結(jié)核分枝桿菌DNA及RNA檢測(cè)在結(jié)核病中的診斷價(jià)值*

陳江燕,王 霖,馬志強(qiáng),王曉燕,毛紅艷,李瓊秀

(昆明市第三人民醫(yī)院/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心 檢驗(yàn)科,云南 昆明 650301)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculoss,MTB)感染引起的慢性傳染病[1],在全球22個(gè)結(jié)核病流行嚴(yán)重的國(guó)家中,我國(guó)疫情不容樂(lè)觀,其發(fā)病人數(shù)約為每年130萬(wàn)左右,占全球發(fā)病率的14.3%,位居第2位[2,3]。目前檢測(cè)結(jié)核菌的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng),但其培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜,且存在不同程度地準(zhǔn)確性較低、靈敏度差、周期長(zhǎng)、特異性不高等問(wèn)題[4,5]。因此需要一種簡(jiǎn)便快捷且靈敏度高、特異性強(qiáng)且能在臨床中廣泛普及的檢測(cè)技術(shù)為輔助臨床上結(jié)核病的早期診斷,對(duì)結(jié)核病患者的治療預(yù)防具有重要意義[6]。本研究回顧性分析了昆明市第三人民醫(yī)院診治的1168例結(jié)核病患者實(shí)驗(yàn)室資料,通過(guò)采用DNA和RNA實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù),探討結(jié)核菌DNA和RNA檢測(cè)在結(jié)核病中的診斷價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月-2021年6月于本院接收治療的結(jié)核病確診病例1168例,其中男性591例,女性577例;年齡7～88歲,中位年齡44(29,57)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)確診按照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS288-2017)[7];(2)經(jīng)結(jié)核菌痰涂片及痰培養(yǎng)檢查確診為結(jié)核病。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非結(jié)核菌病;(2)其它感染性及自身免疫性疾病;(3)合并重要器官疾病及嚴(yán)重高血壓患者等。

1.2 儀器與試劑 主要儀器

結(jié)核桿菌DNA和RNA檢測(cè)儀:天隆TL-988型;試劑:DNA檢測(cè)試劑:結(jié)核菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒熒光PCR法,RNA檢測(cè)的試劑:TB-SAT結(jié)核菌檢測(cè)試劑盒RNA恒溫?cái)U(kuò)增。

1.3 檢測(cè)方法

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè):將采集的患者標(biāo)本置于無(wú)菌容器內(nèi)密封送檢,按照實(shí)驗(yàn)室操作步驟進(jìn)行液化、核酸提取、PCR擴(kuò)增等反應(yīng)程序完成。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn):MTB-DNA陽(yáng)性判斷:FAM通道檢測(cè)Ct值≤38.0為陽(yáng)性,否則為陰性;MTB-RNA陽(yáng)性判斷:Ct值≤35為陽(yáng)性,35

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核菌DNA及RNA檢測(cè)情況

表1 結(jié)核菌DNA及RNA檢測(cè)情況[n(%)]

2.2 不同類型標(biāo)本DNA和RNA檢測(cè)情況

不同類型標(biāo)本中痰液DNA和RNA及DNA+RNA檢測(cè)陽(yáng)性最高,分別為335、170、142例,陽(yáng)性率分別為55.74%、57.24%、60.43%;腦脊液DNA和RNA及DNA+RNA檢測(cè)陽(yáng)性最低,分別為1、0、0例,陽(yáng)性率分別為0.17%、0%、0%;見(jiàn)表2、圖1。

表2 不同類型標(biāo)本DNA和RNA檢測(cè)陽(yáng)性情況[n(%)]

圖1 不同類型標(biāo)本MTB-DNA和MTB-RNA檢測(cè)陽(yáng)性情況

2.3 不同年齡標(biāo)本DNA 和RNA檢測(cè)情況

不同年齡組中,21～30歲組DNA檢測(cè)陽(yáng)性最高,為133例,陽(yáng)性率22.13%;41～50歲組RNA及DNA+RNA檢測(cè)陽(yáng)性最高,分別為67、62例,陽(yáng)性率分別為22.56%、25.96%;10≤歲組DNA和RNA及DNA+RNA檢測(cè)陽(yáng)性最低,分別為4、2、2例,陽(yáng)性率分別為0.67%、0.66%、0.85%,見(jiàn)表3。

表3 不同年齡標(biāo)本DNA和RNA檢測(cè)陽(yáng)性情況[n(%)]

圖2 不同年齡標(biāo)本MTB-DNA和MTB-RNA檢測(cè)陽(yáng)性情況

3 討論

目前診斷結(jié)核病的方法有影像學(xué)檢查、細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)等,結(jié)核病確診的金標(biāo)準(zhǔn)是痰液中檢出結(jié)核菌。結(jié)核病發(fā)病率較高,但其發(fā)現(xiàn)率卻僅有40%左右,對(duì)于結(jié)核患者的快速診斷是結(jié)核防控的重要措施,而常規(guī)檢測(cè)很難達(dá)到快速診斷的效果[8]。近年來(lái),熒光定量PCR技術(shù)因其快速、高效的診斷被逐漸應(yīng)用到結(jié)核的檢測(cè)中,其可間接檢出痰液標(biāo)本中結(jié)核菌含量,也能鑒別結(jié)核菌和非結(jié)核菌,因此得到了大量普及。同時(shí)恒溫?cái)U(kuò)增(SAT)技術(shù)檢測(cè)不僅檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核菌存在情況,還能鑒定結(jié)核菌活性,因此可用于活動(dòng)性肺結(jié)核的檢測(cè)及診斷[9,10]。

本研究通過(guò)對(duì)1168例研究對(duì)象標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌DNA檢測(cè)陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于RNA檢測(cè),可能是因?yàn)镈NA雙鏈較RNA單鏈穩(wěn)定,不易被降解,同時(shí)在RNA恒溫?cái)U(kuò)增中RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)多聚酶等作用又形成新的RNA,雖然兩種檢測(cè)的狀態(tài)同樣一直持續(xù)進(jìn)行,但RNA存在于活的結(jié)核菌中,這也可能是其陽(yáng)性率低于DNA檢測(cè)的原因[11,12]。在不同類型的標(biāo)本中,痰液檢出率較最高,這也與以往的研究結(jié)果相一致[6]。本研究結(jié)果還顯示,結(jié)核菌DNA檢測(cè)陽(yáng)性率女性高于男性,可能的原因有結(jié)核病發(fā)病率的差異在不同性別中可能與傳播動(dòng)力學(xué)的因素有關(guān),且細(xì)胞免疫、糖皮質(zhì)激素、社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素和文化因素等方面的差異可能都與其有一定的相關(guān)性[13]。在不同年齡段中中青年組DNA和RNA陽(yáng)性檢出比例最高、最常見(jiàn),這可能與青年的免疫功能狀態(tài)有關(guān),也可能與青年發(fā)病時(shí)易出現(xiàn)菌血癥或血行播散性結(jié)核病有關(guān)。

綜上所述,結(jié)核菌DNA和RNA檢測(cè)在結(jié)核病患者的不同類型標(biāo)本和各年齡段的檢出率均有差異,對(duì)患者結(jié)核菌檢測(cè)方法及標(biāo)本的選擇有參考價(jià)值,減少誤診和漏檢,可推廣應(yīng)用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷工作中。