鴨跖草水提物對(duì)H.pylori的抑制作用及其機(jī)制研究

徐佳音,黃已桃,黃干榮,,覃艷春,,羅家錙,,黃亮,黃衍強(qiáng),

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 廣西病原微生物耐藥防控科技創(chuàng)新合作基地,廣西 百色 533000;4. 廣西高校耐藥微生物感染防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 百色 533000)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一種微需氧革蘭氏陰性菌,菌體呈螺旋桿狀,它與胃竇炎、消化性潰瘍、胃腺癌和MALT淋巴瘤的發(fā)生關(guān)系密切[1]。1994年H.pylori被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為胃癌的Ⅰ類致癌源,據(jù)統(tǒng)計(jì)[2],約有90%非賁門胃癌的發(fā)生與H.pylori的長(zhǎng)期感染有關(guān)。因三聯(lián)療法極易產(chǎn)生耐藥,所以目前臨床上用于根除H.pylori感染的首選治療方案為四聯(lián)療法(質(zhì)子泵抑制劑+鉍劑+2種抗生素),然而對(duì)于抗生素濫用產(chǎn)生的耐藥及患者嚴(yán)重的不良反應(yīng),是根除H.pylori失敗的主要原因[3],因此H.pylori耐藥形勢(shì)非常嚴(yán)峻,急需不易產(chǎn)生耐藥、療效好、毒副作用少的新藥物。

我國(guó)關(guān)于中藥及其提取物對(duì)H.pylori感染的治療有過許多報(bào)道,近年來有研究表明某些中藥如大黃、連翹等中藥及其提取物都對(duì)H.pylori有抑制或者殺滅的作用[4]。鴨跖草為鴨跖草科鴨跖草屬植物鴨跖草(commelina communis)的全草,中藥材鴨跖草具有清熱瀉火、解毒、利水消腫的功效[5]。對(duì)于鴨跖草的藥理研究很多,YOUN J Y等[6]發(fā)現(xiàn)鴨跖草具有抑制α-葡萄糖苷酶活性,即防止血糖上升的作用;BING F H等[7]發(fā)現(xiàn)鴨跖草具有抗流感病毒的活性。除此之外鴨跖草還具有抑菌、抗炎、抗氧化、治療前列腺肥大、治療先兆流產(chǎn)等多種藥理作用及臨床應(yīng)用,這可能與鴨跖草中的成分較多有關(guān)[8]。對(duì)于鴨跖草的抑菌作用,只有關(guān)于金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等細(xì)菌的藥敏檢測(cè),對(duì)H.pylori的抑制作用及其機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。本研究的目的為檢測(cè)鴨跖草水提物對(duì)H.pylori及非H.pylori的MIC,通過對(duì)其抑制H.pylori的機(jī)制探索,以期為后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 鴨跖草購(gòu)于瑞豐成中藥材,營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司,BS1002),營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司,BS1101),沙保液體培養(yǎng)基(上海普振生物有限公司,KLM221015),沙氏瓊脂培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司,HB0235),Columbia blood Agar base(OXOID,lot3484622),Brain Heart infusion(BHI)培養(yǎng)基(OXOID,lot3555372),小牛血清[平睿生物科技(北京)有限公司,lot20220922],電鏡固定液(Servicebio,G1102),無水乙醇(General Reagent,CAS64-17-5),克拉霉素(四川省旺林堂藥業(yè)有限公司,220601),阿爾瑪藍(lán)(北京索萊寶科技有限公司,A7631),PBS[生工生物工程(上海)股份有限公司,B040100-0005],RIPA裂解緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司,P0013B) ,蛋白酶抑制劑混合物(碧云天生物技術(shù)有限公司,P1005),RNA提取試劑盒(諾唯贊FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2,RC112-01),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Monad,MR05101M),qPCR試劑盒(Monad,MQ10301S),H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株(26695、G27)由南京醫(yī)科大學(xué)畢洪凱實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送,H.pylori臨床分離菌株(HPBS001～HPBS016)為本實(shí)驗(yàn)室分離,其余菌株均購(gòu)自廣東微生物保藏中心。

1.2鴨跖草水提物的制備 參考萬京華等[9]的提取方法準(zhǔn)確稱量鴨跖草500 g,用蒸餾水沖洗泥沙,加水浸泡30 min后,煎煮3次,第一次1 h、第二次45 min、第三次30 min。使用紗布過濾3次濾液,合并進(jìn)行濃縮,放入真空冷凍干燥機(jī)(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司,LGJ-10C)中,干燥完成后稱重,得鴨跖草水提物87.65 g,放-20 ℃冰箱密封備用。

1.3制備藥物固體瓊脂培養(yǎng)基 參考廖麗娟等[10]配制含藥培養(yǎng)基,根據(jù)培養(yǎng)基配制說明書,配制營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基、腦心浸液(加入10%小牛血清)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞培養(yǎng)基,稱量鴨跖草水提物將其加入已滅菌好的固體培養(yǎng)基中,設(shè)置100 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL 4個(gè)濃度的含藥培養(yǎng)基,待藥物完全溶解后,傾注平板。

1.4瓊脂稀釋法測(cè)定 MIC受試菌株(金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等)經(jīng)復(fù)蘇活化、培養(yǎng)后,用1.3中相應(yīng)的液體培養(yǎng)基制備成菌液,OD=0.3(相當(dāng)于1×108CFU/mL的菌液濃度),再稀釋為1×106CFU/mL,其中H.pylori菌株、空腸彎曲桿菌只需稀釋為1×107CFU/mL,而白色念球菌、熱帶假絲酵母菌、新生隱球菌需制備成濃度OD=0.5(相當(dāng)于5×106CFU/mL的菌液濃度),最終稀釋為1×103CFU/mL。取上述菌液各1 μL,接種到100 mg/mL、10 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL及未加藥對(duì)照組的瓊脂藥板上,將相應(yīng)劑量的液體培養(yǎng)基接種于含藥培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照,其中熱帶假絲酵母菌、新生隱球菌等真菌置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h,H.pylori菌株、空腸彎曲桿菌置于三氣培養(yǎng)箱中孵育72 h,其余置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,判斷實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),MIC為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5掃描電子顯微鏡標(biāo)本制備 將H.pyloriG27培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,菌液濃度制備為OD=0.3(相當(dāng)于1×108CFU/mL的菌液濃度),取8 mL加入鴨跖草水提物至工作濃度為10 mg/mL、0 mg/mL,兩者共孵育12 h、24 h,離心取沉淀并用電鏡固定液于4 ℃固定過夜,使用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水10 min,100%乙醇脫水2次,離心取沉淀進(jìn)行冷凍干燥,將樣品噴金并于掃描電子顯微鏡(北京中科科儀股份有限公司,KYKY-EM8100)觀察。

1.6鴨跖草水提物對(duì)H.pylori生物膜的作用 將G27培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,菌液濃度制備為OD=0.1(相當(dāng)于0.33×107CFU/mL的菌液濃度),加入0.5毫升/每孔至24孔平底培養(yǎng)板中(蛋白含量測(cè)定為0.2毫升/每孔至96孔平底培養(yǎng)板),在微需氧條件(85%氮?dú)狻?%氧氣、10%二氧化碳)下孵育3 d形成生物膜。加入鴨跖草水提物至工作濃度為200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL、0 mg/mL,克拉霉素作為陽性藥物對(duì)照,孵育24 h后吸出藥液,PBS洗生物膜2～3次后加入沒有藥物的腦心培養(yǎng)基0.3 mL。阿爾瑪藍(lán)實(shí)驗(yàn)為每孔加入30 μL阿爾瑪藍(lán),于微需氧條件下培養(yǎng)4 h觀察顏色變化。蛋白含量測(cè)定為每孔加入50 μL裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶EDTA=100∶1∶1),裂解30 min后使用BCA蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白測(cè)定并使用多功能酶標(biāo)儀(BioTek,America)進(jìn)行定量。

1.7RNA提取及qPCR實(shí)驗(yàn) 使用上述1.5的藥物與菌液共孵育方法,按照TNA提取試劑盒說明書提取菌體RNA,并于-80 ℃冰箱保存。然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,qPCR根據(jù)試劑盒說明書在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(Roche,LightCycler96)上進(jìn)行,95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃火延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。分析解離曲線以驗(yàn)證產(chǎn)物的均勻性。16S rRNA擴(kuò)增子用作內(nèi)部對(duì)照。通過相對(duì)定量2-△△Ct方法確定轉(zhuǎn)錄水平的變化。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1鴨跖草水提物的抑菌作用 鴨跖草水提物對(duì)H.pylori有很好的抑制效果,除對(duì)H.pyloriG27和H.pyloriHPBS006的MIC為100 mg/mL外,其余均為10 mg/mL,見表2。對(duì)于非H.pylori菌株如肺炎克雷伯菌、白色念球菌、大腸桿菌、新生隱球菌,鴨跖草水提物的MIC>100 mg/mL,對(duì)其余菌株均為100 mg/mL(除空腸彎曲桿菌為10 mg/mL),見表3。說明鴨跖草水提物在10 mg/mL就可以對(duì)H.pylori的菌株有專一的抑制作用。

表2 鴨跖草水提物對(duì)不同H.pylori的MIC

表3 鴨跖草水提物對(duì)非H.pylori菌株的MIC

2.2鴨跖草水提物對(duì)H.pylori形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 使用掃描電子顯微鏡觀察不同時(shí)間10 mg/mL濃度的鴨跖草水提物對(duì)H.pylori形態(tài)結(jié)構(gòu)(如鞭毛)的影響?？梢奝BS組的H.pylori形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯變化,而隨著時(shí)間的增加10 mg/mL鴨跖草水提物具有顯著的使H.pylori鞭毛減少及球變的作用,見圖1。

2.3鴨跖草水提物對(duì)H.pylori生物膜的抑制作用 阿爾瑪藍(lán)法檢測(cè)不同濃度鴨跖草水提物對(duì)H.pylori生物膜的抑制作用,孔內(nèi)顏色變化:藍(lán)色為抑制;粉色為無效;發(fā)現(xiàn)在鴨跖草水提物100 mg/mL可以有效抑制生物膜,50 mg/mL可以較好抑制生物膜,與陽性藥物克拉霉素顏色變化一致(見圖2A)。同時(shí),本研究檢測(cè)藥物作用后的生物膜蛋白含量,與PBS組相比,克拉霉素可以抑制30%的生物膜(P<0.001),200 mg/mL鴨跖草水提物可以抑制20%的生物膜(P<0.01),50 mg/mL鴨跖草水提物可以抑制10%的生物膜(P<0.05),呈濃度依賴性(見圖2B)。

圖1 鴨跖草水提物對(duì)H.pylori形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(20 000×)

注:A為阿爾瑪藍(lán)實(shí)驗(yàn)測(cè)定生物膜;B為生物膜蛋白含量測(cè)定。

2.4鴨跖草水提物可以下調(diào)鞭毛基因FlaA及生物膜基因SpoT基于以上結(jié)果,本研究針對(duì)鞭毛基因FlaA及生物膜基因SpoT的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行qPCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)H.pylori與100 mg/mL的鴨跖草水提物共孵育24 h后,與Control組相比,FlaA基因與SpoT基因均有一定程度的下調(diào)(P<0.05)。見圖3。

注:與Control組比較,*P<0.05。

3 討論

鴨跖草具有多種藥理作用,余昕等[11]發(fā)現(xiàn)鴨跖草的水提物相比于乙醇提取物抗炎效果更好,抗炎作用可能與其抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和抗氧化作用有關(guān),所以本研究采用了水提法來制備鴨跖草藥液使其具備更高的活性;在抗菌方面,有研究顯示,鴨跖草對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等具有很好的抑制作用[9,12],但卻未見鴨跖草抑制H.pylori的相關(guān)報(bào)道,本研究不僅針對(duì)以上菌株之外的12種非H.pylori菌株進(jìn)行了MIC的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鴨跖草水提物在100 mg/mL就可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng),具有很好的抑菌作用,這拓寬了鴨跖草的抗菌譜,除此之外,本研究還對(duì)16株H.pylori臨床菌株(5株敏感株、11株耐藥株)進(jìn)行了MIC的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鴨跖草水提物在10 mg/mL就可以抑制大部分H.pylori生長(zhǎng),甚至是耐藥H.pylori的生長(zhǎng),而對(duì)其他細(xì)菌無效,說明鴨跖草水提物在此濃度下對(duì)耐藥H.pylori的抑菌效果好,作用專一,不容易產(chǎn)生菌群失調(diào)等副作用。

鞭毛是H.pylori重要的結(jié)構(gòu),H.pylori有4～8根單極鞭毛[13],鞭毛可能會(huì)影響它們?cè)诩?xì)菌、炎癥和免疫逃避中的定植[14]。因此本研究使用掃描電子顯微鏡觀察鴨跖草水提物對(duì)H.pylori形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增大,H.pylori的表面出現(xiàn)了不同程度的凹陷、泄漏和球變,鞭毛數(shù)量隨著藥物作用時(shí)間的增加出現(xiàn)了一定程度的減少,有研究顯示H.pylori的這種類似于甜甜圈的球變可能與其細(xì)胞膜受損有關(guān)[15],因此鴨跖草水提物可能破壞了H.pylori的細(xì)胞膜,使其發(fā)生細(xì)胞質(zhì)的泄漏而加速死亡。FlaA和FlaB是鞭毛絲的組成部分,對(duì)鞭毛的運(yùn)動(dòng)有很重要的作用;敲除了FlaA和FlaB基因的菌株表現(xiàn)出不規(guī)則鞭毛的減少和較低的運(yùn)動(dòng)能力,其黏附定植能力明顯降低[16]。本研究發(fā)現(xiàn)鴨跖草水提物可以下調(diào)H.pyloriFlaA基因的表達(dá),進(jìn)而減少H.pylori在人體內(nèi)的定植,無法定植的H.pylori在胃內(nèi)游離更容易死亡,說明鴨跖草水提物抑制H.pylori的生長(zhǎng)可能與FlaA基因有關(guān)。

有研究表明,H.pylori的鞭毛可能在生物膜結(jié)構(gòu)形成過程中幫助其相互附著,并黏附在胃黏膜表面上[17],因此本次研究把研究的方向轉(zhuǎn)向了生物膜,生物膜是一種與附著表面關(guān)聯(lián)的被胞外多聚物(EPS)基質(zhì)包裹的微生物細(xì)胞的聚合體[18]。與細(xì)菌浮游生物相比,生物膜細(xì)胞往往更耐受抗生素和宿主免疫反應(yīng)[18-19]。有研究表明克拉霉素可以抑制H.pylori生物膜的形成[20],因此本研究使用克拉霉素作為陽性藥物對(duì)照,發(fā)現(xiàn)鴨跖草可以在50 mg/mL抑制H.pylori生物膜的生長(zhǎng),同時(shí)其生物膜蛋白含量也隨著藥物濃度增加而逐漸減少,這說明鴨跖草水提物對(duì)H.pylori形成的致密生物膜具有一定的破壞作用,這可能也與鴨跖草水提物同時(shí)減少H.pylori的鞭毛,進(jìn)而減少其生物膜的形成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室往期研究[21]發(fā)現(xiàn)中藥連翹中的成分連翹脂素可以抑制H.pylori生長(zhǎng)并下調(diào)H.pylori生物膜基因SpoT,本研究發(fā)現(xiàn),鴨跖草水提物也可以下調(diào)生物膜基因SpoT,抑制生物膜的形成,這可能也是H.pylori在藥物作用下無法長(zhǎng)期定植的關(guān)鍵原因之一。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于,盡管初步探索了鴨跖草水提物對(duì)H.pylori的抑菌作用及其作用機(jī)制,但未能闡明其具體抑菌機(jī)制;除此之外鴨跖草中還具有很多活性成分,因鴨跖草水提物未進(jìn)行提純,其具體的抑菌成分還需要后續(xù)更深入的研究。

綜上所述,鴨跖草水提物對(duì)H.pylori有很好的抑制作用,其抑菌作用機(jī)制可能與抑制SpoT基因及FlaA基因表達(dá)有關(guān)。因鴨跖草水提物只是粗提物,其中可以分離出的很多成分或許有更優(yōu)秀的抑菌作用,鴨跖草在未來的抗H.pylori道路上,具有很好的研究前景。