環(huán)境脅迫對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

王偉杰，徐東川，張秀如，于明，林慧彬

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 250014）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根，是中國常用大宗藥材，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效［1］。研究表明，黃芩所含的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管、保肝、抗菌等作用［2，3］。根據(jù)“逆境效應(yīng)”理論，適當(dāng)?shù)耐獠棵{迫有利于藥用植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和積累［4］，通過提高黃酮類次生代謝產(chǎn)物的含量來提高藥效成為黃芩研究的熱點(diǎn)［5，6］。因此本研究分析了黃芩黃酮類化合物合成的途徑，總結(jié)了栽培過程中干旱、光照、溫度、土壤等環(huán)境因子對(duì)黃芩黃酮類化合物合成與積累的影響，以期為優(yōu)化黃芩的栽培方法、提高黃芩產(chǎn)量和質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 黃芩黃酮類化合物的合成途徑

通過對(duì)黃芩黃酮類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制的研究，有利于分析黃芩在面對(duì)脅迫時(shí)體內(nèi)的關(guān)鍵基因、酶的動(dòng)態(tài)變化，從而認(rèn)識(shí)不同類型脅迫對(duì)黃芩生長發(fā)育的影響。黃芩黃酮類化合物是由環(huán)A 和環(huán)B 兩個(gè)苯環(huán)通過3C 鏈連接而成的具有三環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu)（C6-C3-C6）的多酚類植物次生代謝產(chǎn)物，其生物合成經(jīng)歷了三個(gè)階段。

在第一階段中，通過苯丙烷途徑將苯丙氨酸合成4-香豆酰輔酶A［7］。研究發(fā)現(xiàn)，參與這一過程的酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、香豆酸輔酶連接酶（4CL），在PAL 的作用下L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸在C4H 催化下羥基化合成香豆酸，在4CL 的作用下，通過ATP 和Mg2+將香豆酸和肉桂酸分別轉(zhuǎn)化成香豆酰輔酶和肉桂酰輔酶［8］。

在第二階段中，在查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）兩種酶的作用下進(jìn)入黃酮合成途徑。首先，CHS 能將一分子的香豆酰輔酶或者肉桂酰輔酶與三分子的丙二酰輔酶轉(zhuǎn)化成柚皮素查爾酮或者松屬素查爾酮。之后，CHI 催化上述兩種前體物質(zhì)生成二氫黃酮類化合物柚皮素和松屬素。

在第三階段中，二氫黃酮會(huì)通過不同酶生成不同種類的黃酮類化合物。黃芩黃酮類化合物通過黃酮合酶（FNS）合成。黃芩苷元在黃芩素7-O-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UBGAT）作用下轉(zhuǎn)化為黃芩苷類物質(zhì)。黃芩苷類物質(zhì)通過β-葡萄糖苷酸酶（GUS）水解為黃芩苷元類化合物。黃芩黃酮類化合物合成途徑如圖1。

圖1 黃芩黃酮類化合物合成途徑

2 環(huán)境脅迫對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

2.1 干旱脅迫對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

干旱脅迫是限制藥用植物生長最普遍的環(huán)境因素［9］。水分的缺失會(huì)導(dǎo)致植物葉片含水量降低，氣孔關(guān)閉，葉片內(nèi)部CO2的濃度由于擴(kuò)散阻力的增加而顯著降低，使得NADP+的濃度降低，最終使得氧自由基大量增加，從而影響黃芩正常的生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物的積累［10］。程林［11］對(duì)一年生和二年生黃芩面對(duì)生態(tài)脅迫的生理生態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)處于營養(yǎng)期和生殖期的黃芩受到干旱的影響更大，因此在這個(gè)時(shí)期應(yīng)該保證適當(dāng)?shù)乃止?yīng)。同時(shí)，管仁偉等［12］通過代謝組學(xué)研究了黃芩在干旱脅迫時(shí)體內(nèi)黃酮類成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)適度的干旱脅迫有利于黃芩有效成分的積累，但促進(jìn)程度有限，而隨著干旱程度的加大和時(shí)間的延長會(huì)影響次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。當(dāng)黃芩面對(duì)干旱脅迫時(shí)，會(huì)通過一系列生理生化作用改變影響黃芩次生代謝產(chǎn)物合成的基因、酶等的表達(dá)量從而抵御干旱脅迫。Cheng等［13］研究在干旱脅迫過程中黃芩生理特性的變化，發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白質(zhì)（SP）等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量先升高后下降，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性先升高后降低。這說明黃芩能夠通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來改變水勢(shì)適應(yīng)干旱脅迫，通過抗氧化酶含量變化減輕干旱脅迫影響。干旱脅迫還會(huì)誘導(dǎo)激素含量的變化以適應(yīng)脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子能夠影響次生代謝產(chǎn)物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在苯丙烷途徑過程中，SbMYB2 和SbMYB7 能夠通過上調(diào)合成的第一步，下調(diào)最后一步來影響黃酮類化合物的生物合成，而在GA3（赤霉素）處理后發(fā)現(xiàn)，SbMYB8 與SbCHS、SbC4H 的啟動(dòng)子相結(jié)合從而提高黃酮類化合物合成過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)［14-16］。因此，在干旱脅迫過程中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子能夠通過影響關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來響應(yīng)干旱脅迫，進(jìn)而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累。

2.2 光照脅迫對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

光是植物生長發(fā)育過程中必不可少的環(huán)境因素，是植物進(jìn)行光合作用制造有機(jī)物的重要能源［17］。光照能夠通過光照度、光周期以及光質(zhì)三個(gè)方面影響植物的生長發(fā)育［18］。Sun等［19］在研究光強(qiáng)對(duì)黃芩生長的影響中發(fā)現(xiàn)，光強(qiáng)大能夠加快黃芩光合色素的合成，提高初級(jí)代謝產(chǎn)物的含量，增加了合成次生代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)，與此同時(shí)促進(jìn)了相關(guān)酶的表達(dá)從而提高黃芩次生代謝產(chǎn)物的含量。蔡葛平［20］分別用8、12、16 h 的光周期培養(yǎng)黃芩發(fā)現(xiàn)，有關(guān)黃芩黃酮類化合物合成的關(guān)鍵酶基因在黑暗條件下轉(zhuǎn)錄水平升高，因此，短光照周期（8 h 光照，16 h 黑暗）更有利于將糖類轉(zhuǎn)化成黃酮類化合物。研究光質(zhì)對(duì)黃芩的影響發(fā)現(xiàn)，白光、藍(lán)光、紅光有利于黃芩鮮重的積累，而隨著紫外光照射時(shí)間的延長，會(huì)引起植物子葉卷曲、腋生分枝、葉片加厚等；在植物細(xì)胞內(nèi)部導(dǎo)致葉綠素含量降低從而影響光合作用，并且呼吸作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致黃芩生物量降低；但是紫外光有利于PAL 和黃芩苷的合成［21-24］。

同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)光照脅迫通過內(nèi)源激素的變化影響黃芩次生代謝產(chǎn)物的合成。光照能夠使刺激CHS 表達(dá)的生長激素（IAA）持續(xù)減少從而影響黃芩苷的合成；而細(xì)胞分裂素（ABA）在促進(jìn)細(xì)胞分裂過程中會(huì)消耗大量的碳水化合物，影響了黃酮類化合物前體的合成［25］。

2.3 溫度脅迫對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

溫度過高會(huì)使植物葉片萎靡、體內(nèi)鈣離子沉淀，從而破壞植物體內(nèi)葉綠素。同時(shí)，溫度能夠改變植物的生理生化特性，通過影響藥用植物體內(nèi)酶的活性來影響其光合作用、呼吸作用等，進(jìn)而改變體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的含量［26］。不同植物生長發(fā)育與次生代謝產(chǎn)物積累所需要的最佳溫度不同。在對(duì)黃芩的研究中發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)提高溫度會(huì)使黃芩生物量不斷加大，但是黃芩苷在25 ℃下積累量最高，較高或較低溫度均不利于黃芩苷的合成與積累［27］。Yuan等［28］的研究發(fā)現(xiàn)，長期的高溫環(huán)境盡管對(duì)黃芩細(xì)胞造成了一定的損傷，但是對(duì)細(xì)胞生長、干物質(zhì)的積累并沒有產(chǎn)生影響。而黃芩細(xì)胞中PAL 活性降低，導(dǎo)致合成的黃芩苷、黃芩素含量降低，于此同時(shí)，POD、GUS 活性增強(qiáng)，促進(jìn)黃芩苷水解為黃芩素參與到清除活性氧的工作中，二者共同導(dǎo)致了在持續(xù)高溫環(huán)境中黃芩黃酮類化合物含量下降。王帥［29］的研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)牡蜏孛{迫和較大的溫差更有利于黃芩體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累。當(dāng)黃芩受到適當(dāng)?shù)母邷鼗蛘叩蜏孛{迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，抗氧化酶作為體內(nèi)清除活性氧的第一道防線活性增強(qiáng)，而PAL 的活性會(huì)隨著溫度的提升而增強(qiáng)，這促進(jìn)了黃芩體內(nèi)黃芩苷含量的提升。但是隨著脅迫時(shí)間的延長和脅迫程度的加深，與黃酮類化合物合成相關(guān)的PAL、C4H、4CL、CHS 等酶活性增加，但是黃芩苷的含量卻下降，這可能是黃芩苷水解成黃芩素參與清除活性氧造成的。

2.4 土壤因素對(duì)黃芩次生代謝產(chǎn)物的影響

2.4.1 重金屬脅迫的影響 重金屬元素包括必要元素和非必要元素，其含量超過了植物的承受范圍就會(huì)對(duì)植物生長發(fā)育產(chǎn)生脅迫作用。土壤中重金屬元素能夠通過抑制葉綠素的合成以及細(xì)胞的生長，對(duì)藥用植物正常的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。土壤中必要重金屬元素如Cu、Fe、Zn 等對(duì)植物生長發(fā)育、氧化還原反應(yīng)以及其他代謝過程中起到重要的作用，同時(shí)一些非必要重金屬元素如Pb、Hg、As 等對(duì)不同藥用植物的作用需要具體研究［30］。Li等［31］在鋁脅迫對(duì)黃芩光合作用影響的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤環(huán)境的pH 低于5 時(shí)會(huì)使鋁變?yōu)锳l3+，過量的鋁脅迫會(huì)使黃芩氣孔面積降低，胞間CO2濃度急劇上升，從而影響黃芩的光合作用。土壤中也有其他的無機(jī)元素如Se、K、Fe、Mn 對(duì)黃芩苷的合成具有促進(jìn)作用［32，33］。Cao等［34］在砷對(duì)黃芩生長影響的研究中發(fā)現(xiàn)，在土壤中添加低濃度的As時(shí)，有利于促進(jìn)黃芩根的生長，但是對(duì)于黃芩黃酮類化合物沒有顯著影響；在土壤中加入高濃度As時(shí)，會(huì)使黃芩生物量降低，黃芩苷、漢黃芩苷含量降低，但提升了黃芩素和漢黃芩素的含量，并且苷類減少的幅度與苷元上升幅度相似，這可能是因?yàn)樯槊{迫時(shí)，促進(jìn)了黃芩細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使苷類化合物生成苷元類化合物以抵御脅迫。無機(jī)元素不僅能夠提供藥用植物根系所需要的營養(yǎng)來影響植物代謝活動(dòng)以及生長發(fā)育，而且也是黃芩藥用活性成分的重要組成部分［35］。孟慶華等［36］的研究表明，適當(dāng)增加或減少土壤中Zn2+、Mg2+兩種離子的濃度可促進(jìn)黃芩生物量的積累，Zn2+能夠有效促進(jìn)黃酮苷的合成，而Mg2+的作用相反。

2.4.2 營養(yǎng)脅迫的影響 營養(yǎng)缺乏會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長速度和產(chǎn)量。魏東華等［37］的研究表明，施加復(fù)合肥的效果遠(yuǎn)好于不施肥組和單一施肥組，并且N1P3K3和N2P3K1效果最好。表明磷肥對(duì)于黃芩苷的積累影響較大，磷能夠促進(jìn)植物光合作用產(chǎn)物的合成與運(yùn)輸，并且釋放能量促進(jìn)各類化學(xué)反應(yīng)的正常進(jìn)行。曹鮮艷等［38］的研究發(fā)現(xiàn)，隨著施肥水平的不斷提高，可能會(huì)引起黃芩初生代謝產(chǎn)物大量增加，稀釋了黃芩苷的含量，黃芩苷含量增幅明顯降低，造成了黃芩苷含量先降低后升高。而施肥量持續(xù)增加，反而會(huì)導(dǎo)致黃芩產(chǎn)量減少。碳水化合物除了作為重要的能量來源，也能夠影響初級(jí)和次級(jí)代謝［39］。在Park等［40］的研究中，采用不同碳水化合物培養(yǎng)黃芩，以確定適合黃芩黃酮類化合物合成積累的最佳碳源，結(jié)果表明，蔗糖能夠促進(jìn)黃芩生長以及有利于黃芩素的積累，果糖是黃芩苷合成的最佳碳源，半乳糖對(duì)漢黃芩素的促進(jìn)作用最大。

3 小結(jié)

黃芩生長過程中遭受脅迫時(shí)，會(huì)引起機(jī)體的一系列反應(yīng)。在黃芩的表觀性狀和生長發(fā)育上會(huì)引起植株矮小、葉片枯黃等。對(duì)于黃芩體內(nèi)生理特性會(huì)通過激活抗氧化酶活性、合成黃酮類次生代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡等方式清除體內(nèi)過剩的活性氧以抵抗脅迫。但是，也有研究表明在適當(dāng)程度的環(huán)境脅迫下，有利于體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累，從而提高黃芩的藥用價(jià)值。

目前，對(duì)于黃芩面對(duì)環(huán)境影響的研究主要集中在水分、光照、溫度、土壤條件等單一因素的討論上，而對(duì)于復(fù)合脅迫的報(bào)道很少。因此，進(jìn)行一些貼近黃芩道地產(chǎn)區(qū)環(huán)境的復(fù)合脅迫研究能夠更好地了解環(huán)境脅迫對(duì)黃芩生長發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物合成的影響。黃芩對(duì)脅迫的響應(yīng)機(jī)制主要集中在表觀形態(tài)、抗氧化酶、合成關(guān)鍵酶等的探討上，對(duì)于黃芩次生代謝產(chǎn)物在基因、轉(zhuǎn)錄方面調(diào)控機(jī)制的探究不夠全面。進(jìn)一步探究黃芩響應(yīng)環(huán)境脅迫的作用機(jī)制，有利于提高黃芩次生代謝產(chǎn)物、優(yōu)選優(yōu)良的抗逆品種，為黃芩栽培提供指導(dǎo)。