鎖陽(yáng)兒茶素生物合成途徑相關(guān)基因的分析

張倩倩,李冰圳,王智,馮曉宇,姬佳誠(chéng),陳貴林

(1內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;2內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;3牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

鎖陽(yáng)(Cynomoriumsongaricum),為鎖陽(yáng)科、鎖陽(yáng)屬、多年生的全寄生草本植物,又名鐵棒槌、地毛球、烏蘭高腰(蒙語(yǔ)),是中藥和蒙藥中的常用藥物,具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血之功效,常用于治療陽(yáng)痿精虛、大便燥結(jié)等[1]。近年研究結(jié)果表明,鎖陽(yáng)具有多種藥理活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等[2-5]。鎖陽(yáng)廣泛分布于我國(guó)內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海、寧夏等地區(qū)[6]。我國(guó)分布的鎖陽(yáng)多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬植物的根部。

黃酮類化合物是普遍存在于植物中的一類次生代謝物,也是藥用植物鎖陽(yáng)中的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎等多種生理功能[7-8]。黃酮類化合物的合成是苯丙烷代謝途徑的1個(gè)分支,經(jīng)多種酶催化合成,如苯丙氨酸解氨酶(Phenylalamineammonia-lynsey,PAL)、肉桂酸羥化酶(Cinnamate4-hydroxylase,C4H)和查爾酮合酶(Chalconesynthase,CHS)等。兒茶素是由黃酮代謝途徑合成,具有重要的藥理活性,可以作為鎖陽(yáng)的指標(biāo)性成分[9-10]。

鎖陽(yáng)在自然條件下的繁殖率不高,在種子脫落后會(huì)經(jīng)歷持續(xù)的沙埋過(guò)程,并在適宜的生長(zhǎng)條件下完成鎖陽(yáng)種子萌發(fā)、吸器發(fā)育及器官形成等幾個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段,通常需要4—6年才能完成從寄生到出土的過(guò)程[11-12]。不同生育期鎖陽(yáng)中鞣質(zhì)、淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)[13-14]。無(wú)霜期、全年日照時(shí)數(shù)和年平均蒸發(fā)量等環(huán)境因子對(duì)鎖陽(yáng)有效成分的積累也具有明顯影響[15]。此外,有研究表明結(jié)實(shí)期是蒽醌類和三萜的最佳收獲期,類黃酮化合物則在出土前期含量最高[16]。鎖陽(yáng)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)表明,肉質(zhì)莖和花序之間有280種差異代謝物,花序中黃酮醇和黃烷酮等化合物更豐富[17]。

目前,關(guān)于鎖陽(yáng)的研究主要集中在藥理活性等方面,尚未完成基因組測(cè)序,對(duì)于其兒茶素生物合成途徑的研究更是未見報(bào)道。鎖陽(yáng)肉質(zhì)莖是其主要的入藥部位,鎖陽(yáng)花序則被丟棄,造成了資源的極大浪費(fèi)。因此,本研究利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù),對(duì)不同發(fā)育階段的鎖陽(yáng)不同部位中黃酮類生物合成途徑相關(guān)基因進(jìn)行分析,以揭示兒茶素生物合成的分子機(jī)制。本研究為瀕危藥用植物鎖陽(yáng)生物功能基因的挖掘及利用提供了理論基礎(chǔ),對(duì)于鎖陽(yáng)資源的綜合利用及其采收期的確定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

在內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗獨(dú)貴塔拉鎮(zhèn)(E 108°74′,N 39°84′)采集鎖陽(yáng)。選擇鎖陽(yáng)2個(gè)發(fā)育階段的不同部位作為試驗(yàn)材料,即未成花鎖陽(yáng)的莖上端(Cy-1)和莖下端(Cy-2),以及成花鎖陽(yáng)的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5),見圖1。每組樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將鎖陽(yáng)去除須根后用蒸餾水洗凈,用干凈的毛巾吸干其表面水分后,放置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。上述樣品中,一部分用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,另一部分用于兒茶素含量的測(cè)定。

圖1 鎖陽(yáng)的不同發(fā)育階段以及不同部位Figure 1 Different developmental stages and different parts of C. songaricum注：A是未成花;B是成花后。Cy-1是莖上端;Cy-2是莖下端;Cy-3是花序;Cy-4是莖上端;Cy-5是莖下端。

1.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

使用pBIOZOL試劑盒提取鎖陽(yáng)總RNA。cDNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由華大基因完成。通過(guò)Illumina HiSeqTM 2000測(cè)序平臺(tái),得到Raw reads,經(jīng)篩選過(guò)濾獲得Clean reads。使用TGICL和Trinity軟件進(jìn)行組裝,形成Unigene[18-19]。

1.3 基因功能注釋及表達(dá)量分析

將Unigene序列比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)Nt、Nr、KEGG、COG和Swiss-Prot,根據(jù)條件E-value

使用軟件SOAP和FPKM (Fragments per kb per million fragments)值計(jì)算Unigene的表達(dá)量。對(duì)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate,FDR)≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析[20]。

1.4 兒茶素含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件 島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀(日本)測(cè)定,色譜柱：ODS柱(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.04 mol/L枸櫞酸溶液-N, N二甲基甲酰胺-四氫呋喃(50∶4∶1),流速為1.0 mL/min,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm[9,21]。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加50%甲醇配制成164 μg/mL對(duì)照品溶液,進(jìn)樣量依次為1、4、8、12、16、20 μL。依照上述色譜條件測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=107 108x-105 6.4,R2=0.999 8。

1.4.3 供試品溶液 將鎖陽(yáng)粉末過(guò)100目篩,稱取0.8 g置于250 mL圓底燒瓶中,加入100 mL的95%乙醇回流提取40 min,過(guò)濾,取濾液。將殘?jiān)尤?00 mL 95%乙醇再次回流提取20 min,過(guò)濾,合并濾液,減壓濃縮蒸干,加50%甲醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè)[21]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)比較不同處理間的差異顯著性(P<0.05),采用EXCEL統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的整體評(píng)估及基因的功能注釋

對(duì)未成花鎖陽(yáng)的莖上端(Cy-1)、莖下端(Cy-2)以及成花鎖陽(yáng)的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5)進(jìn)行Illumina測(cè)序,分別得到52 665 054條、55 323 034條、54 656 940條、54 272 468條、52 882 120條Clean reads。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝數(shù)據(jù),見表1。

表1 測(cè)序和組裝數(shù)據(jù)的總結(jié)Table 1 Summary of the sequencing and assembly

由表1可知,組裝后在各樣本中分別獲得51 360、77 540、62 181、75 830、86 702個(gè)Unigenes,共獲得106 626個(gè)Unigenes。獲得序列的Q20值均大于98%,GC含量均大于46%。通過(guò)BLAST分析后,分別有59 547、46 362、32 466、33 609、21 040、39 939個(gè)Unigenes在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋。

鎖陽(yáng)Unigene 在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果,見圖2。

(a)序列相似度分布圖

由圖2可知,有41.4%的Unigenes的同源性較低(le-45

2.2 差異表達(dá)基因的GO分類

將篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行GO分析,共有318 909個(gè)差異基因得到注釋,鎖陽(yáng)不同發(fā)育階段、不同部位之間的差異基因數(shù)量不同。在生物學(xué)過(guò)程分類中,注釋到較多基因的詞條主要有“細(xì)胞過(guò)程(Cellular process)”“代謝過(guò)程(Metabolic process)”“單一生物過(guò)程(Single-organism process)”等;在細(xì)胞組分分類中,與“細(xì)胞(Cell)”“細(xì)胞器(Organelle)”“細(xì)胞部分(Cell part)”“膜(Membrane)”等相關(guān)的基因較多;在分子功能分類中,注釋到較多基因的詞條主要包括“催化活性(Catalytic activity)”“結(jié)合(Binding)”“轉(zhuǎn)運(yùn)活性(Transporter activity)”等,與“結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecule activity)”相關(guān)的基因數(shù)量也較多。結(jié)果表明,這些途徑在鎖陽(yáng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

2.3 差異表達(dá)基因的分析

鎖陽(yáng)各部位中差異表達(dá)基因的數(shù)量及其表達(dá)情況,見圖3。

圖3 鎖陽(yáng)中差異表達(dá)基因的數(shù)量Figure 3 Number of differential expressed genes in C. songaricum

由圖3可知,通過(guò)比較同一發(fā)育階段的不同部位(Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4、Cy-3 vs Cy-5、Cy-5 vs Cy-4)和同一部位不同發(fā)育階段(Cy-5 vs Cy-2、Cy-4 vs Cy-2)的DEGs表達(dá)量發(fā)現(xiàn),在Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4和Cy-3 vs Cy-5中,下調(diào)基因數(shù)量均高于上調(diào)基因數(shù)量,而在其他樣本中均表現(xiàn)為上調(diào)基因數(shù)量高于下調(diào)基因數(shù)量。在Cy-5 vs Cy-2、Cy-4 vs Cy-2中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量均較多,且在Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4中較少。與其他樣本相比,Cy-3 vs Cy-1、Cy-4 vs Cy-2、Cy-5 vs Cy-2中的上調(diào)基因數(shù)量較多,說(shuō)明與出土前相比,鎖陽(yáng)在出土后大量基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明,在鎖陽(yáng)的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達(dá)量始終較高,且成花鎖陽(yáng)的整體基因表達(dá)量比未成花鎖陽(yáng)高。

鎖陽(yáng)不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因在KEGG中的通路注釋情況,見圖4。

圖4 基于KEGG通路分析鎖陽(yáng)不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因Figure 4 Analysis of differential expressed genes in different developmental stages of C. songaricum based on KEGG pathway

由圖4可知,將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析,對(duì)于不同發(fā)育階段來(lái)說(shuō),各組樣本均在“全局和總覽圖”中的DEGs最多,主要包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成,此外,翻譯過(guò)程、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝以及折疊、分選與降解途徑也注釋到較多的差異基因。各組樣本之間注釋到較多基因的通路大體相同,只在數(shù)量上有差異,Cy-5 vs Cy-2中注釋到的基因數(shù)量最多,Cy-1 vs Cy-3中注釋到的基因數(shù)量最少。結(jié)果表明,鎖陽(yáng)在不同發(fā)育階段中,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯過(guò)程、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等過(guò)程十分活躍,對(duì)鎖陽(yáng)的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用。

鎖陽(yáng)不同部位的差異表達(dá)基因在KEGG中的通路注釋情況,見圖5。

圖5 基于KEGG通路分析鎖陽(yáng)不同部位的差異表達(dá)基因Figure 5 Analysis of differential expressed genes in different parts of C. songaricum based on KEGG pathway

由圖5可知,同一發(fā)育階段不同部位的通路注釋結(jié)果顯示,各組樣本在“全局和總覽圖”中注釋到的DEGs最多,其次是翻譯、脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝。Cy-3 vs Cy-4和Cy-3 vs Cy-5中DEGs較多,且主要富集在“全局和總覽圖”中,而Cy-1 vs Cy-2和Cy-5 vs Cy-4中DEGs較少,說(shuō)明在成花鎖陽(yáng)的花序和莖之間的差異表達(dá)基因較多,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯和脂質(zhì)代謝等過(guò)程十分活躍,而在未成花鎖陽(yáng)和成花鎖陽(yáng)的莖之間注釋到的差異表達(dá)基因較少。結(jié)果表明,在鎖陽(yáng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯過(guò)程、氨基酸代謝等過(guò)程十分活躍,且在鎖陽(yáng)同一發(fā)育階段的不同部位之間代謝過(guò)程也有差異。

2.4 黃酮類生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

鎖陽(yáng)黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異基因的表達(dá)量,見圖6。

圖6 與鎖陽(yáng)黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異基因的表達(dá)量Figure 6 Expression of differential genes related to flavonoid biosynthesis pathway in C. songaricum注：熱圖塊從左到右分別表示Cy-1,Cy-2,Cy-3,Cy-4,Cy-5;紅色表示表達(dá)量相對(duì)增加;綠色表示表達(dá)量相對(duì)降低。

由圖6可知,在本研究中,共篩選出20個(gè)與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因,包括1個(gè)苯丙氨酸解氨酶基因(Unigene1091_ALL)、1個(gè)肉桂酸-4-羥化酶基因(Unigene37878_ALL)、2個(gè)4-香豆酸-輔酶A連接酶基因(Unigene26993_ALL、Unigene5468_ALL)、2個(gè)查爾酮合酶基因(Unigene10860_ALL、Unigene33900_ALL)、1個(gè)查爾酮異構(gòu)酶基因(Unigene10157_ALL)、4個(gè)黃烷酮3-羥化酶基因(Unigene1305_ALL、Unigene34429_ALL、Unigene37419_ALL、Unigene7591_ALL)、4個(gè)類黃酮3’-羥化酶基因(Unigene14231_ALL、Unigene31016_ALL、Unigene33968_ALL、Unigene7941_ALL)、1個(gè)二氫黃酮醇還原酶基因(Unigene5884_ALL)、2個(gè)無(wú)花色素還原酶基因(Unigene4993_ALL、Unigene5270_ALL)、1個(gè)無(wú)色花青素雙加氧酶基因(Unigene10888_ALL)和1個(gè)黃酮醇合成酶基因(Unigene37498_ALL)。在本研究中,苯丙氨酸解氨酶基因PAL和肉桂酸-4-羥化酶基因C4H在鎖陽(yáng)整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量均較高,2個(gè)查爾酮合酶基因CHS在整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)趨勢(shì)恰好相反,即在鎖陽(yáng)各部位中的表達(dá)量均較低。2個(gè)4-香豆酸-輔酶A連接酶基因4CL在鎖陽(yáng)不同發(fā)育階段的表達(dá)模式不同,分別在出土前和出土后表達(dá)量較高。查爾酮異構(gòu)酶基因CHI在Cy-1、Cy-2和Cy-3中的表達(dá)水平較高,在Cy-5中的表達(dá)量最低。黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽(yáng)中的表達(dá)量較低,在成花鎖陽(yáng)中較高。而二氫黃酮醇還原酶基因DFR和無(wú)花色素還原酶基因LAR在未成花鎖陽(yáng)中的表達(dá)量較高,在成花鎖陽(yáng)中較低,且在花序中表達(dá)量較高,在莖中較低。結(jié)果表明,與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的基因在鎖陽(yáng)不同發(fā)育階段和不同部位中的表達(dá)水平有所不同,可能與鎖陽(yáng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有關(guān)。

2.5 兒茶素含量分析

鎖陽(yáng)各樣本之間的兒茶素含量差異,見圖7。

圖7 鎖陽(yáng)中的兒茶素含量Figure 7 Catechin content in C.songaricum注：不同字母表示鎖陽(yáng)不同部位之間在0.05水平有顯著性差異(P<0.05)。

由圖7可知,對(duì)鎖陽(yáng)中兒茶素含量進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn),在未成花鎖陽(yáng)中,Cy-1的兒茶素含量最高,達(dá)到5.74 mg/g。與Cy-1相比,Cy-2的兒茶素含量顯著減少了30.66%。在成花鎖陽(yáng)中,Cy-3的兒茶素含量最低,值為2.28 mg/g。與Cy-3相比,Cy-5中的兒茶素含量顯著增加了19.30%,Cy-4的兒茶素含量增加了12.72%。結(jié)果表明,在所有樣本中,未成花鎖陽(yáng)莖上端的兒茶素含量最高,成花鎖陽(yáng)花序的兒茶素含量最低,未成花鎖陽(yáng)中的兒茶素含量顯著高于其他樣本。在不同發(fā)育階段,鎖陽(yáng)莖中的兒茶素含量始終比花序中高;在鎖陽(yáng)的不同部位,未成花鎖陽(yáng)中的兒茶素含量均比成花鎖陽(yáng)的高。這與之前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中兒茶素合成相關(guān)基因DFR和LAR的表達(dá)量變化規(guī)律一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、脅迫響應(yīng)以及不同器官的形態(tài)建成方面得到了廣泛研究[22-24]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了成花和未成花鎖陽(yáng)的花序和莖在發(fā)育過(guò)程中的差異,結(jié)果表明,大量差異基因富集在次生代謝產(chǎn)物的生物合成和代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等途徑中,說(shuō)明這些是鎖陽(yáng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要代謝途徑。

在鎖陽(yáng)的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達(dá)量始終較高,這可能是由于鎖陽(yáng)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中其藥效成分在莖中大量積累,KEGG通路注釋結(jié)果也表明,鎖陽(yáng)次生代謝產(chǎn)物的合成十分旺盛[14]。成花鎖陽(yáng)的整體基因表達(dá)量較未成花鎖陽(yáng)高,這一結(jié)果可能與其出土后的開花和結(jié)實(shí)等過(guò)程有關(guān)[25-26]。鎖陽(yáng)不同器官中的兒茶素含量也具有明顯差異。其中,未成花鎖陽(yáng)莖上端中的兒茶素含量最高,莖下端次之,而成花鎖陽(yáng)花序中含量最低,莖上端和莖下端的含量相對(duì)較高,與前人的研究結(jié)果相似[14]。鎖陽(yáng)在中藥中為去花序入藥,這是因?yàn)榍o中的兒茶素含量較高,去花序入藥保證了鎖陽(yáng)中較高的藥效成分含量;在蒙藥中則以全草入藥,因?yàn)殒i陽(yáng)花序中仍然存在一定含量的兒茶素,本研究結(jié)果證實(shí)了這2種不同入藥方式的正確性。

兒茶素是由苯丙氨酸解氨酶PAL和肉桂酸-4-羥化酶C4H等酶催化合成的黃酮類化合物,主要存在于茶樹等天然植物中[27]。一些研究表明,兒茶素的積累與植物的儲(chǔ)能和抗逆有關(guān),兒茶素通過(guò)其羥基提供電子來(lái)清除活性氧,從而在抵御氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28-29]。在本研究中,苯丙氨酸解氨酶基因PAL和肉桂酸-4-羥化酶基因C4H在鎖陽(yáng)整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量均較高,保證了鎖陽(yáng)在生育期內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成與積累的起始,而黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽(yáng)中的表達(dá)量較低,在成花鎖陽(yáng)中較高,這與前人的研究結(jié)果一致[27]。作為鎖陽(yáng)中重要的活性成分,兒茶素在鎖陽(yáng)的整個(gè)發(fā)育階段都會(huì)積累,但其含量在不同發(fā)育階段存在差異。在鎖陽(yáng)的不同部位,未成花鎖陽(yáng)中的兒茶素含量均比成花鎖陽(yáng)高,且在成花鎖陽(yáng)花序中含量最低,之前的研究也有類似結(jié)果[21]?；駾FR和LAR的表達(dá)水平與兒茶素含量的變化規(guī)律相似,但在成花鎖陽(yáng)花序中的表達(dá)水平大于莖。有研究表明,基因DFR和LAR的調(diào)控與茶樹中總兒茶素含量緊密相關(guān),其表達(dá)量隨兒茶素含量的增加而增加[30-31]。因此,基因DFR和LAR可能對(duì)鎖陽(yáng)兒茶素的合成起著重要的調(diào)控作用。在黃酮類生物合成途徑中,FLS與DFR可能對(duì)底物存在競(jìng)爭(zhēng)性利用,FLS在成花鎖陽(yáng)的花序中表達(dá)活躍,改變了兒茶素的合成途徑,可能是導(dǎo)致花序中兒茶素含量降低的原因[32]。

3.2 結(jié)論

本研究通過(guò)Illumina HiSeqTM 2000技術(shù)對(duì)未成花鎖陽(yáng)的莖上端(Cy-1)、莖下端(Cy-2)以及成花鎖陽(yáng)的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5)進(jìn)行了測(cè)序,成功構(gòu)建了鎖陽(yáng)的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù),并對(duì)黃酮類化合物生物合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。共獲得106 626個(gè)Unigenes,通過(guò)BLAST分析后,在各樣本中分別有59 547、46 362、32 466、33 609、21 040、39 939個(gè)Unigenes在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得注釋,共有318 909個(gè)差異基因在GO得到注釋。在鎖陽(yáng)的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達(dá)量始終較高,且成花鎖陽(yáng)的整體基因表達(dá)量比未成花鎖陽(yáng)高。將篩選到的318 909個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路注釋分析,各組樣本在“全局和總覽圖”中注釋到的差異表達(dá)基因最多,其次是翻譯、脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝,鎖陽(yáng)同一發(fā)育階段的不同部位之間代謝過(guò)程也有差異。共篩選出20個(gè)與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因,黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽(yáng)中的表達(dá)量較低,在成花鎖陽(yáng)中較高。而二氫黃酮醇還原酶基因DFR和無(wú)花色素還原酶基因LAR在未成花鎖陽(yáng)中的表達(dá)量較高,在成花鎖陽(yáng)中較低。在所有樣本中,未成花鎖陽(yáng)莖上端的兒茶素含量最高,成花鎖陽(yáng)花序的兒茶素含量最低,且未成花鎖陽(yáng)中的兒茶素含量均比成花鎖陽(yáng)高,這與DFR和LAR表達(dá)量的變化規(guī)律一致,說(shuō)明DFR和LAR對(duì)鎖陽(yáng)兒茶素的合成起著重要的調(diào)控作用。本研究為瀕危藥用植物鎖陽(yáng)次生代謝的研究、鎖陽(yáng)資源的綜合利用及其最佳采收期的確定提供了參考。