阿拉伯木聚糖對帕金森病大鼠行為學和腸道菌群影響研究

羅雪蓮,王功俊,王潔,馮云,黃曉華,包成政,潘敏夫,邵熔,李雪斌,,4

(1. 右江民族醫(yī)學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣西 百色 533000;4. 廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點實驗室,廣西 百色 533000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是神經(jīng)系統(tǒng)退行性中最常見的疾病之一,具有不斷發(fā)展的復雜層次。它一直與路易體有關的帕金森氏癥的經(jīng)典運動特征和黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的喪失為特征[1]。在中老年人群中發(fā)病率普遍增高,嚴重影響到患者的生活質(zhì)量[2]。PD的臨床表現(xiàn)包括多種運動癥狀和非運動癥狀,PD患者的胃腸功能障礙的臨床表現(xiàn)包括營養(yǎng)不良、口腔及口腔疾病、涎漏、吞咽困難、胃輕癱、便秘、排便功能障礙[3]。當前臨床上治療PD用多巴胺可以暫時控制住病人的運動癥狀,但是非運動癥狀如多巴胺能神經(jīng)元持續(xù)丟失的現(xiàn)象和胃腸道功能障礙的問題尚不能解決。因此,臨床上需要更多的治療方法和藥物來延緩PD的進展。

阿拉伯木聚糖(arabinoxylans,AX)是在許多谷物中發(fā)現(xiàn)的非淀粉多糖,它具有免疫調(diào)節(jié)和益生活性,其功能活性是與結構組成密切相關的[4]。目前對于小麥AX的免疫調(diào)節(jié)功能的研究較少,不能確定其益生活性與免疫調(diào)節(jié)功能是否存在一定的聯(lián)系,AX的免疫調(diào)節(jié)作用可能與腸道短鏈脂肪酸的間接作用有關[5]。 AX作為一種膳食纖維,它們能增加雙歧桿菌和乳酸菌等的有益微生物群。雙歧桿菌在結腸中發(fā)酵膳食纖維時,產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以使腸道的pH值降低,并且可以抑制潛在致病菌的生長,作為一種功能性低聚糖,它的益生作用可以使許多慢性疾病的風險降低[6]。有大量研究發(fā)現(xiàn)腸道中的α-突觸核蛋白聚集會使腸道的菌群失調(diào),從而導致腸道的通透性增加,這可能會讓腸神經(jīng)系統(tǒng)中的α-突觸核蛋白積聚進而影響大腦,促進疾病的發(fā)生與發(fā)展[7]。故本研究基于“腸道菌群-腸-腦軸”對PD大鼠腸道菌群特點進行分析,觀察AX對PD大鼠行為學及腸道菌群的影響,是否能通過改善腸道菌群的失調(diào)從而降低腦內(nèi)α-突觸核蛋白的表達,為AX治療PD提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 選取SD成年健康雄性SPF級大鼠40只,重量體質(zhì)量150～180 g,6～8周齡,購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(湘)2019-0014。所有實驗大鼠均于室溫20 ℃左右,相對濕度45%～55%,SPF級動物房中單籠適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。實驗過程中嚴格按照實驗動物理論學要求以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》完成各項飼養(yǎng)工作,并按實驗動物3R原則給予人道關懷。主要實驗試劑:魚藤酮 (上海希格瑪貿(mào)易有限公司,貨號R8875-5G);葵花籽油(上海麥克林生化科技股份有限公司,貨號C14294665);美多芭(上海羅氏制藥有限公司,貨號H10930198);AX(上海賽普瑞特分子生物科技有限公司,貨號4891668326689);α-突觸核蛋白(上海艾博抗貿(mào)易有限公司,貨號ab27766);酪氨酸蛋白(上海艾博抗貿(mào)易有限公司,貨號ab137869)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組 40只SD大鼠,采用隨機數(shù)字法隨機分為5組,即:空白組、假手術組、模型組、美多芭組、AX組,每組各8只。

1.2.2模型制備 PD模型制備:采用于頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d),魚藤酮在葵花油中的濃度為1.5 mg/mL,每天注射1次,注射按照動物體質(zhì)量給藥,每周停藥1次,共30 d。在給魚藤酮葵花油乳化液期內(nèi),當動物出現(xiàn)四肢癱瘓、無法站立行走、翻身困難、無法進食時,立即終止注射。篩選模型制作成功的標準為:發(fā)生行為學記分后(3～5周)即終止給魚藤酮[8]。行為學評分標準,參照文獻[9],按照表1評分:行為學評分2～8分可認為成模,按照評分標準篩選造模成功大鼠共24只。假手術組:于頸背部皮下注射等規(guī)格的不含有魚藤酮的葵花油乳化液,每天1次,共30 d。

表1 PD模型評分標準

1.2.3給藥方式及劑量 模型制備成功后,美多芭組給予美多芭混懸液50 mg/(kg·d)灌胃,AX組以AX混懸液800 mg/(kg·d)灌胃,模型組按體質(zhì)量予蒸餾水灌胃,1天1次,連續(xù)14 d。空白組及假手術組正常飼養(yǎng),不予任何藥物干預。

1.2.4行為學檢測 懸掛實驗:用于大鼠肌張力的檢測,在實驗準備開始前,讓實驗大鼠適應環(huán)境30 min,在距地面1 m處,提前準備一根直徑2 mm、長約20 cm的金屬絲,將大鼠兩前爪懸掛于水平放置的金屬絲上,記錄大鼠落地前的時間,如大鼠在3 s內(nèi)跌落或僅一個爪抓住金屬絲均屬失敗。每只大鼠重復測量3次,每次間隔5 min,最后懸掛時間取3次平均值。

1.2.5免疫組化染色 大鼠麻醉后,斷頭取腦,將全腦固定于4%的多聚甲醛中,固定24 h后切下中腦,用石蠟包埋中腦組織,切片常規(guī)脫蠟至水,將切片放入3%檸檬酸修復液高壓修復,待頂開氣閥后修復10 min。將高壓鍋自然冷卻至室溫,蒸餾水水洗5 min。加入3%甲醇雙氧水20 min,蒸餾水水洗5 min,PBS浸泡1 min。滴加5%BSA,室溫孵育30 min棄掉。滴加一抗工作液(稀釋倍數(shù)為1∶120),4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液洗3次,每次5 min。滴加二抗工作液,37 ℃孵育20 min。PBS緩沖液洗3次,每次5 min。DAB顯色,自來水洗,蘇木素復染、分化、反藍、脫水,透明、封片,顯微鏡觀察各組大鼠中腦黑質(zhì)組織α-SYN蛋白和TH蛋白的表達情況,采集100倍鏡下圖片。結果細胞核呈藍色,陽性結果呈棕色或棕黃色。依據(jù)陽性免疫反應的圖象選取陽性表達區(qū)域,用Image-Pro Plus軟件測定陽性免疫染色強度和面積,最后計算平均光密度值,平均光密度=積分光密度/總面積。

1.2.6腸道菌群檢測 用1.5 mL無菌EP管收集大鼠結腸糞便,收集完成后將糞便立即置于-80℃冰箱保存。經(jīng)過質(zhì)量檢測后行16S rDNA 基因高通量測序技術檢測大鼠腸道菌群,選取細菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域序列進行基因擴增及基因測序,通過α多樣性指數(shù)ACE、Chao1、Shannon、Simpson進行多樣性比較,并且通過組間菌群差異分析找出各組之間的差異菌群。

2 結果

2.1懸掛實驗結果 與空白組和假手術組相比,模型組大鼠懸掛實驗停留時間較短(P<0.05);假手術組和空白組無明顯差異(P>0.05);經(jīng)過14 d干預后,與模型組相比,AX組和美多芭組大鼠懸掛時間明顯增長(P<0.05);AX組和美多芭組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠干預14 d后的懸掛時間

2.2免疫組化染色結果 如圖1所示,陽性結果呈棕黃色。與空白組和假手術相比,模型組α-SYN表達顯著升高;與模型組相比,美多芭組和AX組α-SYN表達明顯下降。TH蛋白在模型組中明顯低表達,與模型組相比,美多芭和AX組中TH表達上升。

圖1 各組大鼠中腦黑質(zhì)α-SYN和TH表達

2.3各組大鼠腸道菌群16S rRNA檢測結果

2.3.1菌群α多樣性分析 采集大鼠結腸糞便,進行16S rRNA高通量基因測序結束檢測大鼠腸道菌群。菌群α多樣性分析結果發(fā)現(xiàn),與空白組和假手術組相比,模型組ACE、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)降低,菌群多樣性較少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比,AX組ACE、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)升高,菌群多樣性較豐富,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠α-SYN和TH蛋白平均光密度值

2.3.2LEfSe 物種差異分析 采用LEfSe方法找到組間差異物種,結果顯示,各組大鼠腸道菌群差異顯著,以LDA閾值>3測量代表微生物具有顯著差異,如圖2A結果空白組和假手術組中毛螺科(Lachnospiraceae)、毛螺目(Lachnospirales)和未定義的梭狀芽孢桿菌豐度(Unclassified_ clostridia_ UCG_ 014)增加為主,模型組中普雷沃氏菌(Prevotellaceae)、擬桿菌門(Bacteroidota)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌綱(Bacteroidia)相對豐度增加;與模型組相比,AX組改變主要以厚壁菌門(Firmicutes)、梭狀芽孢桿菌綱(Clostridia)、毛螺目(Lachnospirates)和毛螺科(Lachnospiraceae)相對豐度增加為主。以見圖2B。

注:K為空白組,R為假手術組,D為模型組,M為美多芭組,X為AX組。

3 討論

本研究探索了AX對PD大鼠的作用,檢測了PD大鼠的運動功能、中腦黑質(zhì)中α-突觸核蛋白和酪氨酸羥化酶的表達及腸道菌群結構,研究結果表明,給予大鼠注射含有魚藤酮葵花油乳化液造模后,大鼠微生物菌群中擬桿菌門(Bacteroidota)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌綱(Bacteroidia)相對豐度增加;在給予AX干預后,發(fā)現(xiàn)PD大鼠行為學表現(xiàn)和腸道菌群失調(diào)有明顯的改善效果,能夠有效恢復PD大鼠的肌力,延長了大鼠的懸掛時間;重新構建PD大鼠腸道菌群結構,能夠升高健康菌群厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)的豐度,降低致病菌群擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度,抑制黑質(zhì)α-SYN表達的同時,增加了中腦黑質(zhì)TH的表達,保護了多巴胺能神經(jīng)元,研究提示AX可能通過腸道菌群-腸-腦軸來改變腸道菌群結構從而緩解PD癥狀達到治療效果。有相關研究表明,在灌胃一定劑量的AX后,能夠使鼠結腸內(nèi)容物雙歧桿菌和乳酸菌的含量增加同時使大腸桿菌和糞腸球菌含量顯著降低[10]。而本研究中的菌群改變與之不同,原因可能是給予的AX的劑量和時間有所不同,加上動物本身之間存在的差異所導致,但是通過灌胃AX同樣起到促進有益菌生長的作用。

在過去的20多年里,大量的研究已經(jīng)證實了腸道微生物群與PD存在密切的聯(lián)系[11-12]。腸道菌群不僅對胃腸道有調(diào)控作用,還對帕金森癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等產(chǎn)生重要影響[13]。眾所周知,PD通常與黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進行性損失有關,該區(qū)域和其他大腦區(qū)域的神經(jīng)元產(chǎn)生含有聚集的α-突觸核蛋白的路易體[14],從而表現(xiàn)出相關癥狀。便秘是最常見的非運動PD癥狀,往往先于運動功能障礙發(fā)作數(shù)十年,這可能支持腸道血腦屏障的相關的假設[15]。腸道菌群的組成和豐度失調(diào)可同時影響腸神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),提示存在微生物-腸-腦軸,從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病?！澳c道菌群-腸-腦”軸相互作用機制涉及神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)遞質(zhì)、大腦神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子、短鏈脂肪酸、循環(huán)代謝產(chǎn)物、血腦屏障和氧化應激等多方面[16-18]。AX是在許多谷物中發(fā)現(xiàn)的非淀粉多糖,是目前公認的一種膳食纖維?，F(xiàn)有文獻表明[19],AX作為一種多糖,可能會影響腸道相關的微生物生長和免疫系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群已被認為是代謝綜合征發(fā)展的重要貢獻者。膳食纖維可通過調(diào)節(jié)腸道菌群和代謝終產(chǎn)物最終發(fā)揮有益作用[20]。AX能夠通過調(diào)整腸道菌群結構改善帕金森癥狀,在本研究中,通過AX混懸液灌胃干預后,能夠提高PD大鼠腸道微生物中厚壁菌門Firmicutes、梭菌綱Clostridia、毛螺菌科Lachnospiraceae的豐度。其中厚壁菌門的相對豐度與PD病人的認知障礙息息相關,Lachnospiraceae_UCG_004在PD病人中豐度降低并可能引起便秘,毛螺菌科的增加能夠抑制NF-κB的激活,從而抑制炎癥反應的發(fā)生而延緩神經(jīng)退行性過程[21]。

本實驗采用了AX干預PD大鼠發(fā)現(xiàn),AX組懸掛試驗中的懸掛時間進一步增加,同時可以使黑質(zhì)中α-SYN蛋白的表達降低,并且增加黑質(zhì)中TH蛋白的表達,起到延緩PD的多巴胺能神經(jīng)元神經(jīng)退化的作用。

綜上所述,AX可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的豐度及組成來改善PD的癥狀,其可能機制是使腸道菌群進行重建,促進腸道有益菌的增長,并且抑制有害菌的生長,從而改善腸道環(huán)境;通過“腸道菌群-腸-腦”軸作用到神經(jīng)系統(tǒng),與此同時腦內(nèi)黑質(zhì)α-SYN和TH蛋白含量發(fā)生改變起到保護神經(jīng)元細胞的作用,使得PD癥狀得到了改善,說明AX在PD的治療上有著很好的應用前景,或許未來其可用于治療PD。