陳艾提取物的總黃酮、總酚酸含量及抗氧化活性研究

王倩，楊利博，崔美香，王乃澤，趙敏，武玉翠

（1.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；2.河北交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050035）

艾草（Artemisia argyiLevl.et Van）是菊科蒿屬草本植物，因其全草入藥，具有溫經(jīng)止痛、祛風(fēng)散寒、抑菌抗蟲和抗氧化等功效［1］，臨床上常用于婦科、消化系統(tǒng)、皮膚類等病癥的治療。艾草的主要活性成分包括揮發(fā)油、多糖類化合物、黃酮類化合物、酚酸類化合物等，有非常重要的藥用價(jià)值［2］。現(xiàn)代研究表明，艾草有抗氧化、抗腫瘤、抑菌等多種藥理活性，這主要?dú)w功于艾葉中揮發(fā)油、酚酸以及黃酮類成分的共同作用，從中將有效成分提取出來(lái)是實(shí)現(xiàn)其藥用價(jià)值的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3，4］。陳艾需要時(shí)間的沉淀，經(jīng)過(guò)四季交替才能完成，時(shí)間越長(zhǎng)，艾的味道越醇厚，疏通經(jīng)脈的效果也會(huì)越好，所以才有“七年之病，求三年之艾”的說(shuō)法。

目前，關(guān)于艾草的成分研究主要針對(duì)其揮發(fā)油以及多糖的測(cè)定，本研究以不同年份陳艾及其脫絨后陳艾殘?jiān)鼮樵?，用超聲輔助提取總黃酮、總酚酸，探究不同年份陳艾及其艾渣中含量變化趨勢(shì)，考察與其抗氧化活性的相關(guān)性，從科學(xué)的角度對(duì)艾草的使用價(jià)值提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為艾草的高效利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

YB-1000A 型多功能藥物粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司；Adventurer AX 系列萬(wàn)分之一電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；HH-S 型恒溫水溫箱，天津賽得利實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；ST8 ST8R 型熱電高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 材料與試劑

材料：產(chǎn)自河北邯鄲新鮮艾草、儲(chǔ)存一年陳艾、儲(chǔ)存三年陳艾及脫絨后的艾渣。分別粉碎后過(guò)60目篩，粉末裝密封袋置于陰涼干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：蘆丁對(duì)照品、沒食子酸對(duì)照品、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼 基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′-聯(lián)氨-雙二胺鹽［2，2′-azino-bis（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）di-ammonium salt，ABTS］、奎諾二甲基丙烯酸酯（水溶性維生素E，6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；無(wú)水乙醇、Folin-Ciocalteu 試劑、甲醇、5% NaNO2、10% Al-Cl3、4%NaOH、Na2CO3、K2S2O8。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮的提取與測(cè)定

1）總黃酮的提取。將干燥的待測(cè)樣品放入粉碎機(jī)打磨成粉末狀，過(guò)篩后裝入瓶中備用。稱取樣品粉末20 mg，加入乙醇溶液進(jìn)行提取，超聲完畢后，5 000 r/min離心3 min，將上清液移至另一離心管；殘?jiān)鼜?fù)提1次，2次上清液合并為樣品提取液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱取10.0 mg 用60%乙醇配制濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁對(duì)照液；依次稀釋成濃度為0.50、0.40、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01 mg/mL 的溶液，并各取500 μL 于10 mL 離心管中；依次加入4 mL 60%乙醇、100 μL 5% NaNO2溶液，充分混勻并室溫靜置6 min；再加入100 μL 10% AlCl3溶液，充分混勻并靜置6 min 逐漸變色；最后加入300 μL 4% NaOH 溶液，搖勻，室溫顯色反應(yīng)10 min；以60%乙醇為空白校正，采用紫外可見分光光度法于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3 次。以平均吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)計(jì)算得出線性回歸方程y=1.029 5x-0.001 8，r2=0.999 9。

3）精密度試驗(yàn)。從0.2 mg/mL 蘆丁溶液中吸取500 μL，取6份，測(cè)定其吸光度，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.03%，表明該方法精密度良好。

4）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取6 份待測(cè)樣品，完成樣品溶液制備，測(cè)定并計(jì)算樣品中總黃酮含量，為（189.55±1.14）mg/g，RSD為0.6%。

5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取待測(cè)樣品分別于0、1、2、3、4 h 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，樣品中總黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（190.23±1.09）mg/g，RSD為0.57%，表明其溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2 總酚酸的提取與測(cè)定

1）總酚酸的提取。稱取一定重量待測(cè)樣品粉末，加入適量乙醇溶液進(jìn)行超聲提取，5 000 r/min 離心3 min，將上清液移至另一離心管；殘?jiān)鼜?fù)提1次，2 次上清液合并為樣品提取液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱取10.0 mg，用去離子水制成終濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸對(duì)照品母液；再依次用去離子水稀釋至濃度分別為5、10、20、30、40、50、100 μg/mL 的梯度溶液；取稀釋后各梯度溶液200 μL 于10 mL 離心管內(nèi)，分別加入200 μL Folin-Ciocalteu 試劑，室溫暗反應(yīng)8 min；最后加入600 μL Na2CO3（7.5%，W/V）、4 mL去離子水，充分混勻后，40 ℃水浴30 min。以去離子水為空白校正，于波長(zhǎng)765 nm 處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3 次。以平均吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)計(jì)算得出線性回歸方程y=4.956 8x+0.014 3，r2=0.999 2。

3）精密度試驗(yàn)。從1.0 mg/mL 沒食子酸對(duì)照品母液中精確吸取200 μL，取6份，測(cè)定吸光度，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.98%，表明該方法精密度良好。

4）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取待測(cè)樣品6份，完成樣品溶液制備，測(cè)定并計(jì)算樣品中總酚酸含量，為（45.98±0.76）mg/g，RSD為1.66%。

5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取待測(cè)樣品分別于0、1、2、3、4 h 測(cè)定。結(jié)果顯示，樣品中總酚酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（39.39±1.16）mg/g，RSD為2.93%，表明其溶液在4 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.3 總黃酮抗氧化活性試驗(yàn)

1）清除DPPH 自由基能力的測(cè)定。精密稱取1 mg DPPH，使用甲醇將其完全溶解后定容至100 mL的容量瓶?jī)?nèi)，得到濃度為0.001%的DPPH 反應(yīng)溶液，避光儲(chǔ)存。以提取液中所含材料的質(zhì)量濃度為單位，分別將樣品提取液稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL，各取不同濃度梯度的樣品溶液200 μL，依次加入1.2 mL 的DPPH 反應(yīng)溶液，搖晃均勻后，室溫避光靜置30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定反應(yīng)液吸光度（A樣品），同時(shí)將甲醇反應(yīng)液的吸光度作為空白（A空白），試驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。依照DPPH 自由基清除率公式，計(jì)算出不同濃度下樣品DPPH 自由基清除率，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，DPPH 清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)GraphPad Prism 軟件計(jì)算出不同濃度下樣品自由基清除能力的IC50值。DPPH自由基清除率公式如下：

2）ABTS+自由基清除能力測(cè)定。精密稱取384.076 mg ABTS，用去離子水定容至100 mL 容量瓶中，配制成濃度為7 mmol/L 的ABTS 溶液。稱取66.284 mg K2S2O8，用去離子水定容至100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，配制成濃度為2.45 mmol/L 的K2S2O8水溶液。將上述2 種溶液各取10 mL 混合均勻，室溫避光條件下放置12～16 h，得到ABTS+工作液母液。用適量的無(wú)水乙醇將其稀釋至波長(zhǎng)734 nm 處吸光度為0.7±0.02 的溶液，制成ABTS+工作液。以水溶性維生素E（Trolox）作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用無(wú)水乙醇稀釋成濃度為0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再分別取0.1 mL 上述各濃度溶液，依次加入4 mL ABTS+工作液，室溫避光反應(yīng)6 min后，于734 nm 處測(cè)定吸光度（A樣品），同時(shí)將去離子水反應(yīng)液的吸光度作為空白（A空白）。依照ABTS+自由基清除率公式，計(jì)算ABTS+自由基清除率，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)樣品提取液適當(dāng)稀釋后，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出ABTS+自由基清除率，帶入相對(duì)于水溶性維生素E（Trolox）含量公式Y(jié)=377.96X+8.429 4，得出與單位干材料樣品同等ABTS+自由基清除能力的Trolox 等同物質(zhì)含量，以Trolox 抗氧化活性當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）為單位。ABTS+自由基清除率公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中總黃酮含量

由圖1 可知，不同放置時(shí)間下艾草及艾渣總黃酮含量差異明顯。總黃酮含量為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草。三年陳艾提取黃酮效果最好，為191.33 mg/g，約是脫絨后艾渣總黃酮含量的2.95倍，一年陳艾總黃酮含量的2倍，新鮮艾草總黃酮含量的5.93 倍。可見脫絨后艾渣仍含有黃酮類物質(zhì)，并且有一定的利用價(jià)值。

圖1 不同年份陳艾及艾渣中總黃酮含量

2.2 樣品中總酚酸含量

由圖2 可知，新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的總酚酸含量有顯著差異，分別為5.52、30.40、43.45、19.88 mg/g。總酚酸含量高低依次為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草，說(shuō)明三年陳艾使用價(jià)值最高，其脫絨后艾渣也為今后提供了重要的研究?jī)r(jià)值。

圖2 不同年份陳艾及艾渣中總酚酸含量

2.3 樣品提取物清除DPPH 自由基能力

不同年份陳艾及脫絨后艾渣提取物在不同樣品濃度條件下清除DPPH 自由基能力如圖3 所示。在相同濃度范圍內(nèi)，不同年份的提取物對(duì)DPPH 自由基的清除作用存在差異。當(dāng)樣品濃度在0.05～0.20 mg/mL時(shí)，各樣品提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力增長(zhǎng)較快。其中，三年陳艾提取物對(duì)DPPH 自由基清除率從25.89%增加到94.15%；而新鮮艾草提取物對(duì)DPPH 自由基清除率增長(zhǎng)較為緩慢，由4.85%增加到17.15%。當(dāng)樣品濃度在0.25～0.35 mg/mL時(shí)，一年陳艾提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率約達(dá)94.51%，三年陳艾提取物高達(dá)96.81%。新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的IC50 值分別為0.69、0.13、0.09、0.41 mg/mL。三年陳艾提取物IC50值最低，可見三年陳艾提取物對(duì)DPPH 自由基有較強(qiáng)的清除作用。

圖3 不同濃度下陳艾及艾渣提取物DPPH 自由基清除活性比較

2.4 樣品提取物清除ABTS+自由基能力

不同年份陳艾及脫絨后艾渣提取物在不同濃度條件下清除ABTS+自由基能力如圖4 所示。各樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率分別為新鮮艾草23.53%、一年陳艾53.24%、三年陳艾53.84%、三年脫絨后艾渣27.39%。對(duì)ABTS+自由基的清除能力依次為三年陳艾＞一年陳艾＞三年陳艾艾渣＞新鮮艾草，說(shuō)明三年陳艾對(duì)ABTS+自由基的清除能力與一年陳艾相當(dāng)，有較強(qiáng)的清除作用。將所得清除率帶入相對(duì)于水溶性維生素E（Trolox）含量公式，由圖5 可知，一年與三年陳艾水溶性維生素E（Trolox）含量無(wú)顯著性差異，新鮮艾草與三年陳艾艾渣也無(wú)顯著差異。新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣對(duì)ABTS+自由基清除能力相對(duì)于水溶性維生素E（Trolox）含量分別為7.99、23.71、24.03、10.03 mg/g，說(shuō)明三年陳艾提取物不但對(duì)ABTS+自由基有較好的清除作用，而且相對(duì)于水溶性維生素E（Trolox）含量也是最高的，反之新鮮艾草含量相對(duì)較低。

圖4 不同年份陳艾及艾渣提取物對(duì)ABTS+自由基清除活性比較

圖5 不同年份陳艾及艾渣ABTS+自由基清除能力相對(duì)于Trolox 含量比較

2.5 陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關(guān)性分析

各樣品提取物的總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關(guān)性（圖6）顯示，陳艾總黃酮、總酚酸含量與其DPPH 自由基清除能力相關(guān)系數(shù)分別為0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），與ABTS+自由基清除能力相關(guān)系數(shù)分別為0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因?yàn)镻＞0.05，所以相關(guān)系數(shù)無(wú)意義，說(shuō)明陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性無(wú)顯著相關(guān)性。

圖6 陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性的相關(guān)性比較

3 小結(jié)與討論

黃酮類化合物與酚酸類化合物是存在于自然界具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類化合物，廣泛存在于藥用植物中，屬于植物在長(zhǎng)期自然過(guò)程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物［5，6］。相關(guān)研究表示，不同年份不同產(chǎn)地艾草所含總黃酮、總酚酸成分也有所差異。呂雪［7］在分析艾葉中有效成分的變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著艾葉生長(zhǎng)年份的增加，其有效成分含量也隨之發(fā)生變化。其中，總黃酮類成分隨年份的增加而逐漸增加，達(dá)到峰值后再降低，與龔敏等［8］的觀點(diǎn)相似，他們對(duì)一到五年的陳艾總黃酮進(jìn)行了研究，認(rèn)為陳艾中總黃酮含量隨儲(chǔ)存年份的延長(zhǎng)逐年升高，但在第3 年達(dá)到峰值后開始急劇下降。薛紫鯨等［9］對(duì)6 個(gè)采收時(shí)期36 批祁艾進(jìn)行了總黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果表明，不同采收期的祁艾化學(xué)成分含量存在一定的差異性，不同采收期總黃酮含量變化規(guī)律較為一致，均以第3 個(gè)采收期的含量最高，而且黃酮類指標(biāo)成分含量變化與總黃酮含量變化趨勢(shì)較為相同。此外，楊觀蘭等［10］在研究南酸棗葉總黃酮及其抗氧化活性的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，南酸棗葉黃酮純化后有較強(qiáng)的抗氧化活性，在一定濃度范圍內(nèi)呈依賴關(guān)系，并且認(rèn)為在相同黃酮濃度范圍，濃度增加其自由基清除能力越強(qiáng)。黃琴等［11］同樣在研究時(shí)發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛總黃酮含量、總酚含量與抗氧化活性之間密切相關(guān)。而尚紅梅等［12］研究表明，菊苣根的抗氧化活性與其總黃酮含量相關(guān)性不大，但與總酚含量明顯相關(guān)。王畢妮等［13］研究發(fā)現(xiàn)，紅棗中總黃酮、總酚含量與其抗氧化活性無(wú)顯著相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致，陳艾總黃酮與總酚酸含量和采用DPPH、ABTS+法評(píng)價(jià)的抗氧化性無(wú)顯著相關(guān)，說(shuō)明黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的復(fù)雜性是影響結(jié)果差異的重要因素之一。

本研究采取了簡(jiǎn)單易行的超聲輔助提取法對(duì)陳艾中的黃酮類及酚類物質(zhì)進(jìn)行了提取，并且對(duì)其抗氧化活性有了初步的研究。結(jié)果表明，新鮮艾草、一年陳艾、三年陳艾及脫絨后艾渣的總黃酮、總酚酸含量存在差異?？傸S酮及總酚酸含量會(huì)隨儲(chǔ)存年份的增加而逐漸增加，其抗氧化活性會(huì)因濃度的增加而隨之增強(qiáng)。不同年份陳艾提取物抗氧化活性存在較大差異。最終得出儲(chǔ)存三年陳艾總黃酮、總酚酸含量較高，同樣對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基有較強(qiáng)的清除能力，而新鮮艾草所含黃酮類、酚類物質(zhì)較少，對(duì)自由基的清除率也相對(duì)較低。據(jù)相關(guān)性研究顯示，陳艾總黃酮、總酚酸含量與其DPPH 自由基清除能力相關(guān)系數(shù)分別為0.698 3（P＞0.05）、0.871 6（P＞0.05），與ABTS+自由基清除能力相關(guān)系數(shù)分別為0.680 0（P＞0.1）、0.816 0（P＞0.05），因?yàn)镻＞0.05，所以相關(guān)系數(shù)無(wú)意義，說(shuō)明陳艾總黃酮、總酚酸含量與其抗氧化活性無(wú)顯著相關(guān)性。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)脫絨后的艾渣中含有黃酮類及酚類物質(zhì)，雖然含量相對(duì)陳艾有所降低，但仍有利用價(jià)值。通過(guò)提取艾絨以及副產(chǎn)品的深加工，使得艾草的附加值不斷增加，生產(chǎn)過(guò)程中所產(chǎn)生的艾渣在養(yǎng)殖場(chǎng)則是不可或缺的寶貝。飼養(yǎng)戶利用艾渣和一些玉米、谷糠攪拌喂雞喂兔，飼養(yǎng)長(zhǎng)大的雞和兔抗病力有所提高，死亡率也大幅度下降。劉洪麗等［14］研究表明在飼糧中添加艾葉粉可以提高畜禽飼糧粗脂肪的消化率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育。后期可以研究如何高效發(fā)酵艾渣作為飼料，提高其綜合利用價(jià)值。本研究為艾草的陳化期提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，還為艾渣的開發(fā)利用提供了參考方向［15］。