BMP2重組慢病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs后細(xì)胞礦化的實(shí)驗(yàn)研究

寧寅寬，劉林志，陳賢平

目前在組織工程研究領(lǐng)域，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是比較理想的種子細(xì)胞之一，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic proteins，BMP）已被證實(shí)能調(diào)控BMSCs 向成骨方向分化，BMP2 是目前研究最為廣泛、誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的BMP［1-2］。天然BMP2 在體內(nèi)無法實(shí)現(xiàn)緩釋，不能持續(xù)誘導(dǎo)BMSCs 的成骨分化，如何獲得持續(xù)、高效及穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)源性BMP2是目前研究的熱點(diǎn)［3］。細(xì)胞礦化與普通的地質(zhì)礦化的最大區(qū)別是無機(jī)相結(jié)晶嚴(yán)格受生物體分泌的有機(jī)質(zhì)控制，骨骼中的羥基磷灰石形成作為細(xì)胞礦化最普遍的表現(xiàn)形式，亦受到廣泛關(guān)注［4-5］。既往學(xué)者們?nèi)狈?duì)BMSCs 生物礦化現(xiàn)象的深入研究。本研究通過將BMP2重組慢病毒載體導(dǎo)入兔BMSCs，觀察BMP2 重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞向成骨方向分化后細(xì)胞礦化的能力，初步嘗試使用掃描電鏡能譜分析技術(shù)研究BMSCs 生物礦化現(xiàn)象，為干細(xì)胞基因治療和臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（美國HyClone 公司）；流式一抗小鼠抗兔CD44、CD45、CD29（美國Antigenix公司），同型對(duì)照小鼠抗兔IgG1（eBioscien公司），流式二抗PerCP 標(biāo)記（Jackson 公司）；BMP2 單克隆抗體（美國Bioworld 公司），山羊抗小鼠IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記、DAB顯色試劑盒、二抗FITC 標(biāo)記IgG（北京中杉金橋公司），Ⅰ型膠原單克隆抗體（武漢博士德），茜素紅（美國Sigma）；堿性磷酸酶（ALP）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），HiFi-MMLV 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 合成試劑盒（上海英俊生物技術(shù)有限公司），2×Es Taq MasterMix PCR 試劑盒（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司），DNA Marker、2×Tap PCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（荷蘭飛利浦公司），X 射線能譜分析儀（英國牛津公司），BMP2 重組慢病毒構(gòu)建和鑒定（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs 的獲取及鑒定 清潔級(jí)雄性6 月齡新西蘭大白兔1 只，體質(zhì)量1.2 kg，購自桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2013-0001，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。采用密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)法獲取第5代兔BMSCs，無菌條件下穿刺兔雙側(cè)股骨干骺端，獲取骨髓約5 mL，離心后棄上清液（1 500 r/min，5 min），用比重為1.073 g/mL 的percoll 分離（2 500 r/min，20 min）兔BMSCs，取界面處細(xì)胞層，離心后洗滌，以2×105個(gè)/cm2的密度接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，72 h后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每1 d 更換細(xì)胞培養(yǎng)液1 次。細(xì)胞生長到80%匯合時(shí)1∶2傳代培養(yǎng)，傳至第5 代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。取第5 代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按操作說明分別標(biāo)記CD44/CD45、CD29-PerCP，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 兔BMSCs的分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）；Lv-EGFP組［陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染僅攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的慢病毒）；Lv-BMP2/EGFP 組（實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染攜帶BMP2 和EGFP 基因的慢病毒）。第5代兔BMSCs以5×104個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)匯合至80%左右，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以感染復(fù)數(shù)（MOI=100）轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后換液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（綠色熒光蛋白細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)BMP2表達(dá) 分別隨機(jī)取轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞爬片，浸入40 g/L多聚甲醛，按SP免疫組織化學(xué)染色法操作，DAB 顯色，封固，在倒置顯微鏡觀察。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)BMP2 基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后72 h 提取3×106個(gè)細(xì)胞總RNA，根據(jù)RNA 提取試劑盒操作步驟，通過凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，使用分光光度計(jì)進(jìn)行純度濃度測(cè)定。按照MMLV逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒說明書合成第1條鏈cDNA。設(shè)計(jì)引物：GAPDH 引物（正義鏈5'-CCAGAA?CATCCCTGCCTC-3' ，反 義 鏈5'-TAGCCAAATTCGTTGT?CATACCA-3'），BMP2 引物（正義鏈5'-ACTACCAGAAAC?GAGTGGGAA-3'，反義鏈5'-GCATCTGTTCGGAAAACCT-3'）。按照2×Taq PCR MasterMix 試劑盒說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，調(diào)電泳儀各參數(shù)進(jìn)行電泳（U：220 V；I：140 mA；T：30 min），電泳結(jié)束，凝膠成像系統(tǒng)分析目的基因與對(duì)應(yīng)內(nèi)參光密度比值確定基因相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶OD 值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參照基因條帶OD 值。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。測(cè)量結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)BMP2 蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別取2×106個(gè)細(xì)胞，裂解液提取細(xì)胞總蛋白，按BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣品蛋白含量。取30 μg 上樣，10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)模，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加一抗BMP2 單克隆抗體室溫下?lián)u床震蕩孵育1 h，與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗孵育1 h 進(jìn)行抗體雜交，ECL 發(fā)光孵育1 min，曝光5 min，暗室內(nèi)壓片，顯影定影，凝膠成像儀對(duì)蛋白印跡進(jìn)行成像，以內(nèi)參光密度值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每組蛋白相對(duì)表達(dá)量，測(cè)量結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.6 兔BMSCs的成骨分化檢測(cè) 6孔板內(nèi)預(yù)先放置消毒好的塑料蓋玻片，按實(shí)驗(yàn)分組，以1×105個(gè)/孔接種6孔板進(jìn)行塑料細(xì)胞爬片培養(yǎng)。分別于第14、21天，隨機(jī)取爬片，按試劑盒說明書，行SP法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)、茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)形成。分別于第7、14、21天，各組隨機(jī)取3孔，按ALP試劑盒說明操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算ALP含量。

1.2.7 掃描電鏡和能譜分析觀測(cè)礦化結(jié)節(jié)表面微觀形貌及其元素構(gòu)成 第21天隨機(jī)取實(shí)驗(yàn)組塑料細(xì)胞爬片，固定后梯度丙酮逐級(jí)脫水，臨界點(diǎn)干燥，表面進(jìn)行噴鍍，在Quanta 200 FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境行掃描電鏡觀察和主要元素能譜分析。X射線能譜分析儀測(cè)定微區(qū)主要元素（碳、氮、氧、鈣、硫、磷）的質(zhì)量百分比和原子個(gè)數(shù)百分比，測(cè)定結(jié)果重復(fù)3次。計(jì)算鈣磷比（Ca/P）=鈣元素質(zhì)量百分比∶磷元素質(zhì)量百分比，并打印出能譜分析圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig.1 The characteristics of cell surface markers in BMSCs圖1 BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)特征

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)特征 流式細(xì)胞儀分析顯示第5 代兔BMSCs 的CD44、CD29 表達(dá)呈陽性，CD45 表達(dá)呈陰性，CD44、CD29、CD45 陽性細(xì)胞分別占92.20%±1.12%，76.30%±0.78%，0.26%±0.11%，BMSCs 的細(xì)胞表面標(biāo)志物符合BMSCs 的特征，見圖1。

2.2 BMSCs 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài) 轉(zhuǎn)染48 h 后，Lv-BMP2/EGFP組、Lv-EGFP 組細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下觀察到熒光，目的基因BMP2和EGFP報(bào)告基因成功修飾入細(xì)胞基因組，轉(zhuǎn)染效率分別為95.32%±1.05%和95.18%±0.82%?？瞻讓?duì)照組未觀察到熒光。各組BMSCs 細(xì)胞生長呈長梭形，形態(tài)均一，單個(gè)細(xì)胞輪廓較清楚，胞漿豐富，核仁明顯，細(xì)胞呈渦旋狀、放射狀密集排列，見圖2。

2.3 BMP2 免疫組織化學(xué)染色 Lv-BMP2/EGFP 組BMSCs 細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)，可見棕黃色染色，而Lv-EGFP組及空白對(duì)照組細(xì)胞呈陰性，見圖3。

2.4 BMP2 mRNA 表達(dá)情況 Lv-BMP2/EGFP 組、Lv-EGFP 組及空白對(duì)照組BMP2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.474±0.008，0.126±0.027 和0.095±0.007（n=3，F(xiàn)=458.641，P＜0.01），Lv-BMP2/EGFP 組BMP2 mRNA 水平高于Lv-EGFP 組及空白對(duì)照組（P＜0.05），且基因條帶結(jié)果符合擴(kuò)增片段長度，見圖4。

2.5 BMP2 蛋白表達(dá)情況 Lv-BMP2/EGFP 組、Lv-EGFP 組及空白對(duì)照組BMP2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.751±0.057，0.272±0.013，0.305±0.007（n=3，F(xiàn)=186.426，P＜0.01），Lv-BMP2/EGFP 組BMP2 蛋白表達(dá)量高于Lv-EGFP 組及空白對(duì)照組（P＜0.05），見圖5。

Fig.2 The cell morphology of BMSCs under fluorescence microscope(×100)圖2 BMSCs在倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（×100）

Fig.3 The SP immunochemical staining of BMP2 expression(DAB stanining,×200)圖3 免疫組織化學(xué)染色SP法檢測(cè)BMP2表達(dá)（DAB染色，×200）

Fig.4 The BMP2 gene expression in BMSCs measured by RT-PCR圖4 RT-PCR檢測(cè)BMSCs中BMP2基因表達(dá)水平

Fig.5 The protein expression of BMP2 measured by Western blot assay圖5 Western blot檢測(cè)BMP2蛋白表達(dá)

2.6 BMSCs的成骨方向分化 Lv-BMP2/EGFP組第14 天塑料細(xì)胞爬片在顯微鏡下觀察顯示細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色染色顆粒，Ⅰ型膠原SP法免疫組織化學(xué)染色呈陽性表達(dá)。第21天茜素紅染色呈現(xiàn)陽性，見形貌各不相同的礦化結(jié)節(jié)，礦化結(jié)節(jié)染色后呈現(xiàn)紅色。而Lv-EGFP 組及空白對(duì)照組Ⅰ型膠原染色和茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色均呈現(xiàn)陰性。見圖6、7。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染第7、14、21天，Lv-BMP2/EGFP組ALP水平較Lv-EGFP組及空白對(duì)照組升高，見表1。

Fig.6 The I collagen immunohistochemical staining of BMSCs(×100)圖6 BMSCsⅠ型膠原免疫組織化學(xué)染色（×100）

Fig.7 The alizarin red S staining of BMSCs(×50)圖7 BMSCs茜素紅染色（×50）

Tab.1 Comparison of ALP levels at different time points between the three groups表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)ALP水平比較（n=9，U/gprot，±s）

Tab.1 Comparison of ALP levels at different time points between the three groups表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)ALP水平比較（n=9，U/gprot，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與Lv-EGFP組比較，P＜0.05。

組別空白對(duì)照組Lv-EGFP組Lv-BMP2/EGFP組F第7天2.88±0.57 2.76±0.50 6.76±0.91ab 98.659＊＊第14天4.99±0.47 4.76±0.50 16.42±2.22ab 222.143＊＊第21天5.76±0.50 5.71±0.44 24.39±2.54ab 452.715＊＊

2.7 礦化結(jié)節(jié)觀察和元素能譜分析 在掃描電鏡下可見礦化結(jié)節(jié)相互連接成片狀，細(xì)胞重疊生長，基質(zhì)分泌旺盛，礦化結(jié)節(jié)散布在重疊細(xì)胞中并稍凸出于細(xì)胞層之上，形貌似含沙漿較多的水泥，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松、粗糙特點(diǎn)，見圖8。電鏡掃描微區(qū)得出能譜分析圖譜，見圖9，對(duì)應(yīng)主要元素見表2。礦化結(jié)節(jié)微區(qū)Ca/P為1.52±0.13。

Fig.8 The microscopic morphology of the mineralized nodule surface observed by SEM圖8 掃描電鏡觀察礦化結(jié)節(jié)表面微觀形貌

Fig.9 The energy spectrum analysis of the scanned area on the surface of the mineralized nodule圖9 礦化結(jié)節(jié)表面掃描區(qū)域能譜分析圖

Tab.2 The elemental analysis of the scanned area on the surface of the mineralized nodule表2 礦化結(jié)節(jié)表面掃描區(qū)域元素分析

3 討論

BMSC 由于其能較穩(wěn)定地保持干細(xì)胞生物學(xué)特征，為多種病毒載體導(dǎo)入目的基因進(jìn)行基因治療奠定了基礎(chǔ)［6］。BMP2 已被證實(shí)能單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCs 向成骨方向分化，但天然BMP2 獲取困難，價(jià)格昂貴，且局部發(fā)揮生物作用有限，因此利用病毒載體導(dǎo)入目的基因，持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)功能蛋白是解決該問題的有效方法［7］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒載體系統(tǒng)在導(dǎo)入目的基因后會(huì)因病毒載體導(dǎo)入時(shí)間的持續(xù)延長，出現(xiàn)外源基因丟失的現(xiàn)象，從而降低了目的基因表達(dá)效果［8］。慢病毒載體系統(tǒng)彌補(bǔ)了該缺陷，在目的基因表達(dá)持續(xù)時(shí)間上更具有優(yōu)勢(shì)。Milone 等［9-10］研究發(fā)現(xiàn)慢病毒可高效感染分裂中的BMSCs，成功把攜帶的目的基因?qū)爰?xì)胞，使目的基因在細(xì)胞中持續(xù)、穩(wěn)定、高效表達(dá)，從而進(jìn)行基因治療。本課題組前期研究也表明慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)的BMP2基因相對(duì)于腺病毒載體系統(tǒng)，在表達(dá)持續(xù)時(shí)間上更具有優(yōu)越性［11］。本研究以慢病毒為載體系統(tǒng)，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將攜帶BMP2基因和EGFP基因載體整合進(jìn)入BMSCs 中，使其在細(xì)胞內(nèi)能夠持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)。EGFP作為一種示蹤標(biāo)記的報(bào)告基因，其成功表達(dá)不僅示蹤標(biāo)記了攜帶BMP2 基因細(xì)胞的準(zhǔn)確位置，還可直接體現(xiàn)出細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率［12］。本研究通過檢測(cè)BMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)，證實(shí)了BMP2重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs 并誘導(dǎo)細(xì)胞成骨方向分化的可行性。

目前，病毒的轉(zhuǎn)染和BMSCs 成骨分化及其觀察的相關(guān)技術(shù)在國內(nèi)外已較為成熟，現(xiàn)被普遍認(rèn)可的主要有ALP、Ⅰ型膠原蛋白、成骨特異性蛋白（骨形態(tài)生發(fā)蛋白、骨橋蛋白等）、相關(guān)成骨分化調(diào)控因子（骨鈣素泌量、成骨轉(zhuǎn)錄因子等）為成骨早期的標(biāo)志物，而礦化結(jié)節(jié)形成可作為成骨晚期的標(biāo)志物［13-14］。本研究通過檢測(cè)骨化標(biāo)志性產(chǎn)物ALP、Ⅰ型膠原及礦化結(jié)節(jié)驗(yàn)證BMSCs 的成骨分化能力，但這些生物化學(xué)檢測(cè)方法只能間接反映細(xì)胞的成骨方向分化。因此，本研究同時(shí)利用掃描電鏡和能譜分析技術(shù)，直接對(duì)細(xì)胞成骨分化晚期的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行觀察，對(duì)其鈣、磷等元素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示礦化結(jié)節(jié)微區(qū)Ca/P為1.52±0.13，接近羥基磷灰石的鈣磷比1.67，說明礦化結(jié)節(jié)表面有鈣、磷沉積物產(chǎn)生，可能為磷酸鈣鹽。而硫、氮、氧、碳元素為有機(jī)物主要元素，可能為細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)胞膠原成分及細(xì)胞蛋白復(fù)合物的有機(jī)成分。

BMSCs向成骨分化后的細(xì)胞礦化是其主導(dǎo)骨形成的前提與基礎(chǔ)［4］。在細(xì)胞礦化過程中，其最基本的生物學(xué)特征是骨基質(zhì)合成、分泌及成熟，而礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分化的成熟標(biāo)志，同時(shí)也是成骨細(xì)胞行使成骨功能的主要形態(tài)學(xué)表現(xiàn)［15］。細(xì)胞礦化的表現(xiàn)是細(xì)胞外基質(zhì)的礦化及無機(jī)鈣、磷鹽的沉積，在整個(gè)BMSCs 礦化結(jié)節(jié)形成過程中，細(xì)胞和基質(zhì)起著非常重要的作用［16］。本研究在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)BMSCs成骨分化晚期，細(xì)胞會(huì)重疊生長，分泌大量細(xì)胞基質(zhì)，礦化結(jié)節(jié)則凸出于細(xì)胞層之上，出現(xiàn)磷酸鈣鹽堆積，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松、粗糙，說明BMSCs 成骨分化后細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)在細(xì)胞礦化過程中發(fā)揮重要作用。發(fā)生細(xì)胞礦化的細(xì)胞通過大量分泌細(xì)胞基質(zhì)，被自身大量分泌的細(xì)胞基質(zhì)包裹圍繞，從而使局部細(xì)胞基質(zhì)濃縮集中成沉淀的磷酸鈣鹽離子，使磷酸鈣鹽離子結(jié)晶導(dǎo)致礦化結(jié)節(jié)形成。其形成機(jī)制可能為礦化后的BMSCs 細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)ALP，從而促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的礦化，且其分泌的Ⅰ型膠原蛋白是構(gòu)成礦化結(jié)節(jié)的蛋白支架，Ⅰ型膠原蛋白支架與鈣、磷無機(jī)鹽親和，形成磷酸鈣鹽礦化結(jié)節(jié)。BMSCs 發(fā)生細(xì)胞礦化的分子調(diào)控機(jī)制可能是由于細(xì)胞礦化過程中編碼細(xì)胞外基質(zhì)成熟的基因表達(dá)增加，而與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)下降，且與細(xì)胞內(nèi)ALP活性、骨鈣素合成及細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)羥基磷灰石沉積的基因表達(dá)相關(guān)［17］。BMSCs成骨方向分化后的礦化過程實(shí)質(zhì)上為鈣、磷無機(jī)鹽在細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)沉積的過程，整個(gè)礦化過程始終伴隨著鈣、磷等元素的動(dòng)態(tài)變化［18］。

綜上所述，BMP2重組慢病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs 后，BMP2基因整合入細(xì)胞基因組中，高效表達(dá)BMP2功能蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨方向分化并發(fā)生細(xì)胞礦化，在細(xì)胞礦化過程中通過細(xì)胞基質(zhì)對(duì)無機(jī)鹽離子的濃集、沉淀，最終形成無機(jī)磷酸鈣鹽的礦化結(jié)節(jié)，其鈣磷比值非常接近人和動(dòng)脈骨骼中的主要無機(jī)磷酸鈣鹽羥基磷灰石的成分比值，說明其存在一定聯(lián)系，需要后續(xù)深入研究。