桑黃素通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1信號通路對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響

薛麗，韓紅，張力

缺血性卒中屬于破壞性腦血管疾病，病死率、致殘率較高［1］。目前，缺血性卒中的主要治療方法是通過溶栓治療或血管內(nèi)血栓切除術(shù)及時有效地使梗死的血管再通，實現(xiàn)缺血腦組織的血流再灌注［2］。研究顯示，血流再灌注過程中往往會造成腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致神經(jīng)缺陷甚至死亡［3］。硫氧還蛋白互作蛋白（TXNIP）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）/胱天蛋白酶1（Caspase-1）信號通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要軸，已被證實參與了缺血再灌注損傷、糖尿病及慢性炎癥相關(guān)疾病的進展［4］。桑黃素（Morin）是一種含C15類的黃酮類化合物，含有3 個酚環(huán)，具有抗氧化、抗炎、抗高血糖和抗血管生成作用［5］。目前，有關(guān)Morin在腦缺血再灌注損傷中的影響研究較少。本研究旨在探討Morin 調(diào)控TXNIP/NLRP3/Caspase-1 信號通路對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠60 只，7~8 周齡，體質(zhì)量（220±20）g，購自三峽大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2022-0012。所有大鼠均維持在12 h/12 h 的明暗循環(huán)環(huán)境下，溫度（22±3）℃，濕度（60±5）%，自由進食飲水。所有動物實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行，并經(jīng)動物倫理委員會的批準（JZLLSC2022-0122）。Morin 購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；TXNIP 過表達慢病毒（pLVX-TXNIP）及空載慢病毒（pLVX-NC）購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-18 的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，TXNIP、NLRP3、Caspase-1 一抗購自Abcam公司。化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 研究方法

1.2.1 腦缺血再灌注大鼠模型的制備及干預(yù) 60 只大鼠隨機均分為假手術(shù)組、模型組、Morin低劑量（Morin-L）組、Morin高 劑 量（Morin-H）組、Morin-H+pLVX-NC 組、Morin-H+pLVX-TXNIP 組。參照文獻［6］，采用線栓法建立大腦中動脈閉塞再灌注大鼠模型（假手術(shù)組除外），在腦缺血1 h 后，Morin-L 組、Morin-H 組分別腹腔注射10 mg/kg、40 mg/kg Morin［7］；Morin-H+pLVX-NC 組、Morin-H+pLVX-TXNIP 組在40 mg/kg Morin腹腔注射給藥的同時，分別給予尾部注射2.5μL pLVX-NC、pLVX-TXNIP（1×109TU/mL）干預(yù)［8］；其余各組給予等量生理鹽水干預(yù)；于給藥1 h后（缺血2 h）拆除縫合線實現(xiàn)缺血再灌注。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠（除假手術(shù)組外）再灌注72 h 后，由對大鼠分組并不知情的同一實驗員對大鼠以Longa評分法［9］評估神經(jīng)功能缺損情況，評分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.3 ELISA檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-18水平 各組大鼠尾靜脈取2 mL 血，3 000 r/min 離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-18水平。

1.2.4 腦含水量檢測 每組取3只大鼠，頸椎脫臼處死并迅速取出大腦，稱量大鼠全腦組織的濕質(zhì)量；放入110 ℃的烘箱中孵育24 h重新稱質(zhì)量，以獲得干質(zhì)量，腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.2.5 TTC 染色計算大鼠腦組織梗死面積 每組取3 只大鼠，取出全腦，去除殘血后濾紙吸干，將大鼠的腦組織切成2.0 mm 厚的冠狀切片并于10 g/L TTC 溶液中37 ℃避光染色10 min，置于含40 g/L多聚甲醛的聚丁二酸丁二醇酯（PBS）溶液中保存24 h。拍照并使用Image J計算梗死面積，其中正常腦組織染成紅色，梗死腦組織染成白色。

1.2.6 HE觀察大腦皮質(zhì)半暗帶組織病理學(xué)特征 剩余每組4只大鼠均取出大腦，分離并切取部分大腦皮質(zhì)半暗帶組織，一部分儲存在-80 ℃冰箱，用于Western blot 檢測；另一部分固定在多聚甲醛中，經(jīng)石蠟包埋，切片后用蘇木精染色，梯度脫水后，透明，封固，于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 收集1.2.6中部分大腦皮質(zhì)半暗帶組織，使用裂解緩沖液從皮質(zhì)組織中提取蛋白質(zhì)，分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉在4 ℃封閉膜1 h，將膜與TXNIP、NLRP3 及Caspase-1（均1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育過夜。TBST 洗滌后，加入二抗（（1∶2 000））并在室溫下孵育2 h，加入ECL發(fā)光底物可檢測蛋白質(zhì)信號，Image J軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組、模型組、Morin-L 組、Morin-H 組、Morin-H+pLVXNC組、Morin-H+pLVX-TXNIP 組神經(jīng)功能缺損評分分 別 為（0.00±0.00）、（3.15±0.32）、（2.37±0.24）、（1.01±0.11）、（1.03±0.11）、（2.86±0.29），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=344.566，P＜0.01），其中Morin-L 組高于Morin-H 組，Morin-H+pLVX-TXNIP 組 高 于Morin-H+pLVX-NC組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清中IL-1β、IL-18水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組IL-1β、IL-18 水平增加（P＜0.05）；與模型組比較，Morin-L 組、Morin-H 組IL-1β、IL-18 水平降低（P＜0.05）；與Morin-H 組及Morin-H+pLVX-NC 組比較，Morin-H+pLVX-TXNIP組IL-1β、IL-18水平增加（P＜0.05），見表1。

2.3 各組皮質(zhì)半暗帶組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組未見水腫、充血現(xiàn)象，細胞排列規(guī)則、有序；模型組出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，有大量炎性細胞浸潤，細胞結(jié)構(gòu)模糊不清。Morin-L 組、Morin-H 組、Morin-H+pLVX-NC 組水腫現(xiàn)象逐漸消失，炎性細胞浸潤逐漸減輕；Morin-H+pLVX-TXNIP 組水腫、炎性細胞浸潤現(xiàn)象依然存在，見圖1。

Tab.1 Comparison of serum levels of IL-1β and IL-18 between the six groups表1 各組血清中IL-1β、IL-18水平的比較（n=10，ng/L，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of IL-1β and IL-18 between the six groups表1 各組血清中IL-1β、IL-18水平的比較（n=10，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與Morin-L 組比較，d與Morin-H 組比較，e與Morin-H+pLVX-NC 組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別假手術(shù)組模型組Morin-L組Morin-H組Morin-H+pLVX-NC組Morin-H+pLVX-TXNIP組F IL-1β 10.27±1.03 29.12±2.92a 22.04±2.21b 15.34±1.54bc 15.27±1.53 24.35±2.44de 115.929＊＊IL-18 75.15±7.52 138.52±13.86a 106.37±10.64b 84.15±8.42bc 84.28±8.43 115.68±11.57de 54.256＊＊

Fig.1 Histopathological changes of cerebral penumbra in each group of rats(HE,×400)圖1 各組大鼠大腦皮質(zhì)半暗帶組織病理學(xué)變化（HE，×400）

2.4 各組梗死面積及腦含水量比較 與假手術(shù)組比較，模型組腦含水量、梗死面積增加（P＜0.05）；與模型組比較，Morin-L組、Morin-H組腦含水量、梗死面積降低（P＜0.05）；與Morin-H+pLVX-NC組比較，Morin-H+pLVX-TXNIP 組腦含水量、梗死面積增加（P＜0.05），見圖2、表2。

2.5 各組TXNIP、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組TXNIP、NLRP3、Caspase-1 蛋白增加（P＜0.05）；與模型組比較，Morin-L 組、Morin-H 組的TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白降低（P＜0.05）；與Morin-H+pLVX-NC組比較，Morin-H+pLVX-TXNIP組TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白增加（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.2 Changes in infarct size of brain tissue(TTC staining,×100)圖2 腦組織梗死面積變化（TTC染色，×100）

Tab.2 Comparison of infarct size of brain tissue and brain water content between six groups of rats表2 各組腦組織梗死面積和腦含水量比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of infarct size of brain tissue and brain water content between six groups of rats表2 各組腦組織梗死面積和腦含水量比較（n=3，±s）

組別假手術(shù)組模型組Morin-L組Morin-H組Morin-H+pLVX-NC組Morin-H+pLVX-TXNIP組F梗死面積（%）0.00±0.00 21.05±2.11a 13.21±1.33b 8.51±0.86bc 8.48±0.85 15.64±1.57de 92.531＊＊腦含水量（%）65.12±3.01 85.34±3.55a 75.66±2.76b 67.43±2.34bc 68.32±2.28 82.54±2.88de 26.751＊＊

Fig.3 Expression of TXNIP,NLRP3 and Caspase-1 proteins in each group(Western blot assay)圖3 各組TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白表達（Western blot圖）

Tab.3 Comparison of TXNIP,NLRP3 and Caspase-1 protein expression between six groups of rats表3 各組TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平比較（n=4，±s）

Tab.3 Comparison of TXNIP,NLRP3 and Caspase-1 protein expression between six groups of rats表3 各組TXNIP、NLRP3、Caspase-1蛋白表達水平比較（n=4，±s）

組別假手術(shù)組模型組Morin-L組Morin-H組Morin-H+pLVX-NC組Morin-H+pLVX-TXNIP組F TXNIP 0.25±0.03 1.19±0.12a 0.63±0.07b 0.34±0.04bc 0.37±0.04 0.71±0.08de 96.979＊＊NLRP3 0.17±0.02 0.85±0.09a 0.54±0.06b 0.24±0.03bc 0.25±0.03 0.66±0.07de 95.663＊＊Caspase-1 0.34±0.04 1.12±0.12a 0.77±0.08b 0.39±0.04bc 0.37±0.04 0.74±0.08de 72.103＊＊

3 討論

目前，腦血管疾病尤其是缺血性卒中仍然是導(dǎo)致患者死亡和殘疾的主要原因之一，血流再灌注可導(dǎo)致一些缺血性腦組織損傷或功能障礙，導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷［10］。雖然缺血性卒中的治療已經(jīng)取得了很大進展，但由于其發(fā)病機制的復(fù)雜性，目前臨床對于腦缺血/再灌注損傷依然缺乏有效預(yù)防及治療方法［11］。

Morin是一種黃色多酚，稱為3,5,7,2',4'-五羥基黃酮，屬于黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，具有抗炎、抗氧化等多種作用［12］。Park等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Morin可減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠炎癥性骨丟失，降低破骨細胞活性及數(shù)量。Chen 等［14］研究證實，Morin可以減少局灶性腦缺血性損傷大鼠模型氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能缺損。Khamchai 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在中動脈閉塞和再灌注大鼠模型中，Morin 可顯著降低氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，保護大腦和血腦屏障損傷。本研究結(jié)果顯示，模型組較對照組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦含水量增加，炎癥反應(yīng)（IL-1β、IL-18 水平）明顯上升，大鼠腦組織出現(xiàn)腦梗死，表明腦缺血再灌注后腦組織嚴重受損；但經(jīng)不同濃度Morin 治療后，大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦含水量、炎癥反應(yīng)以及腦梗死面積均降低，表明Morin尤其是高劑量Morin 抗炎作用顯著，Morin 可減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。

TXNIP/NLRP3/Caspase-1 通路是常見的炎癥反應(yīng)通路，可產(chǎn)生IL-8和IL-1β等炎性細胞因子，從而參與下游炎癥反應(yīng)［16］。Chen等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧缺血腦損傷幼鼠中，提高TXNIP 表達可激活NLRP3炎性體并加重腦損傷。Zhou 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Morin通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1 信號通路活化，從而減輕髓核細胞焦亡并改善椎間盤退變。但Morin 能否通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1 信號通路來減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷尚未可知。本研究結(jié)果顯示，模型組TXNIP、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達較假手術(shù)組上調(diào)，提示腦缺血再灌注引發(fā)的腦損傷可能與激活TXNIP/NLRP3/Caspase-1 通路有關(guān)。經(jīng)不同濃度Morin 治療后，TXNIP、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達明顯降低，推測Morin 可能通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1 通路活化而發(fā)揮抗炎作用，進而起到保護神經(jīng)元的作用。為進一步驗證該猜想，實驗在Morin-H 干預(yù)基礎(chǔ)上，以pLVXTXNIP及陰性對照pLVX-NC加以干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達TXNIP逆轉(zhuǎn)了Morin-H對模型大鼠腦損傷的保護作用，提示Morin 可能通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1信號通路活化，從而減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。

綜上所述，Morin 通過抑制TXNIP/NLRP3/Caspase-1 信號通路活化，抑制炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡，減輕腦缺血再灌注大鼠腦損傷。