益腦心片的制備工藝和質(zhì)量標準

薛彩紅，滕明，周金艮

（南寧市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530004）

隨著中國經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，肥胖人群數(shù)量明顯增加［1］，心腦血管病患病人數(shù)相應(yīng)增加?！吨袊难懿蟾?018》報道中國心腦血管病患病人數(shù)已達2.9 億人，心腦血管病死亡人數(shù)占居民疾病死亡人數(shù)的40%以上，高于腫瘤及其他疾病。心腦血管病的防治工作面臨嚴峻挑戰(zhàn)。中成藥因安全性高、副作用較小，在治療心腦血管疾病方面具有獨特優(yōu)勢。益腦心顆粒是由川芎、制何首烏（Polygoni multiflori）、丹參、郁金、山楂、天麻（Gastrodiae rhizoma）組成的中成藥，收載于《國家中成藥標準匯編腦系經(jīng)絡(luò)肢體分冊》，具有活血散瘀、平肝熄風(fēng)的功能，用于血瘀肝旺所致眩暈頭痛、心悸失眠、胸悶氣短的治療［2］，只有顆粒劑1 種劑型供臨床使用。為解決因顆粒劑服用量大帶來的不便，以及為臨床患者提供更多劑型，本研究將益腦心顆粒劑型改良為片劑，對益腦心片的制備工藝及質(zhì)量標準進行研究，為益腦心顆粒的二次開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 單沖壓片機（上海天凡藥機制造廠）；BY-300 型糖衣機（中南制藥機械廠）；ZF-20C 型暗箱紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；片劑四用測試儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；威瑪龍LC-9000s 型色譜儀（含威瑪龍工作站）；十萬分之一電子天平（Mettler-Toledo）；萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.1.2 試劑 益腦心片（自制，批號20190601、20190602、20190603）；川芎、丹參、郁金、制何首烏、山楂、天麻均購自廣西玉林藥材市場；丹酚酸B 對照品（供含量測定用，批號111562-201917）、制何首烏對照藥材（供鑒別用，批號121454-201806）、大黃素（供含量測定用，批號110756-201913）、天麻素（供含量測定用，批號110807-201809）均購自中國食品藥品檢定研究院；硬脂酸鎂、滑石粉、淀粉均購自廣西南寧醫(yī)藥有限公司；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 制備工藝研究

1.2.1 丹酚酸B 的含量測定

1）色譜條件。以Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為填充劑，以乙腈-甲酸-去離子水（20∶1∶79）為流動相，檢測波長為286 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。

2）對照品溶液的制備。稱取丹酚酸B 2.73 mg，加75%甲醇，制成每毫升甲醇含0.109 mg 丹酚酸B的溶液。

3）供試品溶液的制備。吸取益腦心片提取液1 mL，13 000 r/min 離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

1.2.2 處方 川芎333.8 g、丹參208.8 g、郁金125.0 g、山楂250.0 g、制何首烏266.2 g、天麻66.2 g，制成益腦心片1 000 片。

1.2.3 提取工藝優(yōu)化 原益腦心顆粒的提取條件為加去離子水煎煮3次，第1 次2.0 h，第2 次1.5 h，第3 次1.0 h。本研究通過正交試驗（表1）對原劑型的提取條件進行優(yōu)化，取1/4 倍量處方藥材9份，按正交試驗設(shè)計（表2）進行提取，藥液過400 目濾布，合并濾液，靜置4 h，取上清液，備用。吸取上清液20 mL，加去 離子水稀釋1.5倍，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，注入色譜儀，測定丹酚酸B 的峰面積，計算提取液中丹酚酸B 提取量（Y）。

表1 益腦心片提取工藝正交試驗因素與水平

1.2.4 提取工藝驗證 取1/4 倍量處方藥材3份，按照正交試驗篩選的最佳組合進行提取，同法測定提取液中丹酚酸B 的提取量。

1.2.5 濃縮工藝 采用減壓濃縮工藝，濃縮溫度為65～85 ℃，相對密度為1.25～1.30（80 ℃）。

1.2.6 成型工藝研究 取稠膏，加入天麻細粉，混勻，70 ℃干燥成干膏，粉碎，加適量輔料混勻，用70%乙醇制軟材，擠壓制粒，70 ℃干燥，整粒，加入0.5%的硬脂酸鎂，混勻、壓片（硬度5～6 kg/cm2，平均質(zhì)量0.27 g）、包糖衣、川蠟打光，即得。

1.3 質(zhì)量標準研究

1.3.1 性狀 肉眼觀察益腦心片的外觀、性狀，鼻子聞氣味。

1.3.2 鑒別

1）制何首烏。取益腦心片40片，去除糖衣，研細，加50 mL 甲醇，超聲波 處理（250 W，50 kHz）30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加入10 mL 去離子水使其溶解，加1 mL 鹽酸，水浴加熱30 min，加1%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至10，加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯層，蒸干，殘渣加2 mL 乙酸乙酯使其溶解，作為供試品溶液。取缺制何首烏的陰性樣品10 g，同法制成陰性樣品溶液。取制何首烏對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。取大黃素對照品適量，加三氯甲烷制成每毫升含0.5 mg 大黃素的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法，吸取上述4 種溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠H 薄層板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2）天麻。取益腦心片40片，去除糖衣，研細，加水飽和的正丁醇50 mL，超聲波處理（250 W，50 kHz）30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加2 mL 去離子水使溶解，通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1 cm，柱高為12 cm），依次用去離子水15、20 mL 洗脫（流速為1 mL/min），收集20 mL 去離子水洗脫液，蒸干，殘渣用2 mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺天麻的陰性樣品6 g，同法制成陰性樣品溶液。取天麻素對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg 天麻素的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-去離子水（9∶2∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

1.3.3 檢查 按照《中華人民共和國藥典》［3］（簡稱《中國藥典》）片劑項下有關(guān)規(guī)定（通則0101），對益腦心片外觀、崩解時限、微生物限度進行檢查。

1.3.4 含量測定 按照《中國藥典》［3］高效液相色譜法（通則0512）測定。

1）色譜條件。色譜柱為Agilent ZORBAX SBC18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-1%甲酸溶液（10∶20∶70），檢測波長為286 nm，流速為1.0 mL/min。

2）對照品溶液的制備。稱取丹酚酸B 對照品適量，加75%甲醇，制成每毫升甲醇含0.205 mg 丹酚酸B 的溶液。

3）供試品溶液的制備。取益腦心片20片，去除糖衣，研細成細粉（過三號篩），取0.5 g，加入75%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4）線性與范圍。分別吸取2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20.0 μL 丹酚酸B 對照品溶液，注入液相色譜儀。以丹酚酸B 進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。

5）儀器精密度。取丹酚酸B 對照品溶液，連續(xù)6次注入液相色譜儀，測定峰面積，并進行評價。

6）重復(fù)性。取益腦心片（批號20190601），按“1.3.4”項下方法制備6 份供試品溶液，注入液相色譜儀，測定峰面積，并進行評價。

7）回收率。取益腦心片適量（批號20190601），研細，取粉末0.500 0 g，精密稱定，共6份，分別加入1.0 mL 丹酚酸B 對照品溶液，加入75%甲醇100 mL，稱定重量，超聲波處理（250 W，50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，測定丹酚酸B 峰面積，外標法測定丹酚酸B 的含量并計算回收率。

8）益腦心片中丹酚酸B 的含量測定。取益腦心片（批號20190601、20190602、20190603），按“1.2.1”項下的色譜條件測定，計算益腦心片中丹酚酸B 的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝的正交試驗

2.1.1 正交試驗 益腦心片提取工藝正交試驗結(jié)果見表2。由方差分析結(jié)果（表3）可知，提取時間、溶劑用量對丹酚酸B 提取量無顯著影響（P＞0.05），提取次數(shù)有顯著影響（P＜0.05）。影響因素由大到小依次為次數(shù)、時間、溶劑用量。綜合方差和極差分析，確定益腦心片的最佳提取工藝條件為A1B1C1，即加8倍去離子水煎煮1 h。

表2 益腦心片提取工藝正交試驗結(jié)果

表3 益腦心片提取工藝正交試驗結(jié)果的方差分析

2.1.2 正交試驗結(jié)果驗證 取1/4 倍量處方藥材3份，按照A1B1C1工藝條件提取，同法測定提取液中丹酚酸B 的提取量。丹酚酸B 平均提取量為1 160.83 mg，相對標準偏差（RSD）為3.61%（n=3），表明該提取工藝穩(wěn)定、可行、重復(fù)性好。

2.1.3 優(yōu)化后的益腦心片提取工藝 天麻粉碎成細粉，備用；川芎、制何首烏、山楂、丹參、郁金加8 倍去離子水煎煮1 h，煎液濾過，靜置4 h，取上清液，濾過，減壓濃縮至相對密度為1.25～1.30（80 ℃）的稠膏，即得。

2.2 成型工藝

2.2.1 輔料篩選 以顆粒成型性為評價指標，取適量輔料（種類及用量見表4）與干膏粉混合均勻，加70%乙醇制軟材，制粒。選用硫酸鈣-磷酸氫鈣混合物（質(zhì)量比為1∶1）（試驗號2）、滑石粉（試驗號5）作為填充劑得到的顆粒成型性、可壓性好。益腦心片細粉黏性強、較易吸濕，需加入具有抗吸潮能力的輔料，而滑石粉是常用的防潮輔料。本研究選用滑石粉（含量為5%）作為輔料，不但顆粒成型性好、可壓性好，其防吸潮能力也得到很大改善，滿足制備工藝需要。

表4 益腦心片處方中填充劑的選擇

2.2.2 篩選后的益腦心片制劑成型工藝 取稠膏，加入天麻細粉，混勻，干燥（70 ℃）至干膏，粉碎成細粉，加入5%的滑石粉，混勻，以70%乙醇溶液制粒，干燥（70 ℃），整粒，加入硬脂酸鎂，混勻、壓成1 000片、包糖衣，即得。

2.3 性狀

益腦心片為糖衣片，去除糖衣后顯棕褐色；味苦。

2.4 鑒別

由圖1 可知，益腦心片供試品在與制何首烏對照藥材、大黃素對照品色譜的相同位置處，有相同顏色的斑點，斑點顯色清晰，陰性對照不干擾主斑點。由圖2 可知，益腦心片供試品在與天麻素對照品色譜的相同位置處，有相同顏色斑點，斑點顯色清晰，陰性對照不干擾主斑點。

圖1 益腦心片中制何首烏鑒別的TLC

圖2 益腦心片中天麻鑒別的TLC

2.5 檢查

益腦心片外觀完整光潔，包衣色澤均勻，無色斑；在崩解時限檢查中，各片均在1 h 內(nèi)全部崩解；在微生物限度檢查中，細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)符合《中國藥典》［3］的規(guī)定，未檢出控制菌。

2.6 含量測定

2.6.1 專屬性 取除丹參外的其余藥材及輔料，制備缺丹參的陰性樣品，再按“1.2.1”項下供試品溶液制備方法制成缺丹參的陰性溶液，注入色譜儀，測定。由圖3 可知，供試品溶液中丹酚酸B 峰分離度大于1.5，陰性對照對丹酚酸B峰無干擾。

2.6.2 線性與范圍 線性回歸方程為Y=991 619X+101 641（r=0.999 4），表明當?shù)し铀酈 進樣量為0.41～4.10 μg，進樣量與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.6.3 儀器精密度 丹酚酸B對照品溶液中丹酚酸B峰面積的RSD為0.9%（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性 益腦心片供試品溶液中丹酚酸B 峰面積RSD為1.3%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 回收率 由表5 可知，該方法測定丹酚酸B的平均回收率為99.7%，RSD為1.4%（n=6），表明該方法可以準確測定供試品溶液中丹酚酸B 的含量。

表5 回收率測定結(jié)果

2.6.6 含量測定結(jié)果 3 批益腦心片中丹酚酸B 的含量分別為2.35、2.42 和2.32 mg/片，平均含量為2.36 mg/片。

3 小結(jié)與討論

益腦心片處方中的川芎具有活血化瘀的功效，有效成分為水溶性成分（阿魏酸等）［4］；丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)的作用，活血化瘀有效成分為水溶性成分（丹參素、丹酚酸B 等）；山楂具有行氣散瘀的功效，有效成分為水溶性成分（黃酮類）；制何首烏可用于高血脂的治療，有效成分為水溶性成分（2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等）［5，6］?？梢娞幏街懈黠嬈行С煞忠运苄猿煞譃橹?，因此益腦心片采取水提工藝是合理的。

在原劑型（益腦心顆粒）制劑制備工藝中天麻為打粉入藥，但質(zhì)量標準中卻未對天麻進行鑒別，為提高益腦心片的質(zhì)量標準，本研究采用TLC 法對益腦心片中天麻進行定性鑒別。參考《中國藥典》［3］天麻鑒別方法進行益腦心片薄層鑒別，但是供試品與對照品色譜相應(yīng)位置有褐色斑點，且背景較深，影響了主斑點顏色判斷。本研究對該方法進行了改良，在新條件下，供試品與對照品相同位置顯相同褐色斑點，斑點清晰，Rf為0.5，陰性樣品無干擾，可收入益腦心片的質(zhì)量標準草案。

在制劑含量測定研究中，丹參水溶性成分與丹參藥效作用密切相關(guān)，具有很強的清除自由基和抗氧化作用。自由基參與機體多種疾病包括衰老的發(fā)生和發(fā)展過程，清除自由基、提高機體抗氧化能力，是防治多種疾病的重要途徑之一。丹酚酸是丹參水溶性成分之一，可以清除自由基，減少自由基對機體的損傷，從而產(chǎn)生保護作用，同時通過廣泛的藥理作用，調(diào)節(jié)和改善機體的機能狀態(tài)，促進受損機體組織的修復(fù)和復(fù)原，達到預(yù)防和治療疾病的目的［7-10］。原劑型質(zhì)量標準中，已建立丹參中水溶性成分原兒茶醛的含量測定項，但是含量限度（無蔗糖型）僅為萬分之0.6，不符合中藥新藥質(zhì)量標準制定的要求。本研究選擇丹參中水溶性成分丹酚酸B 作為制劑含量測定指標，所建立的丹酚酸B 含量測定法更合理，適用于益腦心片的質(zhì)量控制。

綜上，本研究的益腦心片制備工藝穩(wěn)定，質(zhì)量控制方法準確、可靠，為益腦心顆粒的二次開發(fā)提供依據(jù)。