定量光導(dǎo)熒光技術(shù)評(píng)價(jià)CPP-ACP聯(lián)合多樂(lè)氟對(duì)釉質(zhì)抗酸性影響的實(shí)驗(yàn)研究

韋方圓,劉錦,張然,韋宇,粱介技,陶雪嬌,黎淑芳,3

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科,廣西 百色 533000)

早期齲[1-2]指的是釉質(zhì)因致齲微生物形成牙菌斑代謝產(chǎn)酸而脫礦,且脫礦發(fā)生在釉質(zhì)表層下而未形成齲洞的部分齲損,常表現(xiàn)為牙釉質(zhì)的白堊色斑塊。傳統(tǒng)的修復(fù)方法是手術(shù)治療,然而在近幾年里,隨著人們對(duì)齲病認(rèn)知的不斷深化,局部用藥靶向抑制致齲菌菌斑生物膜活性及促進(jìn)已脫礦釉質(zhì)再礦化,從而探索簡(jiǎn)便、高效、無(wú)創(chuàng)、安全的防治手段成為可能。定量光導(dǎo)熒光(quantitative light-induced fluorescence,QLF)[3]是一種檢測(cè)早期齲病病變和監(jiān)測(cè)預(yù)防性干預(yù)措施的潛在工具,QLF的工作原理是牙釉質(zhì)自身熒光、檢測(cè)和檢測(cè)定量與脫礦相關(guān)的熒光損失在時(shí)光散射的增加使病變?cè)诹辆G色背景上出現(xiàn)暗點(diǎn),熒光圖像的損失可以量化與相鄰的健康組織。對(duì)牙齒的熒光圖像進(jìn)行記錄、數(shù)字化和定量分析。QLF在體內(nèi)的可靠性似乎非常適合定量光滑表面的初步齲變。本研究應(yīng)用QLF方法,比較去離子水組、CPP-ACP組、多樂(lè)氟組及聯(lián)合組對(duì)光滑面早期齲損的抑制效果,同時(shí)評(píng)價(jià)QLF方法用于縱向病變跟蹤監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)不同齲病干預(yù)措施效果的可能性。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象及納入和樣本制備

1.1.1研究對(duì)象 收集在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科就診的因正畸減數(shù)拔牙的新鮮前磨牙34顆,本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有參與實(shí)驗(yàn)的患牙其家屬術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn):在顯微鏡下觀察,要求牙齒根尖孔發(fā)育完全;冠根均無(wú)齲、無(wú)四環(huán)素牙、無(wú)釉質(zhì)發(fā)育不全或礦化不全;牙冠形態(tài)正常,無(wú)隱裂;無(wú)牙體缺損及充填體,無(wú)明顯色素沉著。

1.1.2樣本制備 將34顆前磨牙依次用600目、800目碳化硅水砂紙?jiān)诹魉聦?duì)頰側(cè)面釉質(zhì)進(jìn)行拋光。從中隨機(jī)選取2個(gè)牙齒標(biāo)本放入生理鹽水,不作任何處理,作為電鏡檢查對(duì)照。剩余32顆前磨牙于頰側(cè)面中央建立大小4 mm×4 mm正方形開(kāi)窗區(qū),其余牙體表面用透明抗酸指甲油覆蓋,隨機(jī)分為4組,每組8顆牙,并為每組各個(gè)標(biāo)本制作硅橡膠底座。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 定量光導(dǎo)熒光系統(tǒng)(Inspektor Research Systems BV)、CPP-ACP糊劑(GC公司 日本)、多樂(lè)氟(高露潔棕欖有限公司 美國(guó))、乙酸(上海生工生物有限公司)、氫氧化鈉(上海生工生物有限公司)、去離子水(右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供)、抗酸指甲油(美寶蓮有限公司)、實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)(上海梅特勒-托利多公司)、37 ℃電熱水浴恒溫箱(北京利康達(dá)圣科技發(fā)展有限公司)、4 ℃冰箱(中國(guó)海爾公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(廣州市星爍儀器有限公司)、場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本高新技術(shù)公司/英國(guó)牛津公司)。

1.2方法 術(shù)前使用定量光導(dǎo)熒光系統(tǒng)檢測(cè)各組基線處的△F、Area、△Q值,然后對(duì)各組開(kāi)窗區(qū)分別進(jìn)行以下處理:①去離子水組:氣槍吹干牙面,去離子水沖洗;②CPP-ACP組:氣槍吹干牙面,小棉棒均勻涂布CPP-ACP,完全覆蓋開(kāi)窗區(qū),10 min后去離子水沖洗,按照使用說(shuō)明每天早晚各涂布1次;③多樂(lè)氟組:氣槍吹干牙面,小棉棒均勻涂布多樂(lè)氟,完全覆蓋開(kāi)窗區(qū),10 min后去離子水沖洗;④聯(lián)合組:CPP-ACP每天早晚各涂布1次,而多樂(lè)氟只在第1天涂布,涂布方法同上,10 min后去離子水沖洗。將處理完畢的標(biāo)本浸泡在人工脫礦液中,置入37 ℃電熱恒溫水浴箱中進(jìn)行PH循環(huán)實(shí)驗(yàn),每天更換脫礦液,72 h后取出,所有標(biāo)本用生理鹽水沖洗干凈并用氣槍吹干,利用定量光導(dǎo)熒光系統(tǒng)拍攝每組標(biāo)本的熒光圖像。

1.3QLF圖像攝取及分析 所有牙釉質(zhì)標(biāo)本均于抗酸實(shí)驗(yàn)處理前(基線)和處理后第3天由同一操作員在無(wú)環(huán)境光的暗房中使用定量光導(dǎo)熒光系統(tǒng)拍攝QLF圖像。在每次拍攝QLF圖像之前,將標(biāo)本的釉質(zhì)表面用氣槍吹干5 s。由系統(tǒng)自帶的軟件Q-Ray v1.42保存并分析熒光圖像,見(jiàn)圖1。界定病損范圍,由系統(tǒng)的分析軟件測(cè)量每個(gè)標(biāo)本的熒光損失百分比(△F,%),相應(yīng)的脫礦面積(Area,px2),病變體積(△Q,%px2),以確定病變嚴(yán)重程度,設(shè)置△F值變化-5%為病損閾值。

注:A.原始QLF圖像;B.人工描繪病損區(qū)域;C.自動(dòng)生成參考的圖像;D.在原始圖像上顯示所選區(qū)域中每個(gè)像素的熒光損失。

1.4掃描電鏡觀察釉質(zhì)表面形貌 抗酸實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)選取2個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本以及在生理鹽水中備份保存的2個(gè)原樣標(biāo)本,用高速渦輪手機(jī)將這10顆離體牙切割成包含實(shí)驗(yàn)開(kāi)窗區(qū)在內(nèi)的約為4 mm×4 mm×2 mm大小的釉質(zhì)塊,見(jiàn)圖2。清潔開(kāi)窗區(qū)表面,鼓風(fēng)干燥箱中干燥72 h,離子濺射噴金,抽真空,放大倍數(shù)20 000倍,掃描電鏡觀察抗酸實(shí)驗(yàn)后開(kāi)窗區(qū)釉質(zhì)表面形貌。

圖2 4 mm×4 mm×2 mm大小釉質(zhì)塊

2 結(jié)果

2.1抗酸實(shí)驗(yàn)前各組人工釉質(zhì)齲標(biāo)本的QLF均值 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前各組的QLF值比較

2.2脫礦后各組人工釉質(zhì)齲標(biāo)本的QLF熒光圖片結(jié)果 在QLF熒光圖片中顯示為亮度減弱的熒光損失暗區(qū),4個(gè)不同處理組形成病損的嚴(yán)重程度不一。從圖片中可以看出,聯(lián)合組頰側(cè)面形成的脫礦面積最少,熒光損失最輕。見(jiàn)圖3。

注:A.去離子水組;B.CPP-ACP組;C.多樂(lè)氟組;D.聯(lián)合組圖。

2.3脫礦后各組人工釉質(zhì)齲標(biāo)本QLF均值比較 在脫礦液中連續(xù)浸泡3 d后,4組標(biāo)本的頰側(cè)面開(kāi)窗區(qū)均形成了不同程度的脫礦病損。與去離子水組比較,CPP-ACP組、多樂(lè)氟組以及聯(lián)合組的早期齲病損較輕,其中聯(lián)合組△F、Area、△Q最少。各組脫礦后△F、Area、△Q比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);因此進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,各組組間△F、Area、△Q差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)后各組的 QLF 檢測(cè)比較

2.4掃描電鏡觀察結(jié)果 掃描電鏡下觀察原樣標(biāo)本釉質(zhì)表面平整,質(zhì)地致密光滑,未見(jiàn)有釉柱晶體溶解及孔隙結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖4A;去離子水組可見(jiàn)明顯的酸蝕樣外觀,釉柱晶體大量溶解,質(zhì)地疏松,表面明顯粗糙不平,大量散在的孔隙及裂縫狀結(jié)構(gòu)存在,見(jiàn)圖4B;CPP-ACP組可見(jiàn)釉質(zhì)表面有少量微觀顆?；蛐∏?伴有少量大塊狀雜質(zhì)吸附,孔隙結(jié)構(gòu)較少,見(jiàn)圖4C;多樂(lè)氟組可見(jiàn)釉質(zhì)表面層疊狀礦物質(zhì)連接成片,伴有小顆粒結(jié)晶沉積在孔隙,孔隙結(jié)構(gòu)較少,見(jiàn)圖4D;聯(lián)合組可見(jiàn)釉質(zhì)表面少許裂隙及磨痕,幾乎無(wú)孔隙,質(zhì)地致密光滑,有不同程度的高密度礦物質(zhì)覆蓋,見(jiàn)圖4E。

注:A.原樣釉質(zhì);B.去離子水組;C.CPP-ACP組;D.多樂(lè)氟組;E.聯(lián)合組。

3 討論

目前,針對(duì)檢測(cè)齲病的方法通常有國(guó)際齲病檢測(cè)評(píng)估系統(tǒng)、掃描電子顯微鏡觀察、顯微硬度測(cè)試、激光熒光檢測(cè)(DIAGNOdent)、顯微放射照相、定量光導(dǎo)熒光技術(shù)、光學(xué)相干斷層掃描術(shù)等[4-7]。QLF是荷蘭Inspektor Research Systems BV公司在1994 年開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種基于牙齒的自體熒光而發(fā)展起來(lái)的光學(xué)診斷技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)使用的第二代新型設(shè)備QLF-D Bilu-minator TM 由安裝在裝有60 mm微距鏡頭的單反相機(jī)上的雙面發(fā)光器組成,以波長(zhǎng)波譜范圍為385～425 nm激光束作為光源。該技術(shù)可以用于檢測(cè)和量化齲白斑病變,以及監(jiān)測(cè)早期光滑面病損脫礦和再礦化的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較高。使用QLF技術(shù)可在整個(gè)操作期間由一位操作員執(zhí)行,減少誤差和標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)的工作。邢向輝等[8]利用QLF技術(shù)縱向監(jiān)測(cè)含氟涂膜對(duì)離體牛牙釉質(zhì)再礦化過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化,結(jié)果顯示QLF技術(shù)適用于觀察光滑面人工齲損中礦物質(zhì)含量改變的動(dòng)態(tài)過(guò)程。沈紅等[9]應(yīng)用QLF技術(shù)評(píng)價(jià)114名幼兒的201顆乳磨牙牙合面窩溝封閉半年效果,結(jié)果顯示窩溝封閉后6個(gè)月內(nèi)封閉區(qū)域的紅色熒光比封閉前明顯減少,顯示窩溝封閉劑具有阻擋菌斑及軟垢在牙面附著的能力,得出結(jié)論:QLF適用于在臨床中評(píng)價(jià)窩溝封閉效果,可作為跟蹤患者預(yù)防性治療效果的支持方法之一。定量光導(dǎo)熒光技術(shù)拍攝簡(jiǎn)單,且準(zhǔn)確性高,因此本實(shí)驗(yàn)采用了定量光導(dǎo)熒光技術(shù)對(duì)牙釉質(zhì)標(biāo)本礦物質(zhì)含量變化進(jìn)行量化分析。

非礦化治療早期齲病變已被證實(shí)在臨床實(shí)踐中具有顯著的優(yōu)勢(shì)[10]。用氟化物治療已被證明可以提高再礦化率,并已被廣泛用于增加早期齲病的再礦化。酪蛋白磷酸肽(CPP)具有穩(wěn)定無(wú)定形磷酸鈣(ACP)的能力,CPP-ACP復(fù)合物具有緩沖pH,防止脫礦到增強(qiáng)再礦化的作用。CPP-ACP作為氟化物的輔助治療已經(jīng)顯示出了良好的結(jié)果[11]。在本研究中,在QLF熒光圖像中表現(xiàn)為聯(lián)合組形成的病損明顯較去離子水組、CPP-ACP組、多樂(lè)氟組形成的病損輕微,聯(lián)合組△F、Area、△Q最少。各組脫礦后△F、Area、△Q差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)表明CPP-ACP與多樂(lè)氟聯(lián)合運(yùn)用可以有效抑制牙釉質(zhì)光滑面早期齲損形成的作用,兩者聯(lián)合運(yùn)用能提高釉質(zhì)的抗酸性,起協(xié)同效應(yīng),與THIMMAIAH C等[12]學(xué)者的研究結(jié)果一致。CPP-ACP對(duì)治療咬合牙表面的早期齲齒病變有良好的療效。當(dāng)病變位于光滑表面時(shí),氟化物和CPP-ACP聯(lián)合治療可達(dá)到與氟化物單藥治療相同的效果。對(duì)于咬合病變,CPP-ACP和氟化物聯(lián)合治療甚至可能比氟化物單藥治療提高療效。然而,未來(lái)還需要更多的大樣本嚴(yán)格的研究來(lái)證實(shí)CPP-ACP在治療早期齲病方面的優(yōu)勢(shì)。

本研究掃描電鏡結(jié)果顯示,原樣釉質(zhì)標(biāo)本表面平整,符合正常釉質(zhì)掃描電鏡下地貌,說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)選取的標(biāo)本釉質(zhì)礦化程度及發(fā)育狀態(tài)良好,無(wú)礦化不良現(xiàn)象。去離子水處理的釉質(zhì)標(biāo)本經(jīng)過(guò)脫礦液浸泡后,表面呈現(xiàn)明顯的酸蝕樣地貌,釉柱晶體大量溶解析出,質(zhì)地疏松,表面明顯粗糙不平,大量散在的孔隙及裂縫狀結(jié)構(gòu)存在,與釉質(zhì)早期齲損病變相似,可能是釉質(zhì)與酸直接接觸一定時(shí)間后,釉柱晶體間的間隙被打開(kāi),并一直呈開(kāi)放狀態(tài),為酸持續(xù)向釉質(zhì)內(nèi)侵蝕提供通路,晶體溶解析出,最終形成“空洞”樣的微孔結(jié)構(gòu),說(shuō)明去離子水不能阻礙酸對(duì)釉質(zhì)的侵蝕,不能增加釉質(zhì)抗酸蝕的能力。CPP-ACP處理的釉質(zhì)標(biāo)本經(jīng)脫礦液浸泡后,表面呈現(xiàn)少量不規(guī)則微觀顆?；蛐∏?伴有少量大塊狀雜質(zhì)吸附,孔隙結(jié)構(gòu)較少,可能是CPP-ACP作為鈣磷等物質(zhì)的儲(chǔ)存庫(kù),在酸性環(huán)境中,釋放出高濃度的鈣、磷酸根離子向釉質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn),減少釉質(zhì)礦物質(zhì)流失,阻擋釉質(zhì)脫礦,圖示的不規(guī)則白色顆粒或小球狀微觀晶體或許就是儲(chǔ)存部位的體現(xiàn),并且說(shuō)明CPP-ACP可以保護(hù)釉質(zhì)不被脫礦,增強(qiáng)抗酸能力。但是CPP-ACP 為何能提高釉質(zhì)的抗酸性,其中的機(jī)制現(xiàn)在還不是很清楚。有些學(xué)者推測(cè)這其中的原理可能與CPP-ACP 的再礦化能力有關(guān)[13]。多樂(lè)氟處理的釉質(zhì)標(biāo)本經(jīng)脫礦液浸泡后,表面顯示為疊狀礦物質(zhì)連接成片,伴有小顆粒結(jié)晶沉積在孔隙,孔隙結(jié)構(gòu)較少,可能是多樂(lè)氟與牙釉質(zhì)表面接觸后形成氟化鈣,氟化鈣在在酸性環(huán)境中溶解釋放出氟離子,再次與羥基磷灰石形成氟磷灰石礦物質(zhì)沉積于釉質(zhì)表面及孔隙中,提示多樂(lè)氟具有增強(qiáng)釉質(zhì)抗酸性,抑制脫礦的作用。其中,經(jīng)CPP-ACP與多樂(lè)氟聯(lián)合處理的釉質(zhì)表面幾乎無(wú)孔隙,質(zhì)地致密光滑,有不同程度的高密度礦物質(zhì)覆蓋,脫礦程度最輕,說(shuō)明CPP-ACP與多樂(lè)氟聯(lián)合運(yùn)用的抗酸蝕能力最強(qiáng),起協(xié)同作用。然而兩者聯(lián)合運(yùn)用時(shí),有研究表明[14]先使用 CPP-ACP 后使用氟化物產(chǎn)生的再礦化作用更早且再礦化程度更高。研究發(fā)現(xiàn)可能的原因是先使用氟化 物可能會(huì)導(dǎo)致氟磷灰石在釉質(zhì)表面沉積,導(dǎo)致齲白斑表面孔隙孔徑減小、數(shù)量減少,進(jìn)而影響 CPP-ACP 向病變深部滲透發(fā)揮作用。同時(shí)有臨床試驗(yàn)也得出了相同的結(jié)果[15]。因此上述結(jié)果提示在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí),聯(lián)合使用氟化物尤其是氟化物濃度較高時(shí),應(yīng)謹(jǐn)慎考慮使用順序可能對(duì)結(jié)果造成的影響。