分心木水提物對大鼠慢性非細菌性前列腺炎的作用

劉 蓉,張 偉,陳雪潔,肖朝江,沈 磊,田新雁,姜 北

(1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室,云南 大理 671000;2.大理大學(xué) 藥學(xué)院,云南 大理 671000; 3.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000)

0 引 言

慢性非細菌性前列腺炎(Chronic Non-bacterial Prostatitis,CNP)是前列腺炎綜合征中最常見的類型,被認為是50歲以下男性泌尿生殖系統(tǒng)疾病中的常見病、多發(fā)病[1],主要表現(xiàn)為下腹部、會陰部疼痛或盆腔不適,常常伴隨著尿頻、尿急、尿痛、尿路阻塞、性功能障礙、抑郁等癥狀[2-3].目前臨床上供選擇的藥物有非甾體類抗炎藥、α-腎上腺素能受體阻斷劑、抗生素類等;如并發(fā)有焦慮、抑郁等心理問題的CNP患者,可選擇服用抗焦慮或抗抑郁藥物[4-5].由于西藥在前列腺炎的治療上主要以緩解癥狀為目的,缺乏特異性,遠期療效并不理想,而中藥的多成分多靶點可在前列腺炎的保護與治療上發(fā)揮著重要作用,因此日益受到重視[6].

分心木(Diaphragma Juglandis Fructus,簡稱DJF)又名胡桃隔,為胡桃科胡桃屬植物核桃(JuglansregiaL.)果實內(nèi)的木質(zhì)中隔,是核桃產(chǎn)品加工過程中主要的副產(chǎn)物.云南大理為我國核桃主要產(chǎn)地,所屬漾濞縣因盛產(chǎn)著名的漾濞泡核桃而被譽為“中國核桃之鄉(xiāng)”,每年分心木產(chǎn)量巨大,但開發(fā)應(yīng)用十分有限,已不同程度地制約了核桃產(chǎn)業(yè)與社會經(jīng)濟的健康發(fā)展.根據(jù)傳統(tǒng)藥用記載,分心木具有固腎澀精的功效,主治遺精、滑精、遺尿、尿血、淋病、帶下等多種泌尿生殖系統(tǒng)疾病[7-8].據(jù)文獻報道,分心木中分離得到的部分化合物表現(xiàn)出顯著的抗炎效果[9-10],且本課題組前期實驗也發(fā)現(xiàn)分心木水提取物具有較好的抗炎活性.基于分心木固腎澀精的傳統(tǒng)藥用記載和現(xiàn)代抗炎作用研究,本課題擬用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對分心木治療CNP大鼠的作用及其機制進行研究,為進一步開發(fā)利用分心木藥材資源創(chuàng)造條件.

1 材料與儀器

1.1 細胞株及動物

巨噬細胞株RAW264.7,武漢普諾賽生命科技有限公司;SD大鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量180～220 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCKY(湘)2019-0004.動物實驗符合3R原則,且經(jīng)大理大學(xué)倫理委員會審核通過.

1.2 樣品及主要試劑

1.3 儀器

Varioskan LUX功能酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司;CFX96實時熒光定量PCR儀,美國BIO-RAD公司;N60核酸蛋白測定儀,美國IMPLEN公司;T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;Tissuelyser-L多樣品組織研磨儀,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;HC-301R高速冷凍離心機,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;0408-2型臺式低速離心機,上海醫(yī)療器械(集團)有限公司;MCO-18AIC CO2孵育箱,日本三洋電器公司;大鼠獨立通氣籠,蘇州市蘇杭科技器材有限公司.

2 方法

2.1 分心木供試樣品的制備

取干燥的分心木樣品,粉碎,加入適量蒸餾水(1∶6,w/v),100 ℃ 回流提取3次,趁熱過濾,合并濾液,濃縮凍干,得分心木水提取物(DJF-W).部分分心木水提取物以D101型大孔樹脂柱層析進行粗分劃段,依次用0、50%、100%甲醇-水洗脫,每次洗脫至樣品不再增加,分別得D101大孔樹脂水洗脫部位(D101-1)、50%甲醇洗脫部位(D101-2)、100%甲醇洗脫部位(D101-3)樣品.

2.2 分心木總黃酮、總多酚和總多糖的含量測定

總黃酮和總多糖含量測定參照中國藥典2020版中的方法進行[11],總黃酮以蘆丁為標準品,通過亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色進行測定;總多糖以無水葡萄糖為標準品,通過硫酸-蒽酮法進行測定.總多酚含量測定參照國家標準中的方法進行[12],以沒食子酸為標準品,采用福林酚試劑法進行測定.

2.3 LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7炎癥模型的建立

巨噬細胞RAW264.7混懸于含10%胎牛血清、1%鏈霉素和青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).取對數(shù)生長期細胞以5×104個/孔的密度接種到96孔板內(nèi),放入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗一遍,加入 100 μL 含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,正常組和模型組加入等體積的正常培養(yǎng)基,每組8個復(fù)孔.孵育 30 min 后,正常組(非LPS誘導(dǎo)組)加入 100 μL 正常培養(yǎng)基,模型組和實驗組加入 100 μL 含LPS(1 μg/mL)的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育 24 h 后,收集上清液測定一氧化氮(NO)含量.NO含量測定參照一氧化氮試劑盒說明書進行.

2.4 慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的建立

參照文獻[13-14]的方法建立CNP大鼠模型.30只雄性SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d,隨機分組,每組6只.具體實驗步驟如下:所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量:0.4 mL/100 g),麻醉,備皮,于下腹正中切口,棉簽輕輕挑起膀胱,暴露附于膀胱頸外側(cè)的前列腺,模型組和實驗組于前列腺雙側(cè)腹葉各注入 100 μL 的1%角叉菜膠生理鹽水溶液,假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水.隨后,逐層縫合腹壁肌肉皮膚,消毒,放回鼠籠,自由飲食.術(shù)后第 4 d,假手術(shù)組和模型組灌胃蒸餾水,陽性藥組灌胃前列康混懸液,分心木組灌胃分心木水提物,連續(xù)給藥 10 d.末次給藥后 1 h,稱量體重,麻醉,腹主動脈取血,室溫靜置 30 min,3 500 r/min 離心 15 min,取上清液于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆?同時剖取前列腺組織,在生理鹽水中剝離多余的脂肪和組織,吸干水分,稱重后,選取一部分組織做病理切片,另取一部分組織用組織研磨儀制成10%的組織勻漿,10 000 r/min 離心 10 min,取上清液于 -20 ℃ 保存?zhèn)溆?

2.5 相關(guān)指標檢測

1) 前列腺指數(shù)(PI):PI=前列腺濕重(g)/體重(g)×100%.

2) 前列腺組織病理切片:按照常規(guī)病理切片制作、染色步驟,將一部分前列腺組織在4%多聚甲醛固定液中固定至少 24 h,脫水,石蠟包埋,制片,H&E染色,鏡下觀察其病理組織學(xué)變化.

3) 按照試劑盒說明書步驟,采用Elisa法測定CNP大鼠血清中PSA、TNF-α、PGE2的含量;采用比色法測定前列腺組織中MDA的含量.

速生桉樹春、夏、秋三季都可以進行種植，但在春季雨后進行的種植成活率最高。因此，造林技術(shù)中選擇春季雨后種植應(yīng)更受到重視，在氣溫、土壤、空氣都滿足速生桉樹生長的最適宜條件下的種植能夠滿足速生桉樹的生長效益，也能夠提高其經(jīng)濟效益。

4) RT-PCR法測定前列腺組織中COX-2和Nrf2的mRNA表達水平,以GAPDH為內(nèi)控基因,用2-ΔΔCt方法計算相關(guān)基因表達量.引物序列如表1,由生工生物公司合成.

2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)單因素方差分析(One-Way ANOVE),比較組間差異,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 分心木水提物及各部位樣品總黃酮、總多酚和總多糖的含量測定

對分心木水提物及大孔樹脂各洗脫部位中的總黃酮、總多酚和總多糖進行含量測定,結(jié)果如表2所示,各部位成分含量差異顯著,其中大孔樹脂50%甲醇洗脫部位總黃酮、總多酚和總多糖含量均為最高,較分心木水提物各成分含量均有顯著的提高.

表2 分心木水提物及各部位幾種類型成分含量

3.2 分心木水提物及各部位對LPS誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7炎癥反應(yīng)的影響

分心木水提物及各部位對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7釋放的NO含量分析結(jié)果如表3所示,與正常組比較,LPS刺激之后,模型組的NO含量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,分心木水提物及各部位均能不同程度地降低NO的含量,但是僅分心木水提物差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).

表3 分心木水提物及各部位對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細胞RAW264.7釋放NO的影響

3.3 分心木水提物對CNP大鼠PI和PSA的影響

分心木水提物對CNP大鼠PI和PSA的影響結(jié)果如表4所示.與假手術(shù)組相比,模型組PI(P<0.05)和血清中PSA的水平(P<0.01)均顯著升高.與模型組比較,分心木水提物高、低劑量組均未能顯著降低CNP大鼠的PI水平;但是分心木水提物高劑量組(1 g/kg)能顯著降低CNP大鼠血清中PSA的水平(P<0.01).

表4 分心木水提物對CNP大鼠PI和PSA的影響

3.4 分心木水提物對CNP大鼠前列腺組織的病理學(xué)影響

分心木水提物對大鼠前列腺組織病理學(xué)影響如圖1所示.光學(xué)顯微鏡下觀察,假手術(shù)組大鼠前列腺組織腺泡形狀規(guī)則,呈單層立方或者柱狀排列,基底膜完整,未見明顯水腫及炎性細胞浸潤.模型組大鼠前列腺組織可見大量炎性細胞浸潤,前列腺明顯水腫、間質(zhì)疏松,腺泡形狀不規(guī)則,腺體上皮褶皺增加,部分基底膜被破壞.與模型組比較,分心木水提物高(1 g/kg)、低(0.5 g/kg)劑量組,均能不同程度地降低大鼠前列腺組織水腫及炎性細胞浸潤,減輕組織的炎癥反應(yīng),但療效均較前列康組略差.

(a)假手術(shù)組 (b)模型組 (c)前列康組

(d)分心木水提物高劑量組(1 g/kg) (e)分心木水提物低劑量組(0.5 g/kg)圖1 大鼠前列腺組織病理切片(×200,標尺:100 μm)Fig.1 Pathological section of rat prostate (×200,ruler:100 μm)

3.5 分心木水提物對CNP大鼠血清學(xué)指標(TNF-α、PGE2)的影響

對CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的含量進行測定,結(jié)果如表5所示.與假手術(shù)組比較,模型組大鼠中TNF-α、PGE2水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,前列康組、分心木水提物0.5、1 g/kg 組均能顯著降低CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的水平(P<0.01).

3.6 分心木水提物對CNP大鼠組織中MDA、Nrf2、COX-2的影響

對CNP大鼠前列腺組織中MDA的含量以及Nrf2、COX-2的基因表達水平進行測定,結(jié)果見表6.與假手術(shù)組比較,模型組大鼠前列腺組織中MDA和COX-2的水平均顯著上升(P<0.01),Nrf2的基因表達水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,前列康組、分心木水提物 0.5 g/kg 組能顯著降低組織中MDA的含量以及COX-2的基因表達水平(P<0.01),分心木水提物 1 g/kg 組能一定程度都升高Nrf2基因的表達水平,盡管統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P>0.05).

表5 分心木水提物對CNP大鼠血清學(xué)指標的影響

(a) Nrf2 mRNA的擴增曲線 (b) COX-2 mRNA的擴增曲線 (c) GAPDH mRNA的擴增曲線

(d) Nrf2熔解曲線 (e) COX-2熔解曲線 (f) GAPDH熔解曲線圖2 CNP大鼠前列腺組織中Nrf2、COX-2和GAPDH mRNA的擴增曲線及熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting curve of Nrf2,COX-2 and GAPDH mRNA in prostate tissue of CNP rats

表6 分心木水提物對CNP大鼠組織中MDA、Nrf2、COX-2的影響其中mRNA n=3)

續(xù)表6

4 討 論

分心木水提物通過D101型大孔樹脂柱層析進行粗分劃段后,對幾類成分進行含量測定,結(jié)果顯示,分心木水提物及各部位之間所含的成分類別以及含量存在明顯差異.通過LPS誘導(dǎo)建立巨噬細胞RAW264.7炎癥模型,檢測分心木水提物及各部位的抗炎活性,實驗結(jié)果顯示,只有分心木水提物能夠顯著性降低NO的含量,說明水提物抗炎效果優(yōu)于其他三個洗脫部位.然而,由于50%甲醇部位總黃酮、總多酚和總多糖含量最高,但并未顯示最好的降低NO活性,因此,分心木抗炎活性應(yīng)該還與所含有的其他類型成分有密切關(guān)系,其治療作用應(yīng)是多成分協(xié)同作用的結(jié)果,這些結(jié)果也在一定程度上驗證了民間分心木泡水服用的合理性.為此后續(xù)體內(nèi)實驗,僅選擇分心木水提物作為研究對象.

本研究以PI和PSA兩個指標的升高作為CNP模型建立成功的標準[13-14].前列腺炎會引起前列腺的組織水腫,PI升高.PSA是由前列腺腺泡及導(dǎo)管分泌的一種絲氨酸蛋白酶,直接分泌到前列腺導(dǎo)管內(nèi),正常情況下前列腺與周圍有屏障隔離,所以僅有微量的PSA進入血液循環(huán),但當前列腺出現(xiàn)炎癥或增生等病變時,就會引起PSA在血液中不同程度的升高,血清PSA水平與炎癥的嚴重程度、前列腺體積密切相關(guān)[15].根據(jù)實驗結(jié)果可以看出,分心木水提物能顯著降低CNP大鼠血清中PSA的水平,表明分心木水提物對CNP大鼠的炎癥有一定的緩解作用.

慢性前列腺炎的發(fā)病機制主要涉及病原體感染、氧化應(yīng)激以及細胞因子與機體自身免疫等因素[16-17].CNP的發(fā)生發(fā)展涉及到多種炎癥因子,TNF-α是機體受到損傷時由巨噬細胞產(chǎn)生的促炎因子,可加速多種炎癥因子的聚集和釋放,并且能促進巨噬細胞釋放前列腺素、白三烯等炎癥介質(zhì)加重局部炎癥[18-19].本實驗結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠血清中TNF-α水平明顯升高,當用不同劑量的分心木提取物進行治療干預(yù)后,血清中的TNF-α水平降低,表明其具有抑制炎癥因子釋放的作用.

花生四烯酸代謝途徑是重要的炎癥通路,炎癥發(fā)生時,COX-2的表達升高,導(dǎo)致PGE2的合成增加,引起局部疼痛和血管擴張,促進炎性反應(yīng)[20-21].同時,PGE2的上升能夠誘導(dǎo)線粒體的損傷,促進氧自由基對上皮細胞造成損傷[22-23].實驗結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠血清中PGE2水平和組織中COX-2的基因表達水平明顯升高,當用不同劑量的分心木水提物進行干預(yù)后,血清中的PGE2含量和組織中COX-2的基因表達水平降低,說明其抗炎作用可能與COX-2/PGE2通路有關(guān).

氧化應(yīng)激也是CNP發(fā)展的重要機制,氧化應(yīng)激反應(yīng)是繼發(fā)于炎癥反應(yīng)之后的前列腺組織損傷[24],氧自由基過度產(chǎn)生會導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化,而MDA為膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物[13].Nrf2作為細胞對抗內(nèi)外源性物質(zhì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子,能特異性的結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)序列,調(diào)控ARE依賴的下游基因,Nrf2/ARE作為最重要的抗氧化信號通路之一參與機體的自我保護[25-26].實驗結(jié)果顯示,CNP模型組大鼠前列腺組織中Nrf2的基因表達水平明顯降低,MDA的含量明顯升高,當給分心木水提物進行干預(yù)之后,能增加Nrf2的基因表達水平,減少前列腺組織中MDA的含量,表明分心木水提物對CNP的治療作用可能與激活Nrf2介導(dǎo)的ARE通路有關(guān).

5 結(jié) 論

分心木可能以多成分協(xié)同作用的方式、通過抑制炎癥因子的釋放和抗氧化對CNP大鼠起到治療作用,其機制應(yīng)該與COX-2/PGE2及Nrf2兩條信號通路有關(guān).本研究結(jié)果也驗證了分心木在民間用于泌尿生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的合理性,為分心木后續(xù)在泌尿生殖系統(tǒng)保健方面的開發(fā)利用提供實驗依據(jù).