混菌發(fā)酵對雪茄煙葉化學(xué)成分及香氣品質(zhì)的影響

毛亞浩，張彤彤，余君，李道宇，陳雄，楊春雷，姚蘭

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

雪茄煙葉經(jīng)采收晾制后無法直接用于雪茄的生產(chǎn)，必須經(jīng)過發(fā)酵才能達(dá)到工業(yè)加工的需求，未經(jīng)發(fā)酵的煙葉青雜氣重且刺激性較大，這是因為在雪茄煙葉內(nèi)存在多種大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)含量在燃燒過程中會產(chǎn)生大量難聞氣體，影響雪茄煙葉整體品質(zhì)［1］。發(fā)酵是改善雪茄煙葉品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，一般分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，與自然發(fā)酵相比，人工發(fā)酵具有成本低、周期短的優(yōu)點，雪茄煙葉發(fā)酵中常采用人工發(fā)酵的方法［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中人工添加部分微生物可以減少煙葉內(nèi)大分子物質(zhì)含量，進(jìn)而提高雪茄煙葉吸食品質(zhì)，使煙葉口感更加協(xié)調(diào)［5］。

酵母菌是一類可以產(chǎn)生香氣物質(zhì)的真菌，由于其產(chǎn)生香味物質(zhì)種類繁多，常被用于食品行業(yè)［6-8］，Assi-clair等［9］研究結(jié)果表明，釀酒酵母發(fā)酵可可豆可以促進(jìn)酯、醛、酮和吡嗪等香味物質(zhì)的形成，使其具有強(qiáng)烈的果香和花香。近年來，部分研究結(jié)果表明混菌發(fā)酵相比于單菌發(fā)酵更有利于產(chǎn)品風(fēng)味的形成［10］，Singracha等［11］使用嗜鹽四聯(lián)球菌、魯氏接合酵母和季也蒙畢赤酵母混合發(fā)酵制備醬油，結(jié)果表明，與對照相比，乙醇、2-甲基-1-丙醇和麥芽酚等揮發(fā)性風(fēng)味化合物含量顯著提高；Xu等［12］研究發(fā)現(xiàn)，使用混合發(fā)酵劑（季也蒙畢赤酵母、畢赤酵母和舊金山乳桿菌）發(fā)酵面包可以增強(qiáng)其感官品質(zhì)，促進(jìn)2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、糠醛和乙酸等芳香化合物的形成。Hou等［13］研究表明，接種葡萄園有孢漢遜酵母P5 和釀酒酵母P1 發(fā)酵后的蘋果酒中2-苯基乙酸乙酯（玫瑰和蜂蜜香味）是對照的4.6倍，經(jīng)感官分析發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵后的蘋果酒香味明顯改善。

酵母菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)香能力，但將酵母菌應(yīng)用于雪茄煙葉發(fā)酵中以提高雪茄煙葉香氣的報道較少。本研究以從雪茄煙葉表面篩選出來的一株纖維素降解菌C1 與5 種具有產(chǎn)香能力的酵母共同處理雪茄煙葉，探究復(fù)合微生物對雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量以及品質(zhì)的影響，同時也能為酵母菌在雪茄煙葉發(fā)酵中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉來源于湖北省十堰市丹江口市習(xí)家店煙草站CX-014 晾制結(jié)束的雪茄茄芯中部煙葉。

供試菌株C1 篩選自雪茄煙葉表面；庫德畢赤酵母、費比恩酵母、漢遜酵母、Starmerella bacillaris、拜爾接合酵母均使用由本實驗室保藏的菌株。

纖維素產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白棟10 g，酵母粉10 g，CMC-Na 10 g，NaCl 5 g，KH2P041 g，去離子水1 000 mL，pH 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

YPD 培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 參考覃明娟等［14］的方法并修改，供試煙葉回潮至適當(dāng)水分后切成煙絲，將培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的菌株C1 與4.5‰葡萄糖、2.25‰谷氨酸混合后，加入無菌水充分溶解制成接種液，將接種液均勻噴灑在煙絲上，平衡水分后，保持煙葉水分為30%，然后放入37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵6 d 后接種酵母菌，30 ℃繼續(xù)發(fā)酵6 d，其中菌株C1 的單菌發(fā)酵條件為單獨接入菌株C1 和上述濃度的葡萄糖、谷氨酸37℃發(fā)酵6 d，酵母菌單菌發(fā)酵條件為單獨接種酵母菌30 ℃發(fā)酵6 d，發(fā)酵結(jié)束后，40 ℃烘干制樣。

1.2.2 發(fā)酵方案 由于在試驗過程中發(fā)現(xiàn)菌株C1與酵母菌同時發(fā)酵雪茄煙葉過程中無法共同生長，因此采用分段發(fā)酵的方法進(jìn)行雪茄煙葉的發(fā)酵，試驗方案設(shè)計見表1。

表1 試驗方案設(shè)計

1.2.3 煙葉主要化學(xué)成分測定 參照Yao等［15］的方法進(jìn)行測定，取烘干后的煙葉粉末0.25 g，加入25 mL萃取液（1%乙酸，2%乙醇）震蕩1 h后，使用連續(xù)流動分析儀對過濾后的上清液進(jìn)行化學(xué)成分測定。

1.2.4 同時蒸餾萃?。⊿DE）煙草揮發(fā)性香氣物質(zhì) 將煙葉去除主脈，烘干粉碎過篩后，準(zhǔn)確稱取10.0 g，放入1 000 mL 圓底燒瓶中，并加入200 mL 飽和食鹽水；稱取60 mL 二氯甲烷于100 mL 圓底燒瓶中，分別連接在SDE 裝置兩側(cè)。有機(jī)相（二氯甲烷）使用55 ℃水浴加熱，水相使用160 ℃油浴加熱。待水相和有機(jī)相達(dá)到液液分層后，繼續(xù)反應(yīng)5 h，收集有機(jī)相萃取液，同時使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮至2 mL，加入50 μL 1.202 8 mg/mL 乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)。干燥后，使用0.22 μm 微孔有機(jī)濾膜過濾后裝入Agilent進(jìn)樣瓶中。

1.2.5 GC/MS 條件 氣相色譜：Agilent Techologies 7890A；色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；分流比：10∶1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min，以2 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min，然后10 ℃/min升至280 ℃；質(zhì) 譜：Agilent Techologies 5975C；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；電離方式EI：70 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設(shè)置3 個平行，采用Origin 2019 作圖、Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中雪茄煙葉主要化學(xué)成分的變化

煙葉主要化學(xué)成分是影響雪茄煙品質(zhì)的重要指標(biāo)，決定了煙葉吸食的協(xié)調(diào)性［16］。雪茄煙發(fā)酵過程中主要化學(xué)成分變化如圖1 至圖4 所示。由圖1 可以看出，在雪茄煙葉發(fā)酵過程中，還原糖含量總體呈下降趨勢，但還原糖降低速率有較大差異，說明在雪茄煙葉發(fā)酵過程中微生物利用還原糖作為碳源進(jìn)行生長發(fā)育。其中在單菌發(fā)酵方案中，雪茄煙葉發(fā)酵結(jié)束后還原糖含量在0.28%～0.32%，而在混合發(fā)酵方案中，其還原糖含量在0.21%～0.26%，這可能是由于接種微生物種類不同，其在雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵過程中的生長情況不同所致。圖2 是發(fā)酵過程中雪茄煙葉總糖含量的變化趨勢，可以看出在發(fā)酵過程中總糖含量變化趨勢與還原糖基本一致，其中單菌方案中，發(fā)酵結(jié)束雪茄煙葉總糖含量在0.70%～0.83%，而混合方案總糖含量在0.60%左右。

圖1 雪茄煙葉發(fā)酵過程中還原糖含量的變化

圖2 雪茄煙葉發(fā)酵過程中總糖含量的變化

煙堿是雪茄煙中重要的植物堿，煙堿含量決定了煙葉的勁頭，也是煙葉中主要有害物質(zhì)之一［17］。圖3 和圖4 分別是雪茄煙葉發(fā)酵過程中煙堿和總氮含量的變化曲線圖，可以看出在雪茄煙葉發(fā)酵過程中煙堿和總氮含量基本保持不變，其中煙堿含量為5.24%～5.71%，而總氮含量為2.71%～3.20%，這與張銳新等［18］的研究結(jié)果一致。

圖3 雪茄煙葉發(fā)酵過程中煙堿含量的變化

圖4 雪茄煙葉發(fā)酵過程中總氮含量的變化

2.2 雪茄煙葉中揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)的變化

對不同方案發(fā)酵過程中雪茄煙葉揮發(fā)性中性香氣成分進(jìn)行測定，共發(fā)現(xiàn)23 種香氣物質(zhì)，可分為5類：美拉德反應(yīng)產(chǎn)物、苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以及其他香氣物質(zhì)［19］。由表2 和表3 可以看出，單菌發(fā)酵方案中，菌株C1 和費比恩酵母發(fā)酵后的雪茄煙葉總香氣含量較高，分別為638.17 μg/g 和606.53 μg/g?；炀l(fā)酵后，雪茄煙葉香氣物質(zhì)含量顯著提高，其中菌株C1和漢遜酵母共同處理后的雪茄煙葉總香氣物質(zhì)含量最高為998.09 μg/g，與單菌發(fā)酵中香氣物質(zhì)含量最高的方案相比提高了56.4%。試驗結(jié)果表明，雪茄煙葉在經(jīng)過菌株C1 處理后再經(jīng)過庫德畢赤酵母、漢遜酵母、費比恩酵母和Starmerella bacillaris繼續(xù)發(fā)酵可以有效提高雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量，從而進(jìn)一步提高雪茄煙葉品質(zhì)。

新植二烯是雪茄煙葉中含量最高的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，新植二烯在雪茄煙葉燃燒時可以攜帶其他香氣物質(zhì)進(jìn)入煙氣，是煙葉的重要增香劑［19］。在單菌發(fā)酵方案中，新植二烯含量最高為471.19 μg/g，而在混菌階段發(fā)酵方案中，除拜耳接合酵母外，其余4 種酵母菌與菌株C1 共同發(fā)酵后的雪茄煙葉新植二烯含量均明顯高于單菌階段發(fā)酵，其中菌株C1 和漢遜酵母共同發(fā)酵后的雪茄煙葉中新植二烯含量高達(dá)755.38 μg/g。

雪茄煙葉發(fā)酵過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物主要有糠醛、糠醇等呋喃類物質(zhì)［20］，由表2、表3 可知，單酵母發(fā)酵方案中，拜耳接合酵母處理后的雪茄煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高為4.17 μg/g，而混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量明顯提高。其中方案10 即菌株C1和Starmerella bacillaris共同發(fā)酵后的雪茄煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高為15.39 μg/g，約是未經(jīng)菌株C1 處理組的4 倍。在菌株C1 分別與庫德畢赤酵母和拜耳接合酵母混合發(fā)酵的雪茄煙葉中糠醇含量較高分別為7.22 μg/g 和7.78 μg/g，約是單酵母發(fā)酵煙葉中的5倍，約是單菌株C1 發(fā)酵的1.4倍。單菌發(fā)酵方案中，菌株C1 發(fā)酵后的煙葉中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量最高，除漢遜酵母外，其余酵母菌方案的雪茄煙葉無明顯差異；而混菌方案中，除菌株C1 和費比恩酵母處理后煙葉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物較低，其余組合差異較小。這些差異可能與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的形成有關(guān)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是由還原糖和氨基酸在一定溫度下發(fā)生的［21］，而菌株C1 在雪茄煙發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生纖維素酶，使部分纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖更有利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行。

苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是雪茄煙重要的香氣成分，其中苯乙醇、苯甲醇等具有強(qiáng)烈的花香，可以顯著提高雪茄煙的風(fēng)味［20］。分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株C1、菌株C1與漢遜酵母以及菌株C1與Starmerella bacillaris共同發(fā)酵后的雪茄煙葉苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量較高，在36.25～43.69 μg/g，是其余方案的2 倍左右。經(jīng)過復(fù)合微生物發(fā)酵的煙葉與單菌相比苯甲醇、苯乙醇含量明顯提高，這對提高雪茄煙風(fēng)味有重要作用。值得注意的是在單菌發(fā)酵后的雪茄煙葉中都檢測到苯乙醛的存在，而在混菌發(fā)酵后苯乙醛基本消失，推測可能是由于添加復(fù)合微生物導(dǎo)致雪茄煙表面微生物組成發(fā)生變化，促進(jìn)苯乙醛脫氫轉(zhuǎn)化為苯乙醇所致［22］。另外經(jīng)漢遜酵母和費比恩酵母發(fā)酵過的雪茄煙葉苯甲醇含量均明顯提高，說明這兩種酵母更有利于苯甲醇的合成。

類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是煙葉中除新植二烯外含量最高的香氣物質(zhì)種類，由表2、表3 可以看出，單酵母菌發(fā)酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量差異不大，含量在38.40～45.00 μg/g，說明酵母菌對類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化作用不顯著。除庫德畢赤酵母外，經(jīng)過菌株C1 和其余酵母菌發(fā)酵后的雪茄煙葉類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量均明顯提高，其中菌株C1 與漢遜酵母共同發(fā)酵后的煙葉中類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量最高為80.85 μg/g，約是單酵母發(fā)酵的2 倍。與單酵母發(fā)酵相比，經(jīng)過菌株C1 發(fā)酵后的煙葉中大馬士酮、巨豆三烯酮A 以及巨豆三烯酮B 含量均明顯提高。推測可能是由于菌株C1 在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生CCD1、CCD4 等類胡蘿卜素裂解雙加氧酶從而促進(jìn)類胡蘿卜素的降解轉(zhuǎn)化［23］。西柏烷類轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要是茄酮，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各方案中茄酮含量變化不明顯，均在20 μg/g 左右。

表2 單菌發(fā)酵揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)含量（單位：μg/g）

表3 混菌發(fā)酵揮發(fā)性中性香氣物質(zhì)含量（單位：μg/g）

產(chǎn)香酵母在煙葉上的應(yīng)用報道較少，近年來有部分學(xué)者將產(chǎn)香酵母應(yīng)用到煙葉發(fā)酵中，得到了較好的效果。胡志忠等［24］利用產(chǎn)香酵母發(fā)酵煙葉后發(fā)現(xiàn)煙葉中新增多種致香物質(zhì)，且新植二烯含量與對照相比增加了78.07 μg/g。郭林青等［25］研究結(jié)果表明，漢遜酵母發(fā)酵煙沫后其醇類物質(zhì)含量明顯增加，與對照相比其發(fā)酵液香味明顯改善。帥瑤等［26］、薛磊等［27］研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合微生物對煙葉發(fā)酵后，煙葉中β-大馬酮等多種香氣物質(zhì)含量增加，煙氣細(xì)膩度改善，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，雜氣減輕顯著，煙葉質(zhì)量明顯改善，這與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究使用階段發(fā)酵的方法處理雪茄煙葉，通過利用菌株C1 對煙葉纖維素的降解作用以及酵母的產(chǎn)香能力對雪茄煙葉進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單酵母發(fā)酵方案中費比恩酵母發(fā)酵后的雪茄煙葉香氣物質(zhì)總量最高為606.53 μg/g，其余酵母無明顯差異，均在500 μg/g 左右。而經(jīng)過菌株C1 與酵母菌株混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉與單菌發(fā)酵相比香氣物質(zhì)總量明顯提高，其中以菌株C1 和漢遜酵母混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉效果最顯著，香氣物質(zhì)總量達(dá)到998.09 μg/g，為費比恩單菌發(fā)酵的1.6 倍。

經(jīng)復(fù)合微生物混菌發(fā)酵后的雪茄煙葉揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類沒有變化，但含量顯著提高，其中漢遜酵母和費比恩酵母處理后的雪茄煙葉苯甲醇含量明顯高于其他處理組，菌株C1 更有利于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物以及苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成。