iTRAQ技術篩選差異蛋白S100A8在特發(fā)性膜性腎病中的表達及意義

黃宇珊,黃娟,李斯毅,吳勇,唐鳳英

(1. 汕頭大學醫(yī)學院,廣東 汕頭 515041;2. 廣東省惠州市中心人民醫(yī)院腎內科,廣東 惠州 516001)

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是一種免疫復合物介導的腎臟疾病[1],由足細胞抗原自身抗體引起,包括磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor,PLA2R)和含有7A的凝血酶反應蛋白1型結構域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7A),臨床多表現為腎病綜合征,早期診斷依賴腎活檢病理。腎活檢是有創(chuàng)檢查,有出血風險[2]。血清 PLA2R 抗體(anti-PLA2R)是目前公認且可用于臨床檢驗的IMN生物標志物[3],但僅約51.6%～82.0% IMN患者PLA2R陽性[4],3%～5%患者THSD7A陽性[5]。因此,需尋找新的可靠的生物標志物。同位素標記相對與絕對定量蛋白組學(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術是一種定量蛋白質組學的經典方法,具有敏感性高、重復性好的特點。本研究采用基于iTRAQ技術的蛋白質組學方法進行比較蛋白質組學分析尋找目標蛋白,對目標蛋白通過蛋白質免疫印跡(Western Blot,WB)及酶聯免疫吸附方法(ELISA法)進一步確認目標蛋白表達情況,以期發(fā)現IMN的候選生物標志物。

1 材料與方法

1.1病例收集 收集2021年1月至2021年8月惠州市中心人民醫(yī)院腎內科住院的初治腎病綜合征患者及我院體檢中心健康體檢者的外周血樣本。分組:①IMN組30例;②非特發(fā)性膜性腎病組(not-idiopathic membranous nephropathy,NIMN)組30例,病理類型為系膜增生性腎小球腎炎;③健康組30例。IMN組和NIMN組患者均符合腎病綜合征診斷標準:大量蛋白尿(>3.5 g/24 h),低蛋白血癥(<30 g/L),高脂血癥和高度水腫。所有患者均未使用激素及免疫抑制劑治療。血清樣品均為清晨空腹時采集,至少禁食8 h,3 000 r/min 10 min,收集上清液,分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時獲取3組受檢者的性別、年齡等一般信息,血清肌酐、24 h尿蛋白、甘油三酯等結果。本研究所遵循的程序符合倫理學要求,并經本院倫理委員會批準(倫理號:kyll2022022)。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2實驗方法 首先對6例IMN患者(女4例,男2例,平均年齡33.13歲)、6例NIMN患者(女4例,男2例,平均年齡32.23歲)和4例年齡和性別匹配的健康對照者進行基于iTRAQ的蛋白質組分析,包括iTRAQ肽標記、分類、質譜分析和數據庫比較。其后對30例IMN患者、30例NIMN患者和30名健康受試者的外周血用Western Blot及ELISA法進行S100A8蛋白定量驗證。

1.2.1iTRAQ蛋白質組學分析 將每組等量的蛋白質變性(8 mmol/L尿素、4%丙磺酸、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L二巰基蘇糖醇),還原(二巰基蘇糖醇),烷基化(碘乙酰胺),消化(胰蛋白酶),并用iTRAQ試劑標記,健康對照品 iTRAQ 113和114;IMN組iTRAQ 115、117、121;NIMN組iTRAQ 116、118、119。將iTRAQ標記的肽混合,用2D液相色譜(HILIC/SCX和保留相)分析,然后用Q-exactive質譜儀(Thermofisher)進行質譜分析。用Proteome Discoverer 1.3軟件轉化原始圖譜文件為.mgf文件,將其提交MASCOT 2.3.0服務器檢索,通過MASCOT服務器上形成的搜庫文件,根據FDR<0.01標準對數據進行篩選,完成蛋白質鑒定和定量,得到差異蛋白。對差異蛋白進行生物信息學分析。

1.2.2Western Blot(WB)法驗證目標蛋白 選取目標蛋白S100A8進一步驗證。對30例IMN患者、30例NIMN患者和30名健康受試者的外周血用WB法檢測3組S100A8蛋白表達量。取受試者樣本,蛋白質裂解液提取外周血蛋白質,BCA法測得蛋白質濃度,分別于對應孔中加入40 μg蛋白質,在10.0% Tris-HCl SDS/PAGE 凝膠上還原分離,將分離后的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,使用封閉液對轉印膜封閉處理后,用S100A8單克隆抗體等進行一級抗體封阻和探測,在4 ℃下過夜,根據制造商方案,加入二級抗體,通過增強型化學發(fā)光檢測,與β-肌動蛋白的內部對照相比較,通過測量相應帶的光密度(OD)來量化S100A8蛋白的相對水平。數據報告為相對強度單位。蛋白條帶經ImagJ軟件定量分析。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA試驗)定量檢測目標蛋白 雙抗體夾心法對3組外周血標本進行S100A8蛋白定量檢測。用人S100A8 ELISA試劑盒(美國SAB公司),按說明書進行標準品制備、酶標包被板加樣、溫育、洗板、加酶等操作后用酶標儀450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),根據標準品濃度計算出S100A8蛋白濃度。

2 結果

2.13組基本資料對比結果 3組在年齡、性別構成比、血壓、體重指數(BMI),差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IMN組和NIMN組的24 h尿蛋白定量、血清肌酐、尿酸、總膽固醇、甘油三酯高于健康對照組(P<0.05),血清白蛋白低于健康對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組基本資料對比結果

2.2蛋白質組鑒定結果

2.2.1蛋白質差異性變化 通過iTRAQ分析鑒定IMN患者和NIMN組之間血清差異表達蛋白,共鑒定到總蛋白數量為938個,通過蛋白質定量分析,與NIMN組相比,IMN組的8個蛋白質顯示出表達上調,6個蛋白質顯示出表達下調,差異蛋白信息,見表2。

表2 差異表達蛋白

2.2.2生物信息學分析 對篩選的14個差異表達蛋白進行蛋白質互作(PPI)網絡分析。本研究發(fā)現這些差異蛋白涉及細胞分裂、細胞分化、細胞漿移動、細胞凋亡、細胞存活、DNA甲基化、活性氧生成、細胞增殖等生物進程。圖1、圖2顯示了與這些蛋白質相關的9個生物過程及各差異蛋白之間的相互關系。結果表明,目標蛋白S100A8生物學功能主要集中在細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡過程。

圖1 IMN患者差異表達蛋白質相關的9個生物過程

注:Pathway Studio 6.0對13種差異表達蛋白(14種差異表達蛋白,不包括未命名蛋白產物)及其調控的細胞過程進行了注釋。圖中圓點表示差異表達蛋白質,正方形表示 KEGG 條目,顏色表示富集程度即P值大小。

2.3S100A8蛋白的Western Blot法驗證 從14種不同水平的蛋白質中選擇了S100A8蛋白質進一步研究,這種蛋白質以前沒有被報道為IMN的生物標志物,并且可以通過WB法檢測。然后對S100A8的WB數據進行了統(tǒng)計分析。結果示S100A8在IMN組和NIMN組有表達差異,條帶灰度(P<0.05)。見圖3、圖4。

2.4ELISA檢測結果 IMN組S100A8蛋白水平為(124.64±35.5) ng/mL,高于NIMN組[(80.69±20.98) ng/mL]和健康對照組[(47.73±9.58) ng/mL],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖5。ROC曲線分析顯示S100A8蛋白cut-off 值為80.16 ng/mL,其對于診斷IMN的敏感性為93.30%,特異性為75.00%,曲線下面積(areaunder the curve,AUC)為0.911,95%可信區(qū)間為 0.844～0.978。S100A8 蛋白可以很好地對IMN組與非IMN 組和健康對照組進行區(qū)分。見圖6。

注:3例正常對照組為N1～N3,3例IMN患者為C4～C6,NIMN患者為E7～E9;檢測β-肌動蛋白作為每個樣本的內部對照。

注:*P<0.05。

注:圖中的點表示樣本S100A8蛋白水平;***P<0.001。

圖6 S100A8蛋白水平ROC曲線

3 討論

膜性腎病是非糖尿病成年人中最常見的原發(fā)性腎小球疾病[6]。約30%的MN膜性腎病患者在長期隨訪中進展為終末期腎病(ESRD),因此在診斷時預測對特定治療方案的反應或MN膜性腎病的最終結果和預后可能有助于精準治療[7]。iTRAQ 技術是一種可同時對4種或8種樣品進行相對和絕對定量研究的定量蛋白質組學方法[8],已被用于鑒定敏感和特異的疾病狀態(tài)預后標志物,在腎臟疾病領域應用廣泛[9]。

本研究采用iTRAQ技術研究IMN、NIMN患者和健康者之間的差異表達蛋白,發(fā)現S100A8蛋白在IMN患者組表達明顯升高。通過Western Blot和ELISA進一步證實S100A8蛋白是IMN患者的高表達蛋白。S100A8蛋白來自S100蛋白家族,是晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)的配體, 晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)是蛋白質和脂質的非酶糖基化和氧化的產物,糖尿病腎病是證明AGEs在腎臟疾病中致病作用的經典模型[10]。最近研究表明[11],AGEs會在非糖尿病腎病尿毒癥患者體內積累。在慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者中,由于產量增加和腎排泄受損,AGEs水平顯著增加[12]。AGEs通過交聯結構蛋白或與RAGE相互作用啟動多個細胞內信號通路,激活核因子κ-B(NF-kB)[13],增加氧化應激,從而導致CKD[14]。因此,抑制AGEs/RAGE/NF-κB通路,對預防CKD具有重要意義。本研究發(fā)現S100A8蛋白在IMN組及NIMN組均升高,表明S100A8蛋白參與CKD進程,推測AGEs/RAGE/NF-κB通路激活所致,確切機制需要后續(xù)研究探索。IMN患者的S100A8蛋白生物學功能主要集中在細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡過程,推測S100A8蛋白引起IMN的機制與機體的細胞分化、異常增殖及凋亡等相關。而S100A8蛋白在IMN組升高更明顯,ROC 曲線分析顯示S100A8 蛋白可以很好地對 IMN組與非IMN 組和健康對照組進行區(qū)分,表明S100A8表達在腎臟病不同病理類型中存在差異。有研究表明,S100A8蛋白參與免疫介導炎癥反應,與炎癥嚴重程度相關[15],提示IMN的免疫損傷較NIMN嚴重。通過檢測外周血S100A8的表達有助于診斷IMN,S100A8可能是IMN的候選生物標志物,這需要進一步探索研究。

本研究有幾個局限性。首先S100A8濃度并不僅在IMN患者升高[16-19],S100A8的升高能否特異性反映IMN情況仍有待進一步研究。其次,本研究為單中心研究,納入病例數較少,未設置繼發(fā)性膜性腎病組對照,需要更多標本量行前瞻性研究來驗證研究結果。為了進一步研究S100A8在IMN的可能機制,必須招募更多的IMN患者來分析S100A8是否可能是IMN的生物標志物。

總之,本研究表明IMN患者外周血S100A8蛋白水平升高。S100A8蛋白有成為新的診斷與監(jiān)測IMN患者的生物標志物的潛力,可能是IMN的候選生物標志物。