誘導效率降低[23]。本實驗發(fā)現發(fā)根農桿菌K599菌液在OD600為0.5時對谷子毛狀根的誘導效率較高(圖4)。侵染液中加入適量的乙酰丁香酮共培養(yǎng)3 d時有助于谷子芽尖誘導谷子毛狀根(圖3和圖5)。因此, 合適的菌液濃度、乙酰丁香酮和共培養(yǎng)時間對谷子芽尖誘導毛狀根具有顯著的促進作用。

3.3 谷子毛狀根體系具有重要的應用價值

發(fā)根農桿菌介導植物產生的毛狀根在農作物育種、醫(yī)藥合成、環(huán)境修復以及基因功能研究等方面具有廣泛應用[12-15]。本研究利用谷子毛狀根體系進行的蛋白亞細胞定位分析(圖7)和基因功能鑒定(圖8), 說明發(fā)根農桿菌K599介導的谷子芽尖毛狀根是一種谷子蛋白亞細胞定位分析和基因功能鑒定的快速有效的方法。此外, 谷子遺傳轉化具有基因型依賴性[5-6], 且根癌農桿菌介導谷子遺傳轉化的效率較低, Y4品種為4.72%[35], 而xiaomi品種約為23.28%[3]。本研究發(fā)現谷子品種對毛狀根誘導效率無影響, 誘導效率較高, 均能達到70% (圖2), 說明谷子毛狀根可能是一種突破品種限制提高谷子遺傳轉化效率的方法。

4 結論

利用OD600為0.5的K599介導谷子芽尖外植體,在加入100 μmol L-1AS的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d, 谷子毛狀根的遺傳轉化效率達70%, 同時該體系可進行基因定位和功能分析, 因此本研究建立了一種突破品種限制高效快速鑒定谷子基因功能的方法。