基于DNA 條形碼技術(shù)的太湖縣柑橘大實(shí)蠅幼蟲的分子鑒定

賈筱沄，邢耀春，馬曉靜，李愷球，卓志斌，吳君俠，楊文釗，曾令瑜，趙巖，王宇寧，李志紅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物安全系，北京 100089；2.安徽省植物保護(hù)總站，合肥 230091；3.太湖縣種植業(yè)服務(wù)中心，安徽 安慶 246400；4.鳳陽縣植保站，安徽 滁州 233100；5.碭山縣植保植檢服務(wù)中心，安徽 宿州 235300）

實(shí)蠅是雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Tephritidae）昆蟲，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，約有500 屬4 500種，其中具有重要經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅約有250 余種［1，2］。柑橘大實(shí)蠅（Bactrocera minax）屬雙翅目實(shí)蠅科果實(shí)蠅屬，是柑橘類果樹的重要害蟲，主要分布于中國西南地區(qū)和印度次大陸北緣。該害蟲生物學(xué)特性獨(dú)特，一年發(fā)生一代，僅為害柑橘類果實(shí)，雌成蟲產(chǎn)卵于幼果內(nèi)，造成果皮傷口，病原菌易從傷口入侵果實(shí)，幼蟲孵化后取食果肉造成危害，使果實(shí)完全失去食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。柑橘大實(shí)蠅在中國西南地區(qū)具有明顯的擴(kuò)散趨勢，主要以幼蟲隨被害果實(shí)沿河谷向下游遠(yuǎn)距離擴(kuò)散和以成蟲飛行向周邊短距離擴(kuò)散為主。隨著氣候變化、種植結(jié)構(gòu)調(diào)整和水果貿(mào)易增加，其危害面積逐漸擴(kuò)大，自20 世紀(jì)60 年代，疫情呈逐年加重趨勢［3，4］。目前，對昆蟲的物種鑒定多采用形態(tài)學(xué)方法，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法存在一定缺陷，如果遇到昆蟲卵、幼蟲和蛹以及在保存、運(yùn)輸過程中出現(xiàn)肢體殘缺或磨損的情況，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法很難辨別，鑒定較困難［5］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行昆蟲物種鑒定，不受昆蟲的蟲態(tài)約束，可以從分子生物學(xué)水平得到準(zhǔn)確的物種信息，該技術(shù)是傳統(tǒng)昆蟲形態(tài)學(xué)鑒定的合理補(bǔ)充［6，7］。其中，DNA 條形碼技術(shù)（DNA barcoding）被認(rèn)為是最簡單、迅速、精確的方法。2003年，Herbert等［8］提出DNA 條形碼技術(shù)的概念，即利用一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA 序列作為標(biāo)記，通過序列分析，快速準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，利用線粒體DNA 細(xì)胞色素C 氧化酶I 基因（COI）中一段長度為658 bp 的片段，能夠成功地在DNA 水平上區(qū)分動(dòng)物物種，該片段被作為動(dòng)物物種鑒定的DNA 條形碼。目前，該鑒定技術(shù)的有效性已經(jīng)在包括昆蟲綱在內(nèi)的多個(gè)動(dòng)物類群中得到證明，可以根據(jù)序列相似性和遺傳距離對物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，同時(shí)在發(fā)現(xiàn)和描述新種或隱種、分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育等研究中廣泛應(yīng)用。

目前該技術(shù)在實(shí)蠅鑒定方面也多有報(bào)道。2011年，Buahom等［9］采用DNA 條形碼技術(shù)，將采自泰國四色菊市番石榴爛果中的5 頭實(shí)蠅幼蟲的COI序列進(jìn)行擴(kuò)增測序，使用BOLD（Barcode of life data system）數(shù)據(jù)庫比對及PAUP 4.0 軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，成功鑒定幼蟲為番石榴果實(shí)蠅，并將2條COI序列在GenBank 中注冊。2017年，Guo等［10］利用DNA條形碼技術(shù)快速準(zhǔn)確地鑒定了枸杞實(shí)蠅的幼蟲和蛹。2018年，王溪橋等［11］結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法和DNA 條形碼技術(shù)，擴(kuò)增具條實(shí)蠅和南瓜實(shí)蠅的COI基因，基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后與NCBI（National center for biotechnology information）及BOLD 數(shù)據(jù)庫比對，并進(jìn)行物種鑒定。2019年，趙巖等［12］使用DNA條形碼技術(shù)，對采自河南省洛陽市、鄭州市的實(shí)蠅幼蟲、成蟲進(jìn)行分子鑒定。DNA 條形碼技術(shù)操作簡便，能克服非成蟲蟲態(tài)鑒定難的問題，可使非昆蟲分類人員或昆蟲分類經(jīng)驗(yàn)較少的人員快速精確地完成目標(biāo)物種鑒定工作［13］。

相較于需測序、拼接、剪切的DNA 條形碼技術(shù)，同樣以COI基因?yàn)榛A(chǔ)開發(fā)的PCR 技術(shù)也廣受關(guān)注。2013年，程曉甜等［14］通過SYBR green 實(shí)時(shí)熒光PCR 快速鑒定技術(shù)建立了棗實(shí)蠅鑒定方法。2014年，黃振等［15］設(shè)計(jì)種特異性引物，通過PCR 方法將辣椒實(shí)蠅與其他20 種實(shí)蠅進(jìn)行區(qū)別。2019年，Zheng等［16］通過分析中國10 種檢疫性實(shí)蠅不同地理種群的COI基因序列，設(shè)計(jì)出一對可以用于區(qū)分柑橘大實(shí)蠅與蜜柑大實(shí)蠅的特異性PCR 引物。

本研究對來自安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)的5 頭實(shí)蠅幼蟲進(jìn)行DNA 條形碼序列擴(kuò)增與測序，與BOLD 數(shù)據(jù)庫中DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比對及系統(tǒng)發(fā)育分析。同時(shí)，本研究使用Zheng等［16］針對柑橘大實(shí)蠅與蜜柑大實(shí)蠅設(shè)計(jì)的特異引物（Bm-F/R、Bt-F/R），對實(shí)蠅幼蟲樣本進(jìn)行物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究于2020 年10 月4 日在安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)（30°29′19″N，116°08′37″E）種植的溫州蜜柑“日南1 號”的果實(shí)中采集5 頭實(shí)蠅幼蟲。將實(shí)蠅幼蟲樣本按THA1、THA2、THA3、THA4、THA5 的順序編號后，置于含有無水乙醇的離心管，-80 ℃保存。

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；COI基因片段純化和雙向測序，北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 以整頭實(shí)蠅幼蟲為材料，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行全基因組DNA 提取。

1.2.2 DNA 條形碼序列擴(kuò)增與PCR 特異引物鑒定 使用Folmer等［17］設(shè)計(jì)的引物（LCO-1490/HCO-2198）擴(kuò)增線粒體基因組中COI基因的DNA 條形碼序列（658 bp），使用引物（Bm-F/R、Bt-F/R）擴(kuò)增實(shí)蠅幼蟲樣本的特異片段（422 bp），引物序列見表1。

表1 COI基因LCO-1490/HCO-2198 通用引物及Bm-F/R、Bt-F/R 特異性引物序列

PCR 反應(yīng)的總體積為25 μL，2×TaqPCR Master-Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物，在含0.01% GeneGreen 核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測（120 V，20 min）。

將使用LCO-1490 和HCO-2198 引物得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因片段純化和雙向測序。分別將使用Bm-F/R、Bt-F/R 引物得到的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.2.3 序列比對及分析 測序結(jié)果返回后，使用MEGA X軟件對得到的正反向測序結(jié)果進(jìn)行拼接［18］，得到單條準(zhǔn)確序列。采用BOLD 數(shù)據(jù)庫中的Identification-animal identification［COI］功能對每條DNA 條形碼序列進(jìn)行比對，檢查鑒定結(jié)果及相似度數(shù)據(jù)。

選取蜜柑大實(shí)蠅（Bactrocera tsuneonis）、南亞果實(shí)蠅（Zeugodacus tau）、番石榴果實(shí)蠅（Bactrocera correcta）、瓜實(shí)蠅（Zeugodacus cucurbitae）、具條實(shí)蠅（Zeugodacus scutellatus）及橘小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）為相關(guān)近似種，家蠅（Musca domestica）為外族，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)物種的DNA 條形碼序列，使用MEGA X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以進(jìn)一步確定分子鑒定的結(jié)果。采用鄰接法（NJ）構(gòu)建實(shí)蠅幼蟲樣本序列與相關(guān)種類標(biāo)準(zhǔn)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支設(shè)置信度（Bootstrap），迭代1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 條形碼序列及相似性鑒定

測序得到長度為655 bp的COI基因序列，上傳并獲得GenBank 登錄號。將5 頭實(shí)蠅幼蟲樣本的COI基因序列與BOLD 數(shù)據(jù)庫中DNA 條形碼序列進(jìn)行比對，分子鑒定結(jié)果（表2）顯示，5 頭實(shí)蠅幼蟲樣本的DNA 條形碼序列與BOLD 數(shù)據(jù)庫中柑橘大實(shí)蠅標(biāo)準(zhǔn)序列的相似性均為100%。

表2 實(shí)蠅幼蟲樣本COI基因序列基本信息及相似性比對結(jié)果 （單位：%）

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MAGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），實(shí)蠅幼蟲樣本序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的柑橘大實(shí)蠅序列形成一個(gè)單系，且與其近緣物種顯著區(qū)分開，確定實(shí)蠅幼蟲樣本為柑橘大實(shí)蠅。

圖1 MAGA-X 軟件構(gòu)建的實(shí)蠅幼蟲樣本系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 PCR 鑒定

由圖2 可知，使用蜜柑大實(shí)蠅特異引物得到的PCR 產(chǎn)物無條帶產(chǎn)生，說明5 頭實(shí)蠅幼蟲樣本不是蜜柑大實(shí)蠅；使用柑橘大實(shí)蠅特異引物得到的PCR產(chǎn)物在300～500 bp 有清晰明亮的條帶，擴(kuò)增序列長度符合特異引物擴(kuò)增序列長度特征（422 bp），說明實(shí)蠅幼蟲樣本為柑橘大實(shí)蠅。

圖2 Bm-F/R、Bt-F/R 引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究使用DNA 條形碼技術(shù)，通過基因序列測定、比對分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，明確了安徽省太湖縣天花鎮(zhèn)的5 頭幼蟲為柑橘大實(shí)蠅。相關(guān)實(shí)蠅幼蟲DNA 條形碼序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫，可作為標(biāo)準(zhǔn)序列應(yīng)用于今后的實(shí)蠅DNA 條形碼鑒定。使用特異引物組（Bm-F/R、Bt-F/R）對實(shí)蠅幼蟲樣本進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果與DNA 條形碼鑒定結(jié)果一致。相較于DNA 條形碼技術(shù)，使用特異性引物的PCR 鑒定技術(shù)無需測序，可快速得到結(jié)果，省時(shí)省力，成本更低。但該引物組僅對柑橘大實(shí)蠅和蜜柑大實(shí)蠅的區(qū)分鑒定有效，不能鑒定其他物種。DNA 條形碼技術(shù)應(yīng)用范圍更廣，使用一對通用引物即可滿足物種鑒定的需求，該技術(shù)操作流程簡單，應(yīng)推進(jìn)該鑒定技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，加快該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。

柑橘大實(shí)蠅已在中國多個(gè)省份有所分布［4］。本研究在安徽省發(fā)現(xiàn)柑橘大實(shí)蠅活動(dòng)蹤跡，表明柑橘大實(shí)蠅擴(kuò)散趨勢顯著，潛在風(fēng)險(xiǎn)較高，安徽省柑橘類作物主產(chǎn)區(qū)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測預(yù)警，防止柑橘大實(shí)蠅擴(kuò)散。太湖縣位于安徽省、湖北省、江西省3 省交界處，周邊省份柑橘大實(shí)蠅非疫區(qū)也應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，防止柑橘大實(shí)蠅擴(kuò)散傳播。

隨著DNA 條形碼技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)在中藥材真假判別、動(dòng)植物檢疫等方面也有諸多運(yùn)用［19］。本研究實(shí)現(xiàn)了柑橘大實(shí)蠅幼蟲的精準(zhǔn)、快速鑒定，顯示了DNA 條形碼技術(shù)具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。同時(shí)，本研究應(yīng)用針對柑橘大實(shí)蠅與蜜柑大實(shí)蠅設(shè)計(jì)的特異性引物，經(jīng)濟(jì)、高效地獲得了待測樣本的物種信息。