滇重樓葉片和花萼的SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性分析

駱亮仲，李卓蔚，周 濃，夏 李，付旭娟，黃 梅，郭冬琴

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）作為延齡草科重樓屬植物，是一種常見的名貴中藥材，根莖入藥，具有涼肝定驚、消腫止痛、清熱解毒的功效，是“熱毒清”“宮血寧”“季德勝蛇藥片”和“抗病毒顆?！钡犬a(chǎn)品的主要原材料[1]，常用于治療毒蛇咬傷、咽喉腫痛、跌打傷痛等病癥[2]。近些年來，由于中藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，市面上對(duì)滇重樓的需求大幅提升，導(dǎo)致大量野生滇重樓被采挖空，野生滇重樓的產(chǎn)量已不能滿足人們的需求，因此，人工大規(guī)模種植高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的滇重樓刻不容緩。

植物光合作用離不開葉綠素，葉綠素含量直接影響綠色植株的光合效率，進(jìn)而影響植株的營養(yǎng)狀況和生長品質(zhì)，是植物生長的一項(xiàng)重要指標(biāo)[3]。目前對(duì)葉綠素含量的測(cè)定方法主要有SPAD 直接測(cè)定法和傳統(tǒng)的丙酮浸提法，后者測(cè)定結(jié)果較精確，但測(cè)定時(shí)會(huì)損壞葉片，且操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力。而前者則可以在不破壞葉片完整性的情況下，快速準(zhǔn)確地測(cè)定出植株葉綠素含量的相對(duì)值[4]，且不受外部環(huán)境的影響，因而此法逐漸被學(xué)者采用，已在荔枝、柞樹、煙草、蕹菜和江孜沙棘等[5-9]植物中廣泛應(yīng)用。何麗斯等以高山杜鵑為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)SPAD 值與葉綠素含量間存在顯著相關(guān)性，可以用SPAD 值間接預(yù)測(cè)植株葉片的葉綠素含量，但大量數(shù)據(jù)顯示，不同植株或是同一植株的不同部位，其擬合的數(shù)學(xué)模型仍存在著很大的差異性[10]。目前，關(guān)于滇重樓葉片內(nèi)SPAD 值與葉綠素含量之間的關(guān)系尚未見報(bào)道，故本試驗(yàn)以不同生長年限的滇重樓葉片和花萼為供試材料，探究其SPAD 值與葉綠素含量之間的相關(guān)性，旨在為生產(chǎn)中利用SPAD 葉綠素儀估測(cè)滇重樓葉片營養(yǎng)狀況提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

新鮮的滇重樓葉片采自于貴州省安順市西秀區(qū)安順學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)基地，經(jīng)安順學(xué)院沈昱翔副教授鑒定為滇重樓。試驗(yàn)于2021 年9 月15 日10: 00—12: 00 進(jìn)行采樣，隨機(jī)選取不同生長年限的植株各10株，每個(gè)植株摘取1 片長勢(shì)較好、無病蟲害的葉片和花萼，先用SPAD 葉綠素儀測(cè)量3 次，并記錄數(shù)據(jù)；再將其摘下，做好標(biāo)記，閉光、低溫保存，采用丙酮法測(cè)定其葉綠素含量。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 SPAD直接測(cè)定法

采用葉綠素含量測(cè)定儀（CCM200 型）測(cè)定葉片和花萼的頂部、中部、底部的SPAD 值，測(cè)定時(shí)應(yīng)注意避開葉片的損傷部位，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，求取平均值。

1.2.2 丙酮法測(cè)定

將上述測(cè)定的新鮮葉片和花萼表面擦凈，將其摘下并做好標(biāo)記，低溫避光保存，除去葉中脈后剪碎。稱取0.1 g 供試樣品放入研缽中，80%丙酮研磨成勻漿，離心機(jī)4 000 r·min-1離心15 min，將上清液用80%丙酮定容至20 mL 待測(cè)。以80%丙酮為對(duì)照，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長645、663 nm 處的OD 值，代入公式計(jì)算其葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量[11-14]：

式中，Ca、Cb、Ct代表葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量，mg·g-1；D663和D645代表對(duì)應(yīng)波長下的吸光度值；v代表定容體積，mL；W代表稱樣重量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 22.0 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量比較

比較不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值和葉綠素含量，結(jié)果見圖1、圖2。由圖1 可知，隨著種植年限的增加，滇重樓葉片SPAD 值和葉綠素含量的變化趨勢(shì)幾乎不同，其中SPAD 值表現(xiàn)為先增加后減少，而葉綠素a 和總?cè)~綠素含量表現(xiàn)為先增加后減少再增加，葉綠素b 含量則表現(xiàn)為先減少后增加，其中，2 年生的葉綠素b 含量最高，4 年生的SPAD 值、葉綠素a 和總?cè)~綠素含量最高。由圖2 可以看出，隨著種植年限的增加，滇重樓花萼的SPAD 值與葉綠素含量都表現(xiàn)為先降低后增加，其中4 年生的SPAD 值、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量最高，7 年生的葉綠素a 含量最高。通過比較兩圖可以看出，葉片SPAD 值和葉綠素含量均顯著高于花萼。

圖1 滇重樓葉片SPAD值和葉綠素含量比較

圖2 滇重樓花萼SPAD值和葉綠素含量比較

2.2 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素a 含量的相關(guān)性分析

由表1 得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素a 含量之間表現(xiàn)出極顯著相關(guān)性，所有函數(shù)模型的相關(guān)性均達(dá)0.4 以上，其中以5 年生（葉片）的函數(shù)相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.958 4。根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對(duì)數(shù)方程y=0.351 7ln(x)-0.897 8（R2=0.713 2）、指數(shù)方程y=0.228 0e0.0249x（R2=0.539 1）、對(duì)數(shù)方程y=0.294 4ln(x)-0.644 1（R2=0.925 7）、指數(shù)方程y=0.163 2e0.0365x（R2=0.879 3）、指數(shù)方程y=0.194 6e0.0151x（R2=0.958 4）、線性方程y=0.013 4x+0.127 8（R2=0.607 4）、指數(shù)方程y=0.082 8e0.0476x（R2=0.836 4）。

表1 SPAD值與葉綠素a含量的4種函數(shù)關(guān)系模型

2.3 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素b 含量的相關(guān)性分析

由表2 可知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD值與葉綠素b含量之間呈極顯著相關(guān)，總體相關(guān)性均在0.5 以上，其中5 年生滇重樓葉片的SPAD 值與葉綠素b 含量的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.978 5。根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對(duì)數(shù)方程y=1.178 1ln(x)-0.498 6（R2=0.875 0）、指數(shù)方程y=1.895 0e0.0230x（R2=0.806 1）、對(duì)數(shù)方程y=2.231 6ln(x)-4.625 0（R2=0.965 5）、線性方程y=0.059 0x+1.426 1（R2=0.916 8）、對(duì)數(shù)方程y=1.590 4ln(x)-2.838 5（R2=0.978 5）、對(duì)數(shù)方程y=2.860 0 ln(x)-5.680 0（R2=0.677 3）、線性方程y=0.131 6x-0.705 2（R2=0.893 5）。

表2 SPAD值與葉綠素b含量的4種函數(shù)關(guān)系模型

2.4 滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與總?cè)~綠素含量的相關(guān)性分析

采用4 種函數(shù)對(duì)SPAD 值（x）和總?cè)~綠素含量（y）的關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果見表3。由表得知，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與總?cè)~綠素含量之間呈極顯著相關(guān)性，總體相關(guān)性均在0.6以上，其中5 年生滇重樓葉片SPAD 值與總?cè)~綠素含量的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.978 8。根據(jù)相關(guān)系數(shù)大小，確定適用于二年生（葉片）、四年生（花萼）、四年生（葉片）、五年生（花萼）、五年生（葉片）、七年生（花萼）、七年生（葉片）的最優(yōu)函數(shù)方程分別為對(duì)數(shù)方程y=1.529 1ln(x)-1.394 9（R2=0.871 6）、指數(shù)方程y=2.124 7e0.0232x（R2=0.839 6）、對(duì)數(shù)方程y=2.525 0ln(x)-5.267 2（R2=0.968 5）、線性方程y=0.068 8x+1.564 7（R2=0.920 7）、乘冪方程y=0.442 7x0.5482（R2=0.978 8）、對(duì)數(shù)方程y=2.941 1ln(x)-5.503 8（R2=0.731 1）、線性方程y=0.150 7-0.922 4（R2=0.905 2）。分析比較表3、表4 和表5 可以得出，不同生長年限的滇重樓葉片、花萼的SPAD 值與葉綠素含量的相關(guān)性大小總體都表現(xiàn)為：總?cè)~綠素＞葉綠素b＞葉綠素a，且最大相關(guān)性均為5 年生滇重樓的葉片。

表3 SPAD值與總?cè)~綠素含量的4種函數(shù)關(guān)系模型

2.5 滇重樓葉片SPAD 值、葉綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較

滇重樓葉片SPAD 值和葉綠素含量測(cè)定結(jié)果如表4所示，2 年生葉片SPAD 值變化范圍為18.433～67.433，葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.121～0.563 mg·g-1、2.969～4.372 mg·g-1和3.089～4.933 mg·g-1；4年生葉片SPAD值變化范圍為28.533～73.233，葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.324～0.630 mg·g-1、2.588～4.812 mg·g-1和2.910～5.440 mg·g-1；5年生葉片SPAD值變化范圍為22.967～65.233，葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.275～0.529 mg·g-1、2.201～3.763 mg·g-1和2.475～4.291 mg·g-1；7年生葉片SPAD值變化范圍為23.133～41.600，葉綠素a、b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.240～0.635 mg·g-1、2.511～4.969 mg·g-1和2.750～5.602 mg·g-1。

表4 滇重樓葉片SPAD值、葉綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較

（續(xù)表4）

將測(cè)得的不同生長年限滇重樓葉片的SPAD值代入線性回歸方程中，計(jì)算葉綠素的預(yù)測(cè)值，再對(duì)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。由表5可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預(yù)測(cè)滇重樓葉片葉綠素含量的絕對(duì)值。

表5 滇重樓葉片葉綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的P值結(jié)果

2.6 滇重樓花萼葉綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較

由表6 可知，4 年生滇重樓花萼SPAD 值變化范圍為10.067～20.267，葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量變化范圍為0.288～0.552 mg·g-1、2.482～4.032 mg·g-1和2.770～4.533 mg·g-1；5 年生滇重樓花萼SPAD 值變化范圍為4.533～20.567，葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.202～0.366 mg·g-1、1.800～2.622 mg·g-1和2.001～2.979 mg·g-1；7年生滇重樓花萼SPAD值變化范圍為11.933～25.533，葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量的變化范圍為0.260～0.689 mg·g-1、0.771～3.726 mg·g-1和1.196～4.217 mg·g-1。

表6 滇重樓花萼SPAD值和葉綠素含量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較

將測(cè)得的不同生長年限花萼的SPAD 值代入線性回歸方程中，計(jì)算得出葉綠素的預(yù)測(cè)值，再對(duì)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。由表7 可知，p值均大于0.05，這說明不同生長年限滇重樓花萼的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的差異不顯著，因此可采用線性回歸方程來預(yù)測(cè)滇重樓花萼葉綠素含量的絕對(duì)值。

表7 滇重樓花萼葉綠素實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的P值結(jié)果

由表4 和表6 可以看出，不同生長年限滇重樓葉片、花萼的SPAD 值和葉綠素含量都各不相同，但葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量大體上都是隨著SPAD 值的變化而變化，即SPAD 值與葉綠素含量的變化趨勢(shì)保持一致。

3 小結(jié)與討論

SPAD 葉綠素儀是通過測(cè)定綠葉在630、690 nm 兩段波長處的吸光率來評(píng)估綠葉中葉綠素相對(duì)含量的一種手段[15]，在這兩段波長下葉綠素對(duì)光的吸收不同，因此可以對(duì)葉片傳輸光的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，由此得出SPAD 值。采用SPAD 葉綠素儀對(duì)植株葉片的葉綠素含量進(jìn)行估測(cè)，不僅可以省時(shí)省力，測(cè)定還不受溫度和氣候等外部環(huán)境因素的影響，在測(cè)定過程中也不會(huì)對(duì)葉片造成損傷[16]。因此，現(xiàn)如今許多科研工作者都開始采用這種簡單的測(cè)量方法來取代傳統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)測(cè)量法，也收獲了不少成果，但用此法對(duì)滇重樓的研究還未見報(bào)道[17-18]。

本研究通過計(jì)算滇重樓葉片、花萼葉綠素的相對(duì)含量和絕對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)不同生長年限滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量各不相同，總體來看，葉片的葉綠素含量普遍高于花萼，這與高成杰等[19]的研究結(jié)果類似。但4 年生的滇重樓，不管是葉片還是花萼，葉綠素含量均高于其他年生，可能是因?yàn)槭艿綒夂?、土壤、微環(huán)境及生長年限等條件的影響[19-21]，可能4 年生滇重樓植株是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，有待進(jìn)一步從光合特性、生理生化等方面深入研究其機(jī)制。通過線性、指數(shù)、對(duì)數(shù)和乘冪四個(gè)回歸方程[22-24]對(duì)葉片、花萼的SPAD值和葉綠素含量進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)上述4種函數(shù)方程的擬合變量因子均達(dá)到極顯著相關(guān)性，這說明SPAD值與葉綠素含量間呈極顯著正相關(guān)，這與對(duì)甘藍(lán)、油菜、甜瓜、紅楓等[21,25-26]的研究結(jié)果一致。通過對(duì)滇重樓葉片、花萼的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行方差檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值間差異不顯著，這與潘靜[27]和李田等[28]的研究結(jié)果一致，表明無論是滇重樓的葉片還是花萼均可采用SPAD 值表示葉綠素含量，并且通過相應(yīng)的回歸方程，可以求出葉綠素含量的絕對(duì)值。

本研究表明，可以采用SPAD 葉綠素儀代替復(fù)雜繁瑣的傳統(tǒng)手段來測(cè)定滇重樓葉片和花萼的葉綠素含量，這為滇重樓葉綠素含量測(cè)定提供了便捷的手段，也為滇重樓的高效種植模式和田間栽培管理提供理論依據(jù)。