王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)對(duì)西方蜜蜂蜂王質(zhì)量的影響

黎長(zhǎng)龍，劉一博，王守程，何旭江，2*，劉光楠，袁 芳

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物學(xué)與飼養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；3.江西省石城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西 贛州 342700；4.江西省養(yǎng)蜂研究所，江西 南昌 330052）

【研究意義】蜜蜂是重要的授粉昆蟲，為全球85%以上農(nóng)作物授粉，在維護(hù)生態(tài)平衡和糧食安全方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。同時(shí)，蜜蜂也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，為人類提供營(yíng)養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品[4]。然而，2006年以來全球各大洲均出現(xiàn)“蜂群衰竭失調(diào)癥（Colony collapse disorder，CCD）”，導(dǎo)致大量蜜蜂離奇死亡，其中蜂王質(zhì)量下降是主要因素之一[5-6]。近年來，蜜蜂又面臨著過冬時(shí)期高死亡率的問題。北美地區(qū)蜂群數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，其冬季損失率已經(jīng)高達(dá)48%[7]。我國(guó)雖然沒有出現(xiàn)CCD 和越冬蜂高死亡率現(xiàn)象，但蜂王質(zhì)量也有不斷下降的跡象。如今，殺蟲劑、氣候變化以及寄生蟲和疾病的傳播等，也威脅著蜜蜂的生存與繁衍[8]。因此，如何提高蜂王質(zhì)量，提升蜂群的生存與繁衍能力已成為養(yǎng)蜂業(yè)的焦點(diǎn)問題。培育優(yōu)質(zhì)的蜂王對(duì)養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展具有重要意義。正鑒于此，本研究通過開發(fā)并應(yīng)用王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)蜂王，并對(duì)該技術(shù)所培育蜂王的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估?！狙芯窟M(jìn)展】蜜蜂蜂王專職產(chǎn)卵，它是蜂群中唯一生殖器官發(fā)育完全的具有繁育能力的雌性個(gè)體，是整個(gè)蜂群的核心，在蜂群發(fā)展中具有決定性的作用[9-10]。而前人研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂群勢(shì)的強(qiáng)弱除了受外界環(huán)境條件影響，蜂王質(zhì)量的優(yōu)劣也會(huì)對(duì)蜂群產(chǎn)生重要影響[11-12]。蜂王質(zhì)量的高低對(duì)蜂群的生長(zhǎng)與發(fā)展非常重要，它決定了后代蜂群的生存能力、免疫能力，以及蜂群的產(chǎn)量和蜂產(chǎn)品質(zhì)量[13]。從1568 年Nickel Jacob 利用自然王臺(tái)成功育王，到1888 年Doolittle[14]總結(jié)育王經(jīng)驗(yàn)并著《科學(xué)育王法》，蜜蜂人工移蟲育王技術(shù)在全球范圍內(nèi)得到廣泛傳播與應(yīng)用。這種傳統(tǒng)的育王方式是利用移蟲針移取工蜂巢房中的小幼蟲（1～2 d）至王臺(tái)培育蜂王。然而，有研究表明，蜂王漿所含成分如糖類、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸等方面均與工蜂漿不同，且蜂王幼蟲比工蜂幼蟲獲得更多的食物[15-20]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，利用工蜂巢房卵所培育的F2 蜂王質(zhì)量顯著高于人工移蟲育王所培育的F2 蜂王，且與發(fā)育、繁殖與免疫相關(guān)基因的甲基化水平會(huì)發(fā)生明顯改變[21]。易瑤等[22]報(bào)道了人工移蟲育王不僅會(huì)降低蜂王質(zhì)量，其引起的甲基化變化還可以累代遺傳。最新研究表明，蜜蜂蜂王會(huì)在王臺(tái)中產(chǎn)更大更優(yōu)質(zhì)的卵，所培育的蜂王初生重等指標(biāo)也顯著高于工蜂巢房卵和工蜂幼蟲培育的蜂王[23]。本團(tuán)隊(duì)前期基于蜂王在王臺(tái)中產(chǎn)更大更優(yōu)卵的生物學(xué)特性，研發(fā)了蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)及設(shè)備[24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蜜蜂的育王方式不同對(duì)蜂王發(fā)育和質(zhì)量的影響也不同，從而影響整個(gè)蜂群的生長(zhǎng)與繁衍。某些蜜蜂育王技術(shù)，例如通過人工移取工蜂巢房幼蟲的方式培育蜂王，會(huì)顯著降低蜂王的質(zhì)量[21-22]。與此同時(shí)，通過檢測(cè)蜂王的形態(tài)指標(biāo)、卵巢管數(shù)等生理指標(biāo)和關(guān)鍵基因表達(dá)等分子指標(biāo)來評(píng)估蜂王的質(zhì)量，可較好地評(píng)估蜜蜂育王技術(shù)的優(yōu)劣性。本團(tuán)隊(duì)前期研發(fā)了蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)，但尚未對(duì)該技術(shù)所培育的蜂王質(zhì)量水平進(jìn)行有效評(píng)估?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究擬利用形態(tài)學(xué)分析、組織切片技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 技術(shù)，比較分析蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王和人工移蟲育王技術(shù)所培育蜂王的發(fā)育水平、繁殖性能和免疫能力等方面進(jìn)行評(píng)估，為該技術(shù)在蜜蜂優(yōu)質(zhì)育種中的應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)，在保護(hù)蜜蜂這種重要的授粉昆蟲和促進(jìn)養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蜂群

本研究共選取了6 群群勢(shì)較強(qiáng)（10 足脾）的西方蜜蜂（Apis mellifera），均來自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所的飼養(yǎng)蜂群。

1.2 試驗(yàn)器材與試劑

1.2.1 試驗(yàn)主要器材 DHI 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（中國(guó)上海埃開儀器設(shè)備有限公司），ME204 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），WSI 型蜜蜂形態(tài)指標(biāo)測(cè)定系統(tǒng)（中國(guó)重慶奧特光學(xué)儀器有限公司），OPTPro 型體式顯微鏡（中國(guó)重慶奧特光學(xué)儀器有限公司），TP1020 型自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)徠卡公司），HistoCore Arcadia H 型包埋機(jī)（德國(guó)徠卡公司），HistoCore Arcadia C 型冷凝機(jī)（德國(guó)徠卡公司），Model RM2245 型石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），KD-H 型攤片機(jī)（中國(guó)浙江科迪儀器設(shè)備有限公司），KD-P 型烘片機(jī)（中國(guó)浙江科迪儀器設(shè)備有限公司），Autostainer XL 染色器具（德國(guó)徠卡公司），DP80 型顯微鏡（中國(guó)奧林巴斯有限公司），AG R404A 型離心機(jī)（德國(guó)艾本德生命科技公司），T100 型反轉(zhuǎn)錄儀器（美國(guó)伯樂公司），QuantStudio⑤型qRT-PCR 儀器（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），蠟盤，解剖針，手術(shù)剪，尖口鑷子，鐵質(zhì)、塑料包埋盒，載玻片與蓋玻片，中性樹脂，載玻片和蓋玻片，計(jì)數(shù)器，移液槍，滅菌槍頭，96 孔熒光定量板以及封口膜等。

1.2.2 試驗(yàn)試劑 4%多聚甲醛固定液，無水乙醇，二甲苯，石蠟，伊紅染液，蘇木精染液，R6734 型RNA 提取試劑盒（美國(guó)Omega公司），巰基乙醇，RR047A反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），RR420A型熒光定量試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

圖1 王臺(tái)產(chǎn)卵育王設(shè)備與蜂王全景圖Fig.1 The physical panorama of queen and queen-cell egg laying device

1.3 王臺(tái)產(chǎn)卵育王設(shè)備

采用本團(tuán)隊(duì)前期研發(fā)的蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)及方法進(jìn)行優(yōu)質(zhì)蜂王培育試驗(yàn)[24]。

1.4 育王方式

1.4.1 王臺(tái)產(chǎn)卵育王 參考袁芳等[25]試驗(yàn)方法，先將產(chǎn)卵器與王臺(tái)等噴灑50%糖水，放入蜂群中清理1 d。然后把蜂王關(guān)入產(chǎn)卵器，控制在王臺(tái)區(qū)域產(chǎn)卵。待F1蜂王在王臺(tái)內(nèi)產(chǎn)卵后，將王臺(tái)轉(zhuǎn)移至育王框上，放入已調(diào)整出哺育區(qū)域的繼箱中培育F2 蜂王。記錄王臺(tái)產(chǎn)卵率。產(chǎn)卵率=產(chǎn)卵數(shù)/王臺(tái)總數(shù)×100%；幼蟲接受率=幼蟲存活數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%；出房率=處女王出房數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 人工移蟲育王 參考龐倩等[26]試驗(yàn)方法，以2 日齡（孵化后48 h）的工蜂幼蟲作移蟲育王，移入和王臺(tái)產(chǎn)卵育王相同的王臺(tái)，并與王臺(tái)產(chǎn)卵育王的王臺(tái)放置在一起培育F2蜂王，以此作對(duì)照組。

1.5 蜂王數(shù)據(jù)測(cè)定

1.5.1 初生質(zhì)量的測(cè)定 蜂王出房后會(huì)因進(jìn)食和水分喪失等出現(xiàn)體質(zhì)量變化，且蜂群內(nèi)蜂王出房時(shí)為方便取樣與測(cè)取數(shù)據(jù)，所以試驗(yàn)時(shí)在蜂王出房的前一天，將育王框或封蓋王臺(tái)等，轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕培養(yǎng)箱。每隔30 min觀察F2 蜂王出房情況，在F2蜂王出房半小時(shí)內(nèi)利用分析天平稱取蜂王初生質(zhì)量。試驗(yàn)組和對(duì)照組各測(cè)定8只F2蜂王。

1.5.2 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 參考Reeves 等[27]試驗(yàn)方法，利用蜜蜂形態(tài)指標(biāo)測(cè)定系統(tǒng)分別測(cè)定兩種F2 蜂王前翅長(zhǎng)和前翅寬、后翅長(zhǎng)和后翅寬、胸長(zhǎng)和胸寬等形態(tài)指標(biāo)。兩組蜂王個(gè)體形態(tài)和卵巢切片樣品測(cè)定各含8個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 卵巢切片、染色及觀察計(jì)數(shù)

參考改進(jìn)甘海燕等[28]，陳品素等[29]，盧鳳蘭等[30]試驗(yàn)方法，取材：F2 蜂王出房并培育3 d 后（卵巢發(fā)育較好），解剖顯微鏡下進(jìn)行解剖，取其腹部，并除去卵巢之外的消化道、中腸以及蜜囊等。

固定：將蜂王軀體裝入盛有1 mL 4%多聚甲醛固定液的1.5 mL EP 管內(nèi)，常溫狀態(tài)下4 h 或者4 ℃狀態(tài)下12 h。經(jīng)此固定后，蜂王卵巢表現(xiàn)為聚攏狀，借助尖鑷能穩(wěn)定取出。根據(jù)Jackson[31]關(guān)于蜜蜂卵巢管數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，將右側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移至塑料包埋盒中。為防止卵巢在下一個(gè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)中從塑料包埋盒漏出，在卵巢外周裹一層紗布，保護(hù)卵巢不丟失，脫水時(shí)的蠟液也能透入包埋盒。

脫水：將處理好的塑料包埋盒放置在自動(dòng)組織脫水機(jī)內(nèi)，進(jìn)行脫水處理。

包埋：經(jīng)自動(dòng)組織脫水機(jī)處理后的卵巢，轉(zhuǎn)移至包埋機(jī)。將卵巢垂直包埋在鐵質(zhì)包埋盒中，以獲得清晰的卵巢管橫截面。蓋上塑料包埋盒另一半（底部），然后迅速放入冷凍機(jī)中進(jìn)行冷凝。待溫度降下之后，分離塑料包埋盒底座與鐵質(zhì)包埋盒，此時(shí)的包埋樣品可放置在4 ℃冰箱保存。

切片：石蠟組織塊安置在切片機(jī)上，調(diào)整刀片角度以及刀片與蠟塊的距離，切取7～9 μm 的切片。然后用鑷子夾取切片，正面平鋪在40 ℃的攤片機(jī)水面中進(jìn)行加溫?cái)偲?，使切片完全展開。直至切取到在顯微鏡下能清晰見到卵巢管的切片，而后在42 ℃的烘干機(jī)中烘干3 h。

染色并封片：烘干后帶有卵巢切片的載玻片，經(jīng)過HE染色程序處理。取出載玻片，并滴樹脂進(jìn)行蓋玻片封片，以防止二甲苯揮發(fā)導(dǎo)致切片組織顏色變黑。

封片在通風(fēng)機(jī)下通風(fēng)1 d，并靜置3 d后，在顯微鏡下觀察F2蜂王右側(cè)卵巢形態(tài)組織并拍照計(jì)數(shù)。

1.7 基因水平檢測(cè)

1.7.1 RNA 提取 參考Deng 等[32]試驗(yàn)方法，取兩種F2 蜂王的頭部。分別放入EP 管，每管1 個(gè)頭，放入液氮迅速冷凍處理和保存。兩組蜂王各含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。根據(jù)Omega 公司的RNA 提取試劑盒指導(dǎo)方法提取樣品總RNA：每管樣品加入350 μL 的GTC-buffer（1 mL 的buffer 中加入20 μL 的巰基乙醇），研磨搗碎，勻漿。將DNA結(jié)合柱套入2 mL離心管中，把裂解液轉(zhuǎn)移到柱子，13 000 r/min離心1 min，濾液用于RNA 提取。向?yàn)V液中加入0.5 倍體積的無水乙醇，渦旋15 s 混勻，然后轉(zhuǎn)移到RNA 結(jié)合柱的管中，13 000 r/min 離心1 min。再將結(jié)合柱套入新的收集管，加入500 μL 的RNA Wash BufferⅠ，13 000 r/min離心1 min，棄濾液。結(jié)合柱重新套回收集管，加入500 μL 的RNA Wash Buffer Ⅱ，13 000 r/min 離心1 min，棄濾液，然后重復(fù)此步驟1 次。RNA 結(jié)合柱套回收集管，14 000 r/min 離心空甩柱子2 min。將RNA 結(jié)合柱套入新的1.5 mL 離心管中，加入40 μL 提前水浴加熱至70 ℃的DEPC-treated water，室溫孵育5 min。室溫下離心1 min，然后將離心下去的DEPC-treated water 吸取上來并打回結(jié)合柱，重復(fù)洗脫，提高RNA提取產(chǎn)量，獲得樣品總RNA。

1.7.2 反轉(zhuǎn)錄 參考Deng等[33]試驗(yàn)方法，選用Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，并建立20 μL 體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。先去除基因組DNA反應(yīng)1（42 ℃，2 min；表1），在冰上配制以下反應(yīng)混合液，加入RNA樣品。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2（37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；表1），同樣在冰上配制以下反應(yīng)混合液，加樣然后按照反應(yīng)條件進(jìn)行即可獲得cDNA。

表1 反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)的反應(yīng)液體系Tab.1 Reaction fluid system for reverse transcription experiments

1.7.3 基因引物設(shè)計(jì)選取 根據(jù)參考文獻(xiàn)[34-38]選取Antimicrobial peptide gene defensin-1（Defensin1）、Juvenile hormone acid methyltransferase（Jhamt）、Honey bee hexamerin110（Hex110）和Cytochrome P450 monooxygenase（CYP）家族中的CYP9Q1。Defensin1基因反映蜜蜂的免疫能力[34]，Jhamt基因被證實(shí)與蜂王的級(jí)型分化有關(guān)[35]，Hex110基因影響蜂王的卵巢發(fā)育[36]，CYP9Q1基因則關(guān)系到蜜蜂解毒性能[37-38]。因此試驗(yàn)選擇這4 種基因進(jìn)行熒光定量分析。在NCBI 上查詢相關(guān)基因編號(hào)和基因序列，各基因編號(hào)分別為Defensin1：LOC 406143；Jhamt：LOC 724216；Hex110：LOC 551648；CYP9Q1：LOC410492。以GAPDH（LOC410122）為內(nèi)參基因，在Primer 5 軟件上設(shè)計(jì)引物序列（表2），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的各基因引物信息Tab.2 Primer sequences of each gene in quantitative real-time PCR

1.7.4 qRT-PCR 反應(yīng)條件 熒光定量反應(yīng)體系如表3所示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性2 min，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)40 次；72 ℃終延伸10 min。RT-qPCR 試驗(yàn)每組樣品含7 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并且每個(gè)cDNA樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR的反應(yīng)液體系Tab.3 Reaction fluid system in quantitative real-time PCR

1.8 數(shù)據(jù)處理

基因相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算，其中Defensin1、Jhamt、Hex110和CYP9Q1作為目的基因，GAPDH為內(nèi)參基因。相對(duì)表達(dá)量以及卵巢管數(shù)等各項(xiàng)測(cè)定數(shù)據(jù)在檢驗(yàn)其為正態(tài)分布后，采用STATVIEW分析軟件中的ANOVA分析和Fisher’s PLSD方法檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 王臺(tái)產(chǎn)卵育王與人工移蟲育王的幼蟲接受率與出房率

表4表明，蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王的蜂王接受率隨幼蟲日齡的增長(zhǎng)而下降。王臺(tái)產(chǎn)卵育王的幼蟲接受率與處女王出房率均顯著低于人工移蟲育王（P＜0.05）。

表4 王臺(tái)產(chǎn)卵與人工移蟲育王的王臺(tái)幼蟲接受率與出房率Tab.4 The acceptance and emerging rates of queen cells from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.2 王臺(tái)產(chǎn)卵育王與人工移蟲育王方式蜂王的初生重比較

圖2 表明，利用蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王所培育的F2 蜂王初生質(zhì)量（249.03±19.02）g 顯著高于人工移蟲育王（221.76±18.59）g的蜂王（P＜0.05）。

圖2 王臺(tái)產(chǎn)卵與人工移蟲育王蜂王的初生重比較Fig.2 Comparison of newborn weight of queens from the queen-cell egg laying and 2d worker larva-grafting

2.3 王臺(tái)產(chǎn)卵育王與人工移蟲育王方式蜂王的形態(tài)指標(biāo)比較

圖3所示，王臺(tái)產(chǎn)卵育王F2代蜂王的前翅長(zhǎng)和后翅長(zhǎng)顯著長(zhǎng)于人工移蟲育王F2代蜂王（P＜0.05），而前翅寬、后翅寬、胸長(zhǎng)和胸寬則沒有顯著差異（P≥0.05）。

圖3 王臺(tái)產(chǎn)卵與人工移蟲育王蜂王的形態(tài)指標(biāo)比較Fig.3 Comparison of morphological indexes of newly emerged queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.4 王臺(tái)產(chǎn)卵育王與人工移蟲育王的卵巢管數(shù)比較

圖4所示，王臺(tái)產(chǎn)卵育王的F2代蜂王右側(cè)卵巢的卵巢管數(shù)（164.80±12.70）顯著高于人工移蟲育王的F2代蜂王（137.25±13.35，P＜0.05）。

圖4 王臺(tái)產(chǎn)卵與人工移蟲育王蜂王的右卵巢管數(shù)比較Fig.4 The ovariole number（right side ovary）of queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

2.5 王臺(tái)產(chǎn)卵育王與人工移蟲育王蜂王的4種基因表達(dá)量比較

圖5 所示，Defensin1、Jhamt與Hex110基因在王臺(tái)產(chǎn)卵育王F2 代蜂王的表達(dá)量顯著高于人工移蟲育王F2代蜂王（P＜0.05），而CYP9Q1基因表達(dá)量則差異不顯著（P≥0.05）。

圖5 王臺(tái)產(chǎn)卵與人工移蟲育王蜂王的4種基因表達(dá)量比較Fig.5 The expression of four genes in queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting

3 討論與總結(jié)

蜂王是影響蜜蜂蜂群生產(chǎn)的首要因素，在養(yǎng)蜂業(yè)中起重要作用[39]。尤其是在全球蜜蜂面臨著疾病、寄生蟲、環(huán)境污染等諸多挑戰(zhàn)的情況下[5-6,8]，如何培育出高質(zhì)量的蜂王顯得尤為重要。本研究在前期開發(fā)的蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)所培育蜂王的個(gè)體發(fā)育、繁殖性能和免疫能力等方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析。結(jié)果表明，蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵技術(shù)培育的蜂王初生重、前翅長(zhǎng)和后翅長(zhǎng)均顯著高于人工移蟲育王技術(shù)培育的蜂王（圖2、圖3），王臺(tái)產(chǎn)卵育王蜂王右側(cè)卵巢的卵巢管數(shù)顯著多于人工移蟲育王蜂王（圖4）。這是因?yàn)槊鄯涞哪阁w效應(yīng)，王臺(tái)中的卵含有更豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于蜂王幼蟲的發(fā)育成長(zhǎng)[22-23]。蜂王卵巢管數(shù)是評(píng)價(jià)蜂王生殖能力的一個(gè)重要指標(biāo)，卵巢管數(shù)目越多，則越有利于其性成熟，增加產(chǎn)卵數(shù)量，同時(shí)也會(huì)使封蓋子脾面積增大[40]。因此，采用蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)可以顯著地改善蜂王的個(gè)體發(fā)育和生殖性能。

此外，Defensin1基因是反映蜜蜂免疫能力的關(guān)鍵基因，其多肽可以對(duì)抗革蘭氏陽性細(xì)菌感染[34]。結(jié)果顯示，人工移蟲育王培養(yǎng)的蜂王中，Defensin1基因的表達(dá)水平相對(duì)較低，而在王臺(tái)產(chǎn)卵育王的F2 蜂王中，該基因的表達(dá)水平相對(duì)高，表明王臺(tái)產(chǎn)卵育王F2 蜂王的免疫功能更加強(qiáng)大，防御系統(tǒng)更加完善。Jhamt基因則被證實(shí)與蜂王的級(jí)型分化有關(guān)，它的主要作用是防止變態(tài)發(fā)育和調(diào)節(jié)生殖成熟[35]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Jhamt基因表達(dá)量在王臺(tái)產(chǎn)卵育王的F2 蜂王中含量更高，證明其細(xì)胞分化機(jī)理更成熟。而Hex110基因主要作用是儲(chǔ)備幼蟲向成蟲發(fā)育時(shí)所需的氨基酸物質(zhì)，前人研究證實(shí)該基因家族是影響蜂王卵巢發(fā)育的關(guān)鍵基因[36]。而本研究的結(jié)果表明王臺(tái)產(chǎn)卵育王F2代蜂王具有比對(duì)照組蜂王更多的卵巢管數(shù)，這極可能與其體內(nèi)高表達(dá)的Hex110等關(guān)鍵基因相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)參與蜜蜂解毒相關(guān)功能的CYP9Q1基因[37-38]則未出現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，說明王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)對(duì)蜂王解毒相關(guān)的能力可能沒有潛在影響。總之，本研究發(fā)現(xiàn)3 個(gè)關(guān)鍵基因（Defensin1、Jhamt、Hex110）在王臺(tái)產(chǎn)卵育王的蜂王體內(nèi)表達(dá)顯著高于人工移蟲育王培育的蜂王（圖5），表明王臺(tái)產(chǎn)卵育王技術(shù)培育的蜂王在個(gè)體發(fā)育、生產(chǎn)性能及其免疫能力等方面，均優(yōu)于人工移蟲育王。

然而，蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王的接受率顯著低于人工移蟲育王（表4）。這可能與蜂王的產(chǎn)卵特性有關(guān)。蜂王在繁殖季節(jié)在自然王臺(tái)中產(chǎn)約10～20 個(gè)受精卵，培育后代蜂王[41]。本研究中，蜂王在塑料王臺(tái)中產(chǎn)卵欲望較低，且王臺(tái)中產(chǎn)受精卵的數(shù)量極可能會(huì)受到蜂群限制。同時(shí)，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，季節(jié)對(duì)蜂王的王臺(tái)產(chǎn)卵特性也有較大的影響。因此，蜂王在王臺(tái)中產(chǎn)卵的內(nèi)在機(jī)制與生物學(xué)特性仍需進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而提高蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵育王的接受率。

利用先進(jìn)的方法培育優(yōu)質(zhì)蜂王是促進(jìn)蜂群健康和養(yǎng)蜂業(yè)發(fā)展的重要保證。然而，沿用了上百年的人工移蟲育王技術(shù)不斷地降低蜂王的質(zhì)量，逐漸暴露出了各種弊端，對(duì)蜜蜂這一重要的授粉昆蟲的生存與繁衍帶來諸多不利影響[21-22]。本團(tuán)隊(duì)研發(fā)的蜜蜂王臺(tái)產(chǎn)卵技術(shù)充分利用了蜜蜂的母體效應(yīng)對(duì)蜂王發(fā)育的促進(jìn)作用。利用王臺(tái)中高質(zhì)量的受精卵培育蜂王可顯著提高蜂王的質(zhì)量，其個(gè)體發(fā)育水平、繁殖性能和免疫力等均顯著優(yōu)于人工移蟲育王所培育的蜂王。為培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病力強(qiáng)的高質(zhì)量蜂王提供了技術(shù)支持。如能長(zhǎng)期利用該技術(shù)進(jìn)行優(yōu)質(zhì)蜂王的培育，將可扭轉(zhuǎn)人工移蟲育王對(duì)蜜蜂帶來的不利影響，從而不斷促進(jìn)蜜蜂蜂群的健康與發(fā)展。該育王技術(shù)可廣泛應(yīng)用于蜜蜂育種與生產(chǎn)領(lǐng)域，不斷提高蜂群的生存與繁衍能力，以及抵御諸多環(huán)境挑戰(zhàn)的能力，為促進(jìn)養(yǎng)蜂業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持，同時(shí)在保護(hù)和利用蜜蜂這一寶貴的資源方面具有重要意義。