NO介導(dǎo)的代謝紊亂影響小鼠氣道祖細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

郝德，李寬，王建海，岳青，陳懷永

呼吸時(shí)，由于吸入的空氣中有各種病原微生物、有毒氣體與顆粒物，使得氣道上皮黏膜直接暴露其中，故易引發(fā)損傷。維持氣道上皮黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性是維持正常呼吸功能的基礎(chǔ)。與其他器官上皮黏膜相比，氣道上皮黏膜再生能力較弱，但是受損后具有強(qiáng)大的修復(fù)能力［1］。在氣道上皮黏膜修復(fù)過程中發(fā)揮主要作用的是club 祖細(xì)胞［2］，是肺內(nèi)源性上皮祖細(xì)胞，特異性表達(dá)club 祖細(xì)胞分泌蛋白（club cell secretory protein，CCSP）。club祖細(xì)胞具有分泌和再生雙重功能，可以分泌多種物質(zhì)調(diào)節(jié)氣道上皮黏膜的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)可以分化成其他上皮細(xì)胞，如纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞［3］。研究表明，club 祖細(xì)胞功能異常與哮喘和慢性阻塞性肺疾病等多種肺部疾病病理學(xué)相關(guān)［4］。一氧化氮（NO）是一種重要的信號(hào)分子，參與許多正常的生理過程，但是呼出氣中的NO 濃度是臨床診斷哮喘嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［5］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NO 抑制小鼠club 祖細(xì)胞增殖［6］。NO 還可破壞三羧酸循環(huán)和細(xì)胞代謝［7］，剝奪club 祖細(xì)胞糖攝取，抑制club 祖細(xì)胞增殖能力［8］。目前，NO對(duì)club祖細(xì)胞代謝功能的調(diào)控作用機(jī)制尚未闡明。本文采用肺臟類器官技術(shù)研究羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA reductase,Hmgcr）特異性抑制劑辛伐他汀、鳥苷單磷酸合成酶（Guanosine monophosphate synthase，Gmps）特異性抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxonorleucine，DON）和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶2（Glutamate pyruvate transaminase 2，Gpt2）特異性抑制劑氨基羥乙酸酯（Aminooxyacetate，AOA）對(duì)原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響，探究NO損傷原代club祖細(xì)胞增殖功能的可能代謝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 8~12 周齡SPF 級(jí)雄性野生型C57BL/6 小鼠16只，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010］。小鼠飼養(yǎng)于天津大學(xué)海河醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)［動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（津）2021-0002］。倒置熒光顯微鏡（Olypmus公司）。流式細(xì)胞術(shù)所用抗體：大鼠源抗小鼠CD24單克隆抗體、Ly-6A/E（Sca-1）單克隆抗體、EpCAM（CD326）單克隆抗體、CD31 單克隆抗體、CD34單克隆抗體、CD45單克隆抗體、APC-標(biāo)記鏈霉親和素偶聯(lián)物購(gòu)自eBioscience 公司。 彈性蛋白酶購(gòu)自Worthington 公司。Transwell 培養(yǎng)小室、24孔板及96孔板，基質(zhì)膠Matrigel 購(gòu)自BD Pharmingen。DMEM-F12 培養(yǎng)基購(gòu)自Corning 公司。胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素溶液（PS）購(gòu)自Gibco 公司。HEPES 緩沖溶液、二乙胺壬酸酯（DEA NONOate）、Hmgcr 抑制劑辛伐他汀、Gmps 抑制劑DON 和Gpt2抑制劑AOA購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠氣道原代club 祖細(xì)胞分選 使用7.5%的水合氯醛溶液10 μL/g 腹腔注射麻醉小鼠，剪斷腹主動(dòng)脈后處死小鼠，收取肺組織。彈性蛋白酶注入氣管進(jìn)行消化，切碎肺組織并制備小鼠肺單細(xì)胞懸液后加入混勻的熒光標(biāo)記抗體CD24、CD31、CD34、CD45、EpCAM 和Sca-1，然后冰上孵育30 min。使用BD Ario Ⅲ流式細(xì)胞儀，根據(jù)以下表型分選CD24lowCD31-CD34-CD45-EpCAM+Sca-1+小 鼠 原 代club 祖細(xì)胞。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將分選的小鼠原代club 祖細(xì)胞種入基質(zhì)膠包被的96孔板中（每孔含100μL基質(zhì)膠，1.9×105個(gè)原代club祖細(xì)胞），設(shè)置對(duì)照組和DEA NONOate 刺激組，每組3個(gè)孔。本實(shí)驗(yàn)選用DEA NONOate濃度為25μmol/L，相當(dāng)于重癥哮喘患者支氣管灌洗液中高劑量NO 的濃度［9-10］。刺激24 h后，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，由北京諾禾致源科技股份有限公司協(xié)助完成。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用Deseq R軟件包篩選差異變化基因，以矯正后的P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，使用clusterProfiler 篩選差異表達(dá)倍數(shù)上調(diào)1.2倍以上和下調(diào)16.7%以上的基因。

1.2.3 肺臟類器官模型培養(yǎng) 將分選的原代club 祖細(xì)胞與小鼠肺成纖維細(xì)胞（MLg 細(xì)胞）按比例（每個(gè)小室5 000 個(gè)原代club祖細(xì)胞，2×105個(gè)MLg細(xì)胞）混勻后種入小室內(nèi)。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，對(duì)照組使用干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F12，10%FBS，1×青霉素-鏈霉素溶液）培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組使用添加抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，參考文獻(xiàn)［11-13］確定抑制劑濃度如下：辛伐他汀40 nmol/L，DON 0.2 μmol/L，AOA 1 mmol/L。每組不少于5 個(gè)復(fù)孔，每2 d 換1 次培養(yǎng)基，辛伐他汀組、DON 組和AOA組第2天添加相應(yīng)抑制劑開始刺激。培養(yǎng)第8天用倒置顯微鏡拍照，Cellseens Dimension 軟件處理分析圖像，統(tǒng)計(jì)直徑大于50μm的類器官的個(gè)數(shù)及直徑，并計(jì)算類器官形成效率（原代club祖細(xì)胞形成類器官的百分比）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠氣道原代club 祖細(xì)胞的分選與肺臟類器官模型的建立 小鼠氣道原代club祖細(xì)胞被成功分選。將分選出的原代club祖細(xì)胞與MLg細(xì)胞混勻至Matrigel 基質(zhì)膠與F12培養(yǎng)基中，植入Transwell 小室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)第8天原代club祖細(xì)胞可長(zhǎng)成中空透明的球狀結(jié)構(gòu)——類器官，見圖1。

2.2 NO對(duì)原代club祖細(xì)胞中多種代謝基因表達(dá)的抑制作用 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DEA NONOate 刺激組原代club 祖細(xì)胞上調(diào)1.2 倍以上的基因有2 894 個(gè)，下調(diào)16.7%以上的基因有3 270 個(gè)，見圖2。分析差異基因的fpkm 值（即每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片數(shù)，反映基因表達(dá)水平），在這些差異表達(dá)基因中，DEA NONOate刺激后，原代club祖細(xì)胞代謝相關(guān)基因Hmgcr（n=3，t=3.131，P＜0.01）、Gmps（n=3，t=10.403，P＜0.01）和Gpt2（n=3，t=9.850，P＜0.01）的表達(dá)下降，見圖3。

2.3 辛伐他汀對(duì)原代club 祖細(xì)胞增殖的影響 類器官培養(yǎng)結(jié)果顯示，辛伐他汀組原代club 祖細(xì)胞的類器官形成效率（6.44%±0.36%）與對(duì)照組的（6.44%±0.40%）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，t=0.079，P＞0.05），辛 伐 他 汀 組 的 類 器 官 直 徑（220.88 μm±10.16 μm）較 對(duì) 照 組（260.09 μm±14.15μm）減小（n=6，t=6.070，P＜0.01），見圖4。

2.4 Gmps抑制劑DON對(duì)原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響 DON 組原代club 祖細(xì)胞的類器官形成效率（3.98%±0.33%）較對(duì)照組（6.62%±0.54%）降低（n=5，t=16.535，P＜0.01），DON 組的類器官直徑（118.23μm±6.68μm）較對(duì)照組（208.21μm±10.28μm）減?。╪=5，t=19.849，P＜0.01），見圖5。

2.5 Gpt2 抑制劑AOA 對(duì)原代club 祖細(xì)胞增殖功能的影響 AOA組的類器官形成效率（2.28%±0.32%）較對(duì)照組（4.97%±0.44%）降低（n=5，t=8.409，P＜0.01），AOA 組的類器官直徑（94.05μm±5.98μm）較對(duì)照組（222.39 μm±21.21 μm）減?。╪=5，t=12.180，P＜0.01），見圖6。

Fig.1 Flow sorting strategy of mouse airway club cells and organoid culture model圖1 小鼠氣道原代club祖細(xì)胞流式分選策略與類器官培養(yǎng)模型

3 討論

NO是一種功能作用機(jī)制多樣的自由基分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝與氧化應(yīng)激等多方面發(fā)揮重要作用。在哮喘等氣道疾病中，NO代謝異常是氣道炎癥病理學(xué)表現(xiàn)的原因之一［14］。本課題組前期應(yīng)用類器官模型發(fā)現(xiàn)，哮喘過程中常見的高濃度NO抑制小鼠氣道上皮原代club祖細(xì)胞的增殖能力［6］。本研究結(jié)果顯示，高濃度NO抑制小鼠原代club祖細(xì)胞代謝相關(guān)基因Hmgcr、Gmps和Gpt2的表達(dá)。Hmgcr 催化乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）的下游產(chǎn)物羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原生成甲羥戊酸［15］，控制細(xì)胞膽固醇合成［16］；Gpt2催化三羧酸循環(huán)中α-酮戊二酸生成谷氨酸［17］；Gmps 催化谷氨酰胺生成鳥嘌呤核苷酸［18］。本研究利用類器官模型研究發(fā)現(xiàn)，利用小分子抑制劑抑制Hmgcr、Gmps 和Gpt2的活性可顯著降低原代club 祖細(xì)胞類器官大小，提示原代club 祖細(xì)胞增殖依賴于這3 條代謝通路。抑制Gpt2 或者Gmps 的活性導(dǎo)致原代club祖細(xì)胞類器官形成效率下降，提示Gpt2和Gmps 代謝通路有助于原代club 祖細(xì)胞維持自我更新能力。因此，高劑量NO損害小鼠氣道祖細(xì)胞再生功能可能與其抑制Hmgcr、Gmps 和Gpt2 代謝有關(guān)。Hmgcr 控制細(xì)胞膽固醇合成，而膽固醇在促進(jìn)有絲分裂的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇是小腸干細(xì)胞的有絲分裂原之一，促進(jìn)小腸干細(xì)胞增殖［19］。Gpt2 可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖［20-21］。使用Gmps 抑制劑可以抑制人前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［18］。在影響細(xì)胞增殖能力方面，既往對(duì)這3個(gè)基因的研究結(jié)果與筆者在原代club 祖細(xì)胞上觀察到的表現(xiàn)一致。

氣道上皮黏膜的穩(wěn)態(tài)維持與損傷后修復(fù)需要club 祖細(xì)胞保持較強(qiáng)的增殖能力。對(duì)于哮喘患者，氣道上皮黏膜的修復(fù)受阻是導(dǎo)致炎癥持續(xù)的原因［22］。有研究表明，氣道上皮黏膜修復(fù)受阻與哮喘患者呼出氣體中的NO 水平增高有關(guān)［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量NO的損傷作用可能與其抑制脂代謝與核苷酸代謝途徑Hmgcr、Gmps 和Gpt2 有關(guān)。可見，氣道高劑量NO 的持續(xù)存在對(duì)氣道上皮黏膜損傷后的修復(fù)是不利的。還有研究表明，NO依賴性的線粒體損傷及腺苷三磷酸合成的減少可以導(dǎo)致持續(xù)的上皮細(xì)胞損傷與后續(xù)炎癥反應(yīng)的增加［24］。核苷酸合成功能維持在正常水平是保證氣道上皮細(xì)胞代謝、纖毛細(xì)胞清除作用正常的基礎(chǔ)，而這兩種作用對(duì)維持氣道穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗慢性阻塞性肺疾病引起的功能失調(diào)起重要作用［25］。新型冠狀病毒在早期感染氣道上皮細(xì)胞，造成上皮黏膜損傷也可能與脂代謝異常下降有關(guān)［26］。因此，異常的脂代謝和核苷酸代謝可能是造成上皮黏膜結(jié)構(gòu)和功能受損的重要原因。

Fig.2 The differential change genes of club cells after NO stimulation圖2 NO刺激后原代club祖細(xì)胞差異變化基因火山圖

Fig.3 The effect of NO on the expression of metabolic genes in mouseclub cells圖3 NO對(duì)小鼠原代club祖細(xì)胞相關(guān)代謝基因表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of simvastain on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)圖4 辛伐他汀對(duì)小鼠原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響（×40）

Fig.5 The effect of DON on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)圖5 DON對(duì)小鼠原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響（×40）

Fig.6 The effect of AOA on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)圖6 AOA對(duì)小鼠原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響（×40）

綜上所述，脂質(zhì)代謝和核苷酸代謝與club 祖細(xì)胞的增殖功能密切相關(guān)，高劑量NO刺激可導(dǎo)致club祖細(xì)胞代謝功能的紊亂，進(jìn)一步引起其增殖能力受損。以NO信號(hào)為靶點(diǎn)，緩解NO對(duì)氣道上皮黏膜損傷作用可為重癥哮喘患者氣道上皮損傷的臨床治療提供可能方案。

本研究仍存在一些局限性，如NO在哮喘進(jìn)程中發(fā)揮著復(fù)雜的作用，本研究利用體外類器官培養(yǎng)只模擬了單一代謝因素對(duì)原代club祖細(xì)胞增殖功能的影響，而對(duì)目前已知的NO在氧化應(yīng)激等其他方面發(fā)揮的作用沒有納入；NO對(duì)原代club祖細(xì)胞功能的調(diào)控可能存在多種機(jī)制，而且與其劑量有關(guān)，本研究沒有關(guān)注低劑量NO對(duì)氣道上皮再生修復(fù)的影響。