MEBT/MEBO調(diào)控肌成纖維細(xì)胞促進糖尿病難愈合創(chuàng)面修復(fù)的機制研究

賀佐分,田馨如,龔元勛,黃金梅,楊雅量,葛星月,岑麗君,郭文聞,唐乾利,4

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,廣西 南寧 530023;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西 百色 533000;4. 廣西高校桂西地區(qū)高發(fā)病防治研究重點實驗室,廣西 百色 533000)

糖尿病難愈合創(chuàng)面是由糖尿病因素導(dǎo)致的常規(guī)治療1個月未見愈合及愈合傾向的創(chuàng)面,屬于慢性難愈合創(chuàng)面的主要類型[1]。創(chuàng)面的及時愈合依賴于傷口快速止血、適度的炎癥反應(yīng)、修復(fù)細(xì)胞增殖與分化及組織重塑這4個階段的有序運行,若發(fā)生紊亂將導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲[2]。成纖維細(xì)胞是重要的修復(fù)細(xì)胞,在創(chuàng)面增殖階段可分泌大量以COL-1為主的細(xì)胞外基質(zhì),覆蓋創(chuàng)面的同時也為后續(xù)的細(xì)胞活動提供必要的細(xì)胞外微環(huán)境[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)[5],肌成纖維細(xì)胞兼具收縮能力和分泌能力,主要由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,是分泌膠原蛋白最主要的執(zhí)行者。探討濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)是以濕潤燒傷膏為主要藥物并結(jié)合濕潤暴露療法治療慢性創(chuàng)面的有效手段。前期大量基礎(chǔ)實驗及臨床研究證明,MEBT/MEBO可通過減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)[6]、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白比例[3]、促進血管新生[7]等途徑加速創(chuàng)面愈合。為進一步明確MEBT/MEBO修復(fù)創(chuàng)面的分子機制,筆者構(gòu)建了大鼠糖尿病難愈合創(chuàng)面模型,探討了MEBT/MEBO可能通過提高α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ,COL-1)的蛋白表達水平,促進肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,從而加速糖尿病難愈合創(chuàng)面修復(fù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級成年雄性Wistar大鼠90只,12周齡,體重(235±15) g,購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(桂)2017-004。實驗過程嚴(yán)格遵守動物倫理標(biāo)準(zhǔn),倫理批準(zhǔn)文件編號:2021030901。

1.1.2主要試劑與儀器 魚躍血糖儀及血糖試紙(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司,貨號:SZ-98);美寶濕潤燒傷膏(60克/支,汕頭市美寶制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20000004);貝復(fù)新(重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠,21 000 IU:5g*1支/盒,珠海億勝生物制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字S20040001);鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司,貨號:S8050-1g);改良Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:G1346);4%多聚甲醛組織固定液(Biosharp公司,貨號:BL539A9);98%呋喃西林(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號:N114269-25g);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(飛凈生物科技有限公司,貨號:PH0516);兔源性α-SMA多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號:14395-1-AP);兔源性COL-1多克隆抗體(abcam公司,貨號:ab138492);蛋白marker(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G2083-250UL);山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:SA00001-2),山羊抗鼠二抗(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:SA00001-2);PVDF膜(美國Millipore公司,貨號:IPVH00010);電泳儀電源、WB成像分析儀(美國Bio-Rad公司,Gel Doc EZ)。

1.2實驗方法

1.2.1動物造模 綜合郝穎等[8]改良鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)大鼠糖尿病模型誘導(dǎo)法及陳楓等[9]大鼠品系與藥物劑量研究,建立糖尿病動物模型。Wistar大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后,禁食不禁水12 h,腹腔快速注射50 mg/kg劑量的1% STZ溶液(溶劑:pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液),注射3 d后以剪尾法采血測隨機血糖,血糖值>16.7 mmol/L認(rèn)為造模成功;血糖值未達標(biāo)大鼠待血糖恢復(fù)正常值后以前法再次造模。糖尿病模型建立完成后,參照趙京禹等[10]全層皮膚缺損法,結(jié)合沈道修等[11]改良塑料環(huán)肉芽腫定量法,經(jīng)改良后對成模大鼠進行創(chuàng)面制備,建立糖尿病大鼠難愈合創(chuàng)面模型。固定大鼠并暴露其背部,剃去大鼠創(chuàng)面制備區(qū)域毛發(fā),再涂抹適量脫毛膏脫凈殘余毛發(fā)后生理鹽水洗凈。待大鼠恢復(fù)24 h后,腹腔注射5%水合氯醛(劑量:250 mg/kg)進行麻醉,以直徑1.5 cm圓形印章標(biāo)記造模面積,無菌條件下沿脊椎方向用外科方法作兩個深達筋膜層的全層皮膚缺損開放性創(chuàng)面,加蓋兩層消毒干紗布,用膠布“工”字形固定。

1.2.2分組及用藥 90只SPF級成年雄性Wistar大鼠[12周齡,體重(235±15) g]適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,以隨機數(shù)表法分為空白組(18只)、對照組(18只)與糖尿病組(54只)。糖尿病組大鼠注射50 mg/kg STZ溶液造糖尿病模型;對照組大鼠注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。糖尿病造模完成后,統(tǒng)一制備創(chuàng)面,并隨機分為模型組、MEBO組、貝復(fù)新組(各組均為18只)。對照組大鼠制備創(chuàng)面同糖尿病組大鼠。空白組大鼠僅剃毛脫毛處理。各組創(chuàng)面制備完畢后立即用藥治療,換藥前均以1/5000呋喃西林液清潔創(chuàng)面,每日早晚各換藥1次?？瞻捉M:脫毛處備皮,覆蓋創(chuàng)面大小生理鹽水紗布,加蓋雙層干紗布,膠布固定;對照組和模型組:創(chuàng)面外敷兩層創(chuàng)面大小生理鹽水紗布,加蓋兩層消毒干紗布,膠布固定;MEBO組:創(chuàng)面外敷兩層創(chuàng)面大小MEBO紗條(0.2 g/cm2),加蓋兩層消毒干紗布,膠布固定;貝復(fù)新組:創(chuàng)面外敷兩層創(chuàng)面大小貝復(fù)新浸透紗布(60 IU/cm2),加蓋兩層消毒干紗布,膠布固定。

1.2.3取材 以創(chuàng)面制備完成當(dāng)天為第0天,于第3天、第7天、第14天每組隨機處死6只大鼠,小心揭去表面痂皮,剪取距離創(chuàng)緣0.5 cm內(nèi)深至深筋膜的創(chuàng)面肉芽組織,部分放入凍存管保存于-80 ℃冰箱,用于檢測蛋白表達水平;剩余部分浸沒于4%多聚甲醛組織固定液內(nèi),固定24～48 h后轉(zhuǎn)移至70%酒精,用于制作病理切片行病理學(xué)檢測。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1創(chuàng)面愈合情況 創(chuàng)面第0天、第3天、第7天、第14天各組隨機選取6只大鼠,麻醉狀態(tài)下以同等焦距垂直拍攝創(chuàng)面,ImageJ軟件測量創(chuàng)面面積并計算創(chuàng)面愈合率。計算公式:創(chuàng)面愈合率=(起始創(chuàng)面面積-取材時創(chuàng)面面積)/起始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2HE染色及Masson染色 創(chuàng)面肉芽組織固定24～48 h后轉(zhuǎn)移至70%酒精并保存在4 ℃冰箱,取出后流水沖洗0.5 h,經(jīng)脫水透明后包埋,統(tǒng)一制作成4 μm石蠟切片,最后分別行常規(guī)HE染色及Masson染色流程,光學(xué)顯微鏡下觀察各組創(chuàng)面肉芽組織病理形態(tài)變化并拍照記錄。

1.3.3免疫熒光 取已制備的石蠟切片脫蠟至水,以微波熱修復(fù)法修復(fù)抗原,隨后行封閉、一抗及二抗孵育等免疫熒光常規(guī)流程,熒光顯微鏡下觀察熒光染色情況并拍照記錄。

1.3.4免疫印跡 剪取部分保存在-80 ℃冰箱的創(chuàng)面肉芽組織,低溫勻漿后提取總蛋白,隨后BCA法蛋白定量并制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算各組蛋白上樣量;已提取的蛋白變性后上樣,進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后以α-SMA(1∶2000)、COL-1(1∶500)一抗4 ℃孵育過夜,第2天孵育二抗并顯影,ImageJ軟件分析條帶。

2 結(jié)果

2.1創(chuàng)面愈合率 創(chuàng)面第3天,各組間創(chuàng)面愈合率無明顯差異(P>0.05)。創(chuàng)面第7天、第14天,與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯降低(P<0.05);與模型組比較,MEBO組與貝復(fù)新組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯升高(P<0.05)。提示MEBO能夠顯著提高糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合率,見表1。

表1 不同時間點各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.2創(chuàng)面大體形態(tài)觀 各組大鼠創(chuàng)面隨治療進行而逐漸愈合,其中空白組皆為正常皮膚組織,不隨治療時間變化。創(chuàng)面第3天,模型組創(chuàng)面暗淡無澤、肉芽較少;對照組、MEBO組、貝復(fù)新組創(chuàng)面均呈現(xiàn)紅潤,部分肉芽組織新生。創(chuàng)面第7天,模型組創(chuàng)面晦暗干癟、存在黑色壞死組織,肉芽組織新生較少,創(chuàng)面床基底較單薄。對照組、MEBO組、貝復(fù)新組創(chuàng)面紅潤,存在大量肉芽組織,創(chuàng)面邊緣清晰。創(chuàng)面第14天,模型組創(chuàng)面色澤、肉芽新生較前有所改善,但創(chuàng)面較深且邊緣不清晰,創(chuàng)面表面干癟、凹凸不平,顏色不鮮紅,少量血痂存留。對照組創(chuàng)面幾乎被粉嫩的表皮完全覆蓋,并有毛發(fā)新生。MEBO組、貝復(fù)新組創(chuàng)面肉芽已將創(chuàng)面填平,肉芽邊緣覆蓋粉嫩表皮,未被表皮覆蓋的肉芽面積細(xì)小、色澤紅潤,見圖1。

2.3創(chuàng)面組織學(xué)觀察

2.3.1HE染色 空白組為正常皮膚結(jié)構(gòu)。創(chuàng)面第3天,各組均表現(xiàn)為明顯的炎性細(xì)胞浸潤,以模型組最甚,對照組和MEBO組可見少量新生毛細(xì)血管;創(chuàng)面第7天時,模型組仍存在明顯的炎性壞死帶,其余組炎癥較前明顯減輕,并有大量新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞;創(chuàng)面第14天,模型組有大量成纖維細(xì)胞生成伴少量炎癥細(xì)胞浸潤,其余各組上皮化均已完成,可見毛囊等正常皮膚結(jié)構(gòu),見圖2。

圖2 各組創(chuàng)面組織HE染色(×200)

2.3.2Masson染色 空白組為正常皮膚,可見明顯毛囊及皮脂腺結(jié)構(gòu)和大量粗大且分布整齊的膠原纖維。創(chuàng)面第3天,除模型組外均可見少量細(xì)小膠原纖維生成、分布稀疏;創(chuàng)面第7天,模型組膠原纖維含量較少、分布不均勻,且存在炎癥帶;其余各組膠原纖維數(shù)量增多,且逐漸變粗大,分布均勻。創(chuàng)面第14天,模型組僅可見少量且分布不均的膠原纖維;其余各組膠原纖維變粗、數(shù)量豐富,且分布緊密,走向愈加齊整,有表皮和毛囊新生,見圖3。

圖3 各組創(chuàng)面組織Masson 染色(×200)

2.4創(chuàng)面組織α-SMA、COL-1蛋白印跡檢測 與空白組比較,對照組創(chuàng)面組織α-SMA蛋白表達降低,COL-1蛋白第7天、第14天表達升高(P<0.05),創(chuàng)面發(fā)生第7天、第14天過程中,對照組創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白均呈緩慢升高趨勢,提示正常皮膚發(fā)生創(chuàng)面后,修復(fù)過程中α-SMA、COL-1蛋白發(fā)揮調(diào)控作用。與對照組比較,創(chuàng)面發(fā)生第7天、第14天過程中,模型組創(chuàng)面組織α-SMA、COL-1蛋白表達均明顯下降(P<0.05),且隨著創(chuàng)面發(fā)生時間變化,模型組創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白未見升高,甚至呈緩慢下降趨勢,提示糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中,創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白表達異常,影響創(chuàng)面愈合。與模型組比較,創(chuàng)面第7天、第14天,MEBO組創(chuàng)面組織α-SMA、COL-1表達顯著升高(P<0.05)。提示MEBO能夠提高糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中α-SMA、COL-1蛋白表達,見圖4、表2。

圖4 不同時間點各組大鼠α-SMA、COL-1蛋白表達比較

表2 不同時間點各組大鼠α-SMA、COL-1蛋白表達比較

2.5創(chuàng)面肉芽組織α-SMA、COL-1免疫熒光檢測 與對照組比較,創(chuàng)面發(fā)生第3天、第7天、第14天過程中,模型組α-SMA蛋白表達均較低,其中第7天時具有差異顯著性(P<0.05);同時,模型組COL-1蛋白表達均顯著偏低(P<0.05)。而MEBO組、貝復(fù)新組的蛋白表達與對照組較接近,高于模型組,與模型組比較,創(chuàng)面第3天MEBO組α-SMA表達與之尚未出現(xiàn)差別(P>0.05),貝復(fù)新組α-SMA表達稍低(P<0.05),而MEBO組、貝復(fù)新組的COL-1表達均較高(P<0.05);創(chuàng)面第7天、第14天,MEBO組、貝復(fù)新組創(chuàng)面肉芽組織α-SMA表達均顯著偏高(P<0.05),兩用藥組COL-1表達也較高,而貝復(fù)新組與模型組之間的比較差異顯著(P<0.05),MEBO組COL-1表達介于模型組與對照組之間,但與模型組的比較尚未存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。提示MEBO能夠提高糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中α-SMA、COL-1的表達,見圖5～圖8。

圖5 各組創(chuàng)面組織α-SMA表達情況(×400,

注:與同一時間點對照組相比,a:P<0.05,2a:P<0.01,3a:P<0.001;與同時間點模型組相比,b:P<0.05,2b:P<0.01,3b:P<0.001。

圖7 各組創(chuàng)面組織COL-1表達情況(×400,紅光為COL-1蛋白,藍光為細(xì)胞核)

注:與同一時間點對照組相比,a:P<0.05,2a:P<0.01,

3 討論

修復(fù)細(xì)胞缺失及功能障礙是糖尿病難愈合創(chuàng)面發(fā)生的重要機制,而成纖維細(xì)胞是重要的修復(fù)細(xì)胞,在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用。國內(nèi)外多項實驗研究顯示糖尿病難愈合創(chuàng)面修復(fù)障礙與成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化不足、肌成纖維細(xì)胞活性減弱、細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平低下以及傷口收縮能力下降密切相關(guān)[17-19]。故本研究通過觀察MEBT/MEBO對糖尿病難愈合創(chuàng)面中α-SMA、COL-1表達水平的影響,以此反映肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及細(xì)胞外基質(zhì)沉積水平,進一步探討MEBT/MEBO促進創(chuàng)面愈合的機制。

α-SMA是一種肌動蛋白亞型,在血管平滑肌細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中均可表達。研究顯示,在創(chuàng)面修復(fù)過程中,創(chuàng)面面積減小主要依靠基質(zhì)成纖維細(xì)胞向缺損處遷移、增殖、分化(肌成纖維細(xì)胞),逐漸與新生血管形成肉芽組織、結(jié)締組織等,以將缺損部位填補完整,促進表皮完成再上皮化。α-SMA蛋白是參與成纖維細(xì)胞遷移環(huán)節(jié)的關(guān)節(jié)因子,是肌成纖維細(xì)胞的典型骨架蛋白,能夠使肌成纖維細(xì)胞的收縮力增加,使肉芽組織纖維化,促進結(jié)締組織形成。創(chuàng)面愈合過程中,創(chuàng)面組織α-SMA的表達越高,說明創(chuàng)面細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞越顯著,肌成纖維細(xì)胞的活性越高,細(xì)胞向創(chuàng)面中心遷移增殖、收縮傷口面積越快[12]。但若肌成纖維細(xì)胞在修復(fù)后期過度活躍導(dǎo)致修復(fù)失衡,可能參與瘢痕形成[13]。

COL-1是一種纖維狀膠原蛋白,占人體膠原蛋白的90%,是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,為皮膚、結(jié)締組織等的主要結(jié)構(gòu),參與創(chuàng)面愈合。創(chuàng)面肌成纖維細(xì)胞可分泌COL-1為主的細(xì)胞外基質(zhì),為創(chuàng)面愈合提供適宜的微環(huán)境,通過COL-1纖維“軌跡”又可促進細(xì)胞遷移、相互作用,并促進再上皮化。因此,以COL-1為主的細(xì)胞外基質(zhì)與表達α-SMA的肌成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中相輔相成,共同參與創(chuàng)面收縮過程[13]。有研究發(fā)現(xiàn)[14],即使在膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)充足的情況下,如果缺乏活化的肌成纖維細(xì)胞,會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑受阻,肉芽組織收縮不足,從而引發(fā)再上皮化延遲和新生血管難以出芽并成熟的不良后果。因此,創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1表達的水平,反映了創(chuàng)面肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度及細(xì)胞外基質(zhì)沉積水平,對創(chuàng)面修復(fù)機制的研究至關(guān)重要。

糖尿病創(chuàng)面由于長期處于高血糖狀態(tài)下,高血糖環(huán)境會干擾各種細(xì)胞因子的表達,導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平失調(diào),放大低氧誘導(dǎo)的損傷,出現(xiàn)創(chuàng)面修復(fù)障礙[16]。研究發(fā)現(xiàn)[17-19],糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中,肌成纖維細(xì)胞的活性下降,從多個階段導(dǎo)致創(chuàng)面愈合過程受損。創(chuàng)面修復(fù)障礙與成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化不足、肌成纖維細(xì)胞活性減弱、細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平低下以及傷口收縮能力下降密切相關(guān)。本研究結(jié)果亦顯示,對照組正常皮膚創(chuàng)面組織修復(fù)過程中,α-SMA、COL-1蛋白表達緩慢上升,創(chuàng)面愈合穩(wěn)步進行;而與對照組比較,糖尿病創(chuàng)面模型組創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白表達均明顯下降,且隨著創(chuàng)面發(fā)生時間變化,模型組創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白未見升高,甚至呈緩慢下降趨勢,提示糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中,創(chuàng)面組織中α-SMA、COL-1蛋白表達異常,影響創(chuàng)面愈合。以上結(jié)果與文獻表述相同[17-19]。

MEBT/MEBO是以濕潤燒傷膏為主要藥物并結(jié)合濕潤暴露療法治療糖尿病創(chuàng)面的有效手段,可液化排出創(chuàng)面壞死組織,為創(chuàng)面持續(xù)營造生理性濕潤環(huán)境 , 改善創(chuàng)面局部微環(huán)境,加快創(chuàng)面組織再生修復(fù)。本研究結(jié)果顯示,糖尿病難愈合創(chuàng)面經(jīng)MEBT/MEBO治療后,相較于模型組,創(chuàng)面肉芽組織病理形態(tài)明顯改善,創(chuàng)面愈合率顯著升高,表明MEBT/MEBO能有效促進糖尿病難愈合創(chuàng)面的修復(fù),這與本課題組前期相關(guān)研究結(jié)果一致。根據(jù)蛋白免疫印跡和熒光檢測結(jié)果綜合觀察,與模型組相比,MEBO組治療第7天、第14天創(chuàng)面組織α-SMA表達顯著升高;治療第7天、第14天創(chuàng)面組織COL-1表達也較高,提示MEBO能夠顯著提高糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中α-SMA、COL-1蛋白表達,促進肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)膠原分泌,加速創(chuàng)面愈合。

綜上所述,糖尿病創(chuàng)面修復(fù)過程中,創(chuàng)面組織α-SMA、COL-1蛋白表達異常導(dǎo)致創(chuàng)面愈合障礙,MEBT/MEBO可能通過提高α-SMA和COL-1的蛋白表達水平,促進肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,從而加速糖尿病難愈合創(chuàng)面修復(fù)。