子癇前期患者的胎盤環(huán)狀RNA表達(dá)譜及與病情的相關(guān)性

韓貞艷，關(guān)紅瓊

子癇前期是妊娠20 周后發(fā)生的以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯囊环N妊娠特異性疾病，伴有高血壓和多器官功能障礙［1-2］。目前，子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與母體、胎兒及胎盤等因素相關(guān)［3］。子癇前期的診斷、病情評估及治療對預(yù)防子癇及由其引起的靶器官損傷具有重要意義，但目前子癇前期尚無有效的預(yù)測、評估指標(biāo)。環(huán)狀RNA（circRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA 的新成員，參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡等多種生物過程，與細(xì)胞生長、血管生成等過程有關(guān)［4］，具有穩(wěn)定、普遍及特異性等優(yōu)勢［3，5］。篩選與正常人差異表達(dá)的circRNA有助于篩查具有子癇前期風(fēng)險(xiǎn)的患者，有望成為子癇前期的潛在標(biāo)志物［6］。本研究對子癇前期患者胎盤circRNA 水平及胎盤功能相關(guān)指標(biāo)，如STOX1（storkhead box 1）蛋白、血清可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1（soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）及其他臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析，以便能早期診斷，及時(shí)干預(yù)，改善預(yù)后，降低患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 選取2020年10月—2021年8月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院診治的子癇前期或重度子癇前期患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合子癇前期或重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。（2）孕婦為自然受孕。（3）單胎妊娠。（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他妊娠期疾病者。（2）合并心、腦、腎等臟器嚴(yán)重?fù)p傷者。（3）合并嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病及自身免疫系統(tǒng)疾病者。（4）合并惡性腫瘤者。（5）合并嚴(yán)重精神-神經(jīng)系統(tǒng)疾病不能配合者。最終納入子癇前期患者（子癇前期組）15例，重度子癇前期患者（重度子癇前期組）25例。選取同期于我院行常規(guī)產(chǎn)檢的正常妊娠女性30 例為對照組。3 組孕產(chǎn)婦年齡18~40 歲。本研究通過我院倫理委員會審核并批準(zhǔn)（K20200922208），所有患者均對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo) 一般資料：收集患者年齡、孕次、產(chǎn)次、入組時(shí)孕周及體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。于納入次日清晨測量收縮壓及舒張壓，并計(jì)算平均動脈壓，平均動脈壓=（收縮壓+2×舒張壓）/3。收集患者24 h 尿液，應(yīng)用雙縮脲法進(jìn)行24 h 尿蛋白定量檢測。抽取患者空腹靜脈晨血5 mL，置于無抗凝劑的試管中，靜置1 h，在4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，收集血清，置于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），于全自動酶免工作站（博科BIOBASE4000）上檢測血清中的STOX1 蛋白、sFlt-1、胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，試劑盒均購自深圳晶美生物有限公司，操作過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3 RNA提取 于胎盤娩出后1 min內(nèi)收集胎盤組織標(biāo)本，在無菌條件下從胎盤母體面中央切取數(shù)塊胎盤組織（大小約1 cm3），避開鈣化斑，用生理鹽水沖洗3 次，放入凍存管中迅速置于液氮罐中低溫保存，用于胎盤circRNA 的檢測。根據(jù)NEBNext?UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit 試劑盒［美國紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司］說明書使用RNAiso Plus試劑進(jìn)行總RNA 的分離和純化。使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行RNA 純度的檢測。采用Qubit 2.0 熒光計(jì)中的Qubit RNA檢測試劑盒檢測RNA。使用Agilent 生物分析儀（安捷倫2100，美國）的RNA Nano 6000 檢測試劑盒對胎盤中RNA 的完整性進(jìn)一步評估，確保研究中RNA的質(zhì)量。

1.4 RNA 的建庫和測序 使用Epicenter Ribo-zeroTMrRNA試劑盒（Epicentre，美國）去除核糖體RNA以后，建立circRNA文庫用于分析circRNA。按照NEBNext?UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit試劑盒說明書，使用NEBNext?UltraTM定向RNA文庫準(zhǔn)備試劑盒［美國紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司］建立文庫，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS（Illumia）在a cBot Cluster Generation System 上對編碼后的樣本進(jìn)行聚類。隨后在Illumina HiSeq 4000 平臺（Illumina，美國）上對circRNA使用PE150（雙端測序）測序策略進(jìn)行測序。

1.5 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 移除原始測序數(shù)據(jù)中包含接頭、ploy-N 和低質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)之后得到清洗后的高質(zhì)量circRNA 數(shù)據(jù)，計(jì)算清洗后數(shù)據(jù)中Q20、Q30 和GC 含量，后續(xù)均應(yīng)用高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6 差異表達(dá)分析 分別獲取各組經(jīng)處理后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選，使用DESeq R package（1.10.1）根據(jù)差異倍數(shù)和顯著性水平進(jìn)行篩選，差異表達(dá)circRNA 的篩選條件均為P＜0.05。使用R 統(tǒng)計(jì)軟件中的pheatmap 包，根據(jù)所有差異表達(dá)circRNA 標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行層次聚類分析，對于circRNA以每百萬轉(zhuǎn)錄本（Transcripts Per Million，TPM）值為表達(dá)水平，以log10（TPM+1）值進(jìn)行繪圖及聚類分析，選取上調(diào)及下調(diào)基因各自差異表達(dá)水平由高到低排名前3 位的基因進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用R（4.0.6）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson法；采用多元線性回歸模型分析影響孕婦24 h 尿蛋白定量的相關(guān)因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦一般資料比較 3組孕婦的年齡、孕次、產(chǎn)次及孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對照組比較，子癇前期組及重度子癇前期組的BMI 和平均動脈壓升高（P＜0.05）；與子癇前期組比較，重度子癇前期組BMI 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，平均動脈壓升高（P＜0.05），見表1。

2.2 孕婦實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 對照組、子癇前期組及重度子癇前期組24 h 尿蛋白定量、STOX1 及sFlt-1水平依次升高，VEGF 及PLGF 水平依次降低（P＜0.05），見表2。

2.3 孕婦胎盤circRNA 表達(dá)情況 對照組、子癇前期組及重度子癇前期組胎盤hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383及hsa_circ_0004904表達(dá)水平依次升 高，而hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121 及hsa_circ_0003171 表達(dá)水平依次降低（P＜0.05），見圖1、表3。

2.4 孕婦胎盤circRNA表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，子癇前期組及重度子癇前期組hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383 及hsa_circ_0004904 分 別 與BMI（r=0.366、0.285、0.270，P＜0.05）、平均動脈壓（r=0.604、0.463、0.288，P＜0.05）、24 h 尿蛋白定量（r=0.791、0.817、0.607，P＜0.05）、STOX1（r=0.410、0.411、0.434，P＜0.05）、sFlt-1（r=0.296、0.323、0.302，P＜0.05）呈正相關(guān)，與VEGF（r=-0.554、-0.551、-0.384，P＜0.05）、PLGF（r=-0.400、-0.224、-0.406，P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)；子癇前期組及重度子癇前期組hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121及hsa_circ_0003171 分別與BMI（r=-0.257、-0.316、-0.269，P＜0.05）、平均動脈壓（r=-0.544、-0.619、-0.481，P＜0.05）、24 h尿蛋白定量（r=-0.682、-0.834、-0.633，P＜0.05）、STOX1（r=-0.366、-0.467、-0.254，P＜0.05）、sFlt-1（r=-0.409、-0.400、-0.374，P＜0.05）呈 負(fù) 相 關(guān)，與VEGF（r=0.376、0.660、0.347，P＜0.05）、PLGF（r=0.440、0.262、0.225，P＜0.05）呈正相關(guān)。

Fig.1 Relative expression levels of placental circRNA in pregnant women圖1 孕婦胎盤circRNA相對表達(dá)水平

Tab.1 Comparison of general data between the three groups表1 各組一般資料比較

Tab.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

Tab.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 各組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與子癇前期組比較，P＜0.05。

組別對照組子癇前期組重度子癇前期組F n 30 15 25 24 h尿蛋白定量（g）0.09±0.01 1.28±0.33a 4.43±1.21ab 241.269＊＊STOX1（ng/L）40.67±5.13 44.39±6.28a 49.41±7.39ab 13.298＊＊sFlt-1（ng/L）203.54±65.28 255.82±71.34a 298.42±79.48ab 11.966＊＊VEGF（ng/L）232.73±25.76 187.12±20.89a 151.37±18.26ab 91.537＊＊PLGF（pg/L）511.23±79.21 461.54±62.79a 413.64±53.02ab 14.319＊＊

Tab.3 Comparison of placental circRNA expression between the three groups表3 各組胎盤circRNA表達(dá)情況比較 （±s）

Tab.3 Comparison of placental circRNA expression between the three groups表3 各組胎盤circRNA表達(dá)情況比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與子癇前期組比較，P＜0.05。

組別對照組子癇前期組重度子癇前期組F n 30 15 25 hsa_circ_0014736 0.81±0.15 1.13±0.17a 1.53±0.19ab 123.127＊＊hsa_circ_0015383 0.83±0.17 1.02±0.19a 1.48±0.23ab 75.541＊＊hsa_circ_0004904 0.87±0.23 1.12±0.27a 1.33±0.34ab 18.263＊＊hsa_circ_0063517 1.07±0.23 0.87±0.16a 0.72±0.11ab 25.938＊＊hsa_circ_0007121 1.21±0.19 0.76±0.15a 0.43±0.12ab 164.876＊＊hsa_circ_0003171 1.19±0.23 1.01±0.18a 0.89±0.17ab 15.614＊＊

2.5 影響孕婦24 h 尿蛋白定量的多元線性回歸分析 hsa_circ_0015383 與孕婦24 h 尿蛋白定量呈正向線性相關(guān)，hsa_circ_0063517 及hsa_circ_0007121與孕婦24 h尿蛋白定量呈負(fù)向線性相關(guān)（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Linear regression analysis of relevant indexes affecting 24 h quantitative urine protein of eclampsia pregnant women表4 影響子癇孕婦24 h尿蛋白定量相關(guān)指標(biāo)的線性回歸分析

3 討論

目前，子癇前期的病因尚未明確，胎盤功能障礙是目前學(xué)者認(rèn)為子癇前期的主要潛在病因，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究［8］。circRNA 參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，穩(wěn)定性良好。研究顯示環(huán)狀RNA牛痘相關(guān)激酶1（circVRK1）可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示circRNA 在子癇的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并可能成為子癇前期的診斷及 干 預(yù) 靶 點(diǎn)［9］。陳 維 等［10］研 究 顯 示，hg38_circ_0014736 及hsa_circ_0015382 在子癇前期患者胎盤組織中高表達(dá)。高明明等［9］發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005579在子癇前期患者胎盤中高表達(dá)?；诖耍P者對我院診治的子癇前期患者進(jìn)行研究，旨在對子癇前期的病情預(yù)測提供新思路。

本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0007121、hsa_circ_0063517 水平下調(diào)及hsa_circ_0015383 水平上調(diào)與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。circRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）發(fā)揮作用，并與多種miRNA相結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)［11］。當(dāng)miR-182-5p過表達(dá)時(shí)，人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲受到抑制，導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡、死亡，hsa_circ_0007121 可 與miR-182-5p 結(jié) 合，降 低miR-182-5p水平，若hsa_circ_0007121 下調(diào)，與miR-182-5p 結(jié)合減少，miR-182-5p 水平升高，表明hsa_circ_0007121 可通過調(diào)節(jié)miR-182-5p 影響子癇前期的發(fā)生發(fā)展［12］。hsa_circ_0063517 則與miR-31-5p 的表達(dá)相關(guān)，hsa_circ_0063517可充當(dāng)miR-31-5p的海綿分子，起到調(diào)節(jié)B型內(nèi)皮素受體表達(dá)的作用，子癇前期患者體內(nèi)hsa_circ_0063517 表達(dá)水平下調(diào)，miR-31-5p 水平明顯升高，抑制miR-31-5p 表達(dá)或上調(diào)hsa_circ_0063517 表達(dá)水平可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移及血管生成，而抑制hsa_circ_0063517表達(dá)則可抑制B 型內(nèi)皮素受體的表達(dá)［13］，與本研究結(jié)果一致，提示hsa_circ_0063517可通過促進(jìn)B型內(nèi)皮素受體表達(dá)而起到促進(jìn)血管生成的作用，從而參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。hsa_circ_0015383 位于chr1染色體，最可能靶向結(jié)合的miRNA 反應(yīng)元件為hsa-miR-197。hsa-miR-197為一種抑癌因子，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡密切相關(guān)［14］，故hsa_circ_0015383可能通過與hsa-miR-197靶向結(jié)合，影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡等過程，從而參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。此外，研究顯示hsa_circ_0015383/miRNA/mRNA 可能與Wnt 信號通路及Notch 信號通路相關(guān)［15］。而Wnt/β 連環(huán)蛋白通路受抑，可能會使滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力降低，導(dǎo)致胎盤著床過淺，此外，非經(jīng)典Wnt通路可使蛻膜化異常，進(jìn)而誘發(fā)子癇前期［16］。

STOX1 及sFlt-1 為胎盤功能相關(guān)指標(biāo)，STOX1水平升高可使子癇前期小鼠的血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙，引起子宮螺旋動脈重塑，而sFlt-1能抑制胎盤血管生成，兩者與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［17］。VEGF 為糖蛋白二聚體，起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促微血管生成、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及調(diào)控胎盤血管生成等生理作用；PLGF 為VEGF 家族一員，主要在胎盤高表達(dá)，可與VEGF協(xié)調(diào)合作，共同促進(jìn)胎盤血管生成及發(fā)育［18］。通過進(jìn)一步對影響子癇前期患者病情的因素進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383及hsa_circ_0004904水平與sFlt-1、STOX1呈正相關(guān)，與VEGF和PLGF呈負(fù)相關(guān)，即上述3 種circRNA 表達(dá)水平越高，sFlt-1、STOX1水平越高，血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙越嚴(yán)重，胎盤血管發(fā)育不良，患子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)越高，VEGF 和PLGF 作為胎盤發(fā)育的有利因素，可促進(jìn)胎盤發(fā)育，而VEGF 和PLGF 水平降低，可使胎盤血管發(fā)育不良，誘發(fā)子癇前期。hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121 及hsa_circ_0003171 表達(dá)情況則與此相反。此外，對上述影響因素行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示hsa_circ_0015383 與孕婦24 h 尿蛋白定量呈正向線性相關(guān)，hsa_circ_0063517 及hsa_circ_0007121 與孕婦24 h 尿蛋白定量呈負(fù)向線性相關(guān)，而STOX1、sFlt-1、VEGF 及PLGF 與孕婦24 h 尿蛋白定量無線性相關(guān)，可能與hsa_circ_0015383、hsa_circ_0063517及hsa_circ_0007121 等共線性有關(guān)。故circRNA 是否參與調(diào)控sFlt-1、STOX1 表達(dá)仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上，hsa_circ_0007121、hsa_circ_0063517 水平下調(diào)及hsa_circ_0015383 水平上調(diào)在子癇前期的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，可作為子癇前期病情監(jiān)測及干預(yù)的新靶點(diǎn)。但本研究受樣本量影響，結(jié)果具有一定局限性，且未探索下游蛋白，故應(yīng)進(jìn)一步行多中心、大樣本的試驗(yàn)對其進(jìn)一步分析。