拉曼光譜檢測糖皮質激素的方法研究

范宇華，付蕓，李浩然，萬楚琦

（1.長春理工大學 光電工程學院，長春 130022；2.長春理工大學 空間光電技術研究所，長春 130022）

糖皮質激素（Glucocorticoids，GLUs）是一種類固醇激素[1]，可從人體的腎上腺皮質分泌，也可人工合成。糖皮質激素不僅在生物體內的糖、蛋白質和脂肪等合成及代謝過程中起著重要的調節(jié)作用[2]，在藥用方面也體現著重要的價值[3]，如一定量的糖皮質激素能起到抗炎的作用，可抑制毛細血管擴張、緩解水腫；還可調節(jié)體溫，緩解多種癥狀引起的發(fā)熱；還有抗過敏的作用[4]。但近年來，糖皮質激素濫用[5-6]現象廣泛存在，如大劑量、長周期使用糖皮質激素，引發(fā)依賴性；把糖皮質激素隨意當作退熱藥、鎮(zhèn)痛藥和抗菌藥使用；或用在診斷不明的病例上緩解癥狀；更有甚者在商品中違禁添加糖皮質激素，如動物飼料[7]、化妝品[8]中等。但糖皮質激素的濫用會引發(fā)人體免疫功能障礙[6]，如體內淋巴細胞的數量下降，抵抗力變弱；還會對人體多種系統造成影響，如骨髓造血系統，使紅細胞和血小板等的數量增多，抑制白細胞抗炎的功能，使消化系統紊亂，如誘發(fā)胃潰瘍[9]等。人體長期每天使用超過30 mg 的糖皮質激素會造成依賴性；人體每天使用超過100 mg 的糖皮質激素可導致嚴重副作用；如果每天的使用量為250 mg或以上時，則僅能用藥數日后就需停藥。

糖皮質激素的檢測對于應對非法添加、違規(guī)使用和限用等問題有著重要意義?，F有的糖皮質激素檢測方法有很多種，廣泛使用的有高效液相色譜法（High Perform Liquid Chromatography，HPLC）[8]、超高效液相色譜法-串聯質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[10]等主流檢測方法，也有采用微固相萃取[11]、免疫層析[12]和電化學分析[13]的方法，但這些方法存在儀器昂貴、設備體積大不易攜帶、對操作人員的技術專業(yè)性要求過高、處理繁瑣、檢測周期長的缺陷，不適用于監(jiān)管部門和生產企業(yè)現場大量樣本快速檢測的需求。

拉曼光譜技術[14]是一種高精度、靈敏、快速和無損的分子檢測手段，有著“指紋”圖譜分辨能力。具有拉曼活性的物質有著對應的拉曼特征峰位，拉曼特征峰強度隨濃度的變化有著高低的變化，可根據拉曼峰特征建立數學模型，快速鑒別物質種類和濃度。拉曼光譜是一種強有力的物質分析手段。拉曼光譜在糖皮質激素檢測上有著廣泛的應用，如Li 等人[15]應用薄層色譜結合斑點拉曼散射法建立了一種同時快速檢測膳食補充劑中非法添加的6 種糖皮質激素的方法。修梓僑等人[16]通過激光拉曼光譜分析了地塞米松的內部結構和拉曼光譜關系，可快速準確地檢測出地塞米松。

本研究搭建了一種小型化的拉曼光路，采用532 nm 激光器對糖皮質激素地塞米松和氫化可的松固體樣本和不同濃度的二甲基亞砜溶液進行了拉曼光譜測試，探討應用拉曼光譜實現糖皮質激素定量檢測的關鍵技術，針對多種預處理及回歸方法進行分析比較，得出了一種可以在實驗中快速進行拉曼檢測的方法。本方法實現了準確測定糖皮質激素的濃度，為糖皮質激素的精準分析提供方案策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

激發(fā)光源（MSL-FN-532，532 nm，新產業(yè)），保護銀反射鏡（RSR20-D254，銳納光學），分光棱鏡（CCM1-BS013/M，thorlabs），平場無限遠消色差顯微物鏡（20 倍，永新光學），濾光片（537 nm，OD6+，新產業(yè)），聚焦透鏡（GCL-010601，大恒光電，f′=200 mm），角度反射探頭（海洋光學），光譜儀（sunshine 系列，探測范圍：530～720 nm，共1 958 個數據點，新產業(yè)），分析天平（UW620H，島津制造所），石英比色皿（3.5 mL，兩光通）。

地塞米松（分析純，麥克林），氫化可的松（分析純，麥克林），二甲基亞砜（分析純，福晨化學），無水乙醇（分析純，富宇試劑），樣品試劑皆為分析純。本實驗使用的所有玻璃儀器均經過超純水清洗，實驗使用水均為Milli-Q 純化的超純水（＞18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗光路

本文采用顯微拉曼測試系統，激發(fā)光源波長采用532 nm。如圖1 所示，激光器發(fā)出的激光經過可調節(jié)衰減器，調節(jié)輸出光功率同時輸出線偏振光，線偏振光經四分之一波片后變?yōu)閳A偏振光，經折轉光路調節(jié)出光高度，后由分光棱鏡分光，一束經過顯微物鏡將光斑聚集到裝有被測樣品的石英比色皿中，被激發(fā)的拉曼散射光由顯微物鏡收集回來，再經537 nm 長波通濾光片將瑞利散射光強衰減至和拉曼散射光強度在同一數量級上，通過濾光片的拉曼散射光經聚焦透鏡后聚焦，由光纖探頭將拉曼散射信號傳輸至光譜儀。

圖1 拉曼光譜采集原理框圖

圖2 所示為自行搭建的拉曼光譜采集實驗平臺。

圖2 拉曼光譜采集實驗平臺

1.3 樣品制備

糖皮質激素標準溶液配制：分別制備地塞米松與氫化可的松二甲基亞砜溶液10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1、40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1、90 mg·mL-1、100 mg·mL-1共10 個濃度梯度的標準液。分別制備1 mg·mL-1地塞米松與氫化可的松無水乙醇溶液。

1.4 拉曼光譜儀的校正及拉曼光譜采集

拉曼光譜儀的校正及光譜采集工作在Spectral Analysis 軟件下完成。為保證拉曼光譜測量的準確性，需進行拉曼光譜儀的校正，對激光波長進行校準：在拉曼頻移為零位置處進行校正，即在拉曼測試之前，不放樣品，拿掉537 nm 長波通濾光片，用光譜儀測量激光器激發(fā)波長為533.206 nm，在“Spectral Analysis”軟件進行激發(fā)波長參數設定時輸入533.206 nm，之后測得在拉曼頻移為零位置處的強度最大，則該波長為當前激光器激發(fā)波長校準值，安裝濾光片后輸入該波長重新進行暗光譜采集，此時完成激光波長校準工作[17]。

運用“Spectral Analysis”軟件完成數據采集及參數設定工作，積分時間10 s，開始采集拉曼光譜之前，關閉激光器，避免環(huán)境光等對測試結果的影響，保存并扣除暗光譜，激發(fā)功率約200 mW，樣品置于石英比色皿中，每個標準溶液取20 個采樣點，每點采5 次取平均；采集地塞米松與氫化可的松固體粉末的拉曼光譜；采集地塞米松與氫化可的松無水乙醇溶液拉曼光譜；采集地塞米松與氫化可的松二甲基亞砜溶液拉曼光譜。

1.5 模型的建立及評價

為提高信噪比，對比了基于不同參數的移動窗口平均法（Moving Window Averaging，MWA）、移動窗口中位值法（Moving Window Median，MWM）、Savitzky-Golay 卷積平滑法（SG）和小波閾值法（Wavelet Threshold，WT）的去噪效果。采用信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR）和均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）作為評價指標，去噪后的拉曼光譜作為標準信號，與噪聲的比值作為信噪比，計算公式如下：

式中，f(i)為原始含噪聲拉曼光譜；為去噪后的拉曼光譜；n為拉曼光譜長度。

為消除熒光背景的干擾，對比自適應迭代重加權懲罰最小二乘法（Adaptive Iterative Reweight?ing Penalized Least Squares，airPLS）、不對稱最小二乘法（Asymmetric Least Squares，ALS）和BEADS（Baseline Estimation Add Denoising With Sparsity）算法的基線校正效果。

以3∶1 比例將每種濃度的糖皮質激素標準溶液樣品劃分為訓練集和測試集，利用連續(xù)投影算法（Successive Projections Algorithm，SPA）選取特征波數來改善模型，特征波數的數量限定在1～30 之間。應用多元線性回歸（Multivariable Linear Regression，MLR）、主成分回歸（Principle Component Regression，PCR）、偏最小二乘回歸（Partial Least Squares Regression，PLSR）、BP 神經網絡（Back Propagation，BP）、和基于線性、多項式、RBF、sigmoid 核函數的支持向量回歸（Support Vector Regression，SVR）算法建立定量分析模型。根據決定系數（R2）和均方根誤差（RMSE）評價模型的性能。計算公式如下：

式中，yi表示實際濃度值；fi為預測 值；是實際濃度的平均值；N為樣本數。決定系數R2越接近1，回歸效果越好；RMSE 越小，模型預測能力越強。在Matlab R2019a 下對數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 糖皮質激素拉曼光譜特征分析

圖3 為地塞米松和氫化可的松固體拉曼光譜的對比圖，二者具有結構上的相似性，地塞米松和氫化可的松都存在一對強度較高的雙峰，特征峰各自位于1 611 cm-1、1 662 cm-1和1 614 cm-1、1 647 cm-1，分別源自環(huán)己二烯結構的雙鍵伸縮振動和環(huán)己烯結構的雙鍵伸縮振動，不同之處在于氫化可的松的雙峰強度相當、峰形相似、峰距較窄，而地塞米松受環(huán)己二烯結構的影響導致其中一峰強度被衰減，兩峰強度差距較明顯[15]。地塞米松2 947 cm-1和氫化可的松2 951 cm-1受甲基非對稱伸縮振動影響表現較強[16]，地塞米松534 cm-1和691 cm-1峰歸屬于C-F 的影響[18]。

圖3 糖皮質激素固體粉末的拉曼光譜圖

2.2 糖皮質激素定量分析的溶劑選擇

圖4（a）和圖4（b）為兩種糖皮質激素在無水乙醇中的拉曼光譜，圖4（c）和圖4（d）為兩種糖皮質激素在二甲基亞砜中的拉曼光譜，地塞米松和氫化可的松略溶于無水乙醇，兩者在無水乙醇中的溶解度達不到光譜儀的拉曼檢測限，在該溶液狀態(tài)下無法分辨兩者的拉曼峰；在二甲基亞砜溶液中，地塞米松在1 611 cm-1、1 662 cm-1和氫化可的松在1 614 cm-1、1 647 cm-1位置處最強的雙峰均清晰可見，以上峰位受二甲基亞砜溶劑的影響均發(fā)生了紅移，分別紅移到1 617 cm-1、1 668 cm-1和1 620 cm-1、1 668 cm-1位置處。但是，地塞米松2 947 cm-1和氫化可的松2 951 cm-1特征峰與二甲基亞砜2 922 cm-1位置處發(fā)生譜峰重疊，地塞米松1 452 cm-1和氫化可的松1 442 cm-1特征峰以下的低波數區(qū)多為弱峰且與二甲基亞砜的低波數區(qū)存在多處重疊。因此，適合選擇兩種糖皮質激素在二甲基亞砜溶液中雙峰作為特征，為糖皮質激素定量分析提供判斷的依據。

2.3 糖皮質激素拉曼光譜的預處理

受光源穩(wěn)定性和環(huán)境影響，原始光譜數據中除有用信號外還有許多噪聲信號和熒光背景，如圖5 所示。需對原始光譜信號進行預處理。

圖5 原始光譜

比較了基于不同參數的MWA、MWM、SG 和WT 去噪算法，表1 為各方法不同參數下SNR 和RMSE 的最優(yōu)值。通過對比分析發(fā)現，當MWA 與MWM 窗口寬度過小時，濾波有殘留，而窗口過大時，光譜信息易丟失，其中MWM 較適合抑制拉曼光譜中的尖峰或異常點噪聲。由表1 可見WT法明顯優(yōu)于MWA 和MWM 法。SG 法雖能有效地保留光譜的特征峰信息，但去噪效果不理想。

表1 不同去噪方法SNR 和RMSE 的最優(yōu)值

小波軟閾值在去噪光滑性上優(yōu)于小波硬閾值，但會損失高頻信息[19-20]。表1 參數下的小波軟閾值法與真實信號的接近程度次于小波硬閾值法，因此，采用SNR 最高、RMSE 最小的小波基為coif3、分解層數為3 的小波硬閾值法，可在去噪效果較好的情況下保留了拉曼光譜的大部分特征信息，圖6 為該參數下兩種糖皮質激素的去噪光譜。

圖6 糖皮質激素的去噪后光譜圖

熒光背景表現為變化平緩的低頻信號，而拉曼信號表現為較陡峭的高頻信號。如圖6 所示，熒光背景表現為由高低波數位置向中間波數位置上升的現象，影響拉曼定量分析的后續(xù)處理。圖7（a）、圖7（b）、圖7（c）和圖7（d）分別表示為去噪后的光譜再經過airPLS 和ALS 法基線校正后的光譜。采用airPLS 和ALS 法進行基線校正時，雖能保持拉曼光譜的峰形，但存在復雜熒光背景下基線不能完全校正的現象。如果先插值再用BEADS 算法處理，不僅能保留光譜數據中有用信息，還能近乎完整地扣除熒光背景，得到平整的光譜基線，如圖7（e）和圖7（f）所示。

圖7 基線校正光譜圖

2.4 糖皮質激素拉曼光譜特征提取及定量分析

選取基線校正后1 550 cm-1～1 750 cm-1兩種糖皮質激素特征峰波數區(qū)間光譜數據，使用SPA 法從1～30 個特征波數中選出4 個特征波數得到最小均方根誤差，分別為4.854 8 和4.421 0，地塞米松的特征波數位于1 664 cm-1、1 670 cm-1、1 683 cm-1、1 690 cm-1，氫化可的松的特征波數位于1605 cm-1、1 611 cm-1、1 663 cm-1、1 671 cm-1，如圖8 所示。

圖8 SPA 特征提取圖

將SPA 提取的4 個波數作為變量輸入至不同回歸模型中，建模結果如表2 和表3 所示。可以看出，建模樣本中基于RBF 核函數的SVR 所得模型效果最好，其他方法擬合效果欠佳。通過測試集驗證模型的性能，對于地塞米松和氫化可的松，SVR 模型的RP2分別為0.994 4 和0.995 9，相較于其他模型更接近1。 RMSEP 分別為2.527 4 mg·mL-1和1.750 4 mg·mL-1，表明有更多的預測樣本聚集在實際濃度值附近。

表2 地塞米松數據集建模和預測效果

表3 氫化可的松數據集建模和預測效果

基于RBF 核函數的SVR 模型對地塞米松和氫化可的松的建模效果和預測效果如圖9 所示，模型整體的預測準確性較高、穩(wěn)健性較好，只有少數預測樣本偏差略大，其中，在90 mg·mL-1的樣品處出現了較大的偏差。經與實驗記錄對比發(fā)現，測量時環(huán)境光強產生了較大波動，引起熒光背景的突變，在后續(xù)基線校正處理中使得部分有用的光譜信息被誤認為熒光背景，致使該濃度下的光譜強度出現偏差，造成樣品濃度預測偏差較大。

圖9 基于RBF 核函數的SVR 算法建模效果和預測效果

3 結論

本文針對糖皮質激素濫用的問題，設計了一種精準進行糖皮質激素濃度檢測的方法。采用532 nm 激光器對兩種糖皮質激素的二甲基亞砜溶液進行拉曼測試分析，發(fā)現受二甲基亞砜溶劑 的 影 響，地塞 米松 在1 611 cm-1、1 662 cm-1和氫化可的松在1 614 cm-1、1 647 cm-1位置處的雙峰均發(fā)生了紅移。采用小波基為coif3、3 層分解的硬閾值法去噪時，SNR 最高為45.822 7。經過對比發(fā)現，對于具有強熒光背景的糖皮質激素二甲基亞砜溶液的拉曼光譜，BEADS 算法能在保留其拉曼光譜峰形的前提下更好地消除熒光背景。相較于其他方法，基于RBF 核函數的支持向量回歸模型獲得了較好的分析性能，對于地塞米松和氫化可的松該定量分析模型預測集決定系數（RP2）分別為0.994 4 和0.995 9，均方根誤差（RMSEP）分別為2.527 4 mg·mL-1和1.750 4 mg·mL-1，所建立的定量分析模型具有良好的準確性、精密度?？山鉀Q現有分析技術手段耗時長、檢測成本高、操作復雜等問題，為有效監(jiān)測糖皮質激素的濫用問題提供了技術支持。研究表明拉曼光譜能夠測定糖皮質激素，但拉曼光譜的檢測精度仍有很大的提高空間，在后續(xù)的研究中，將通過表面增強拉曼技術提高檢測方法的靈敏度，滿足更多領域的檢測需求。